专利名称：用作兴奋型氨基酸神经传导递质拮抗剂的聚胺类化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及某些发现于棚蛛属aperta蜘蛛毒液中的聚胺类化合物。这类聚胺及其药物上可以接受的盐是兴奋型氨基酸神经传导递质拮抗剂，该传导递质作用于各种生物(包括无脊椎和脊椎类)神经细胞在内的细胞。本发明还涉及这类聚胺及其盐在拮抗兴奋型氨基酸神经传导递质中的应用(所述传导递质作用于诸如生物体神经系统细胞之类的细胞)，以及用于治疗哺乳动物中由兴奋型氨基酸神经传导递质诱发的疾病和症状，防治无脊椎类害虫，还涉及包括所述聚胺及其盐的组合物。
文献中报道了棚蛛属aperta蜘蛛毒液中至少含有两种作用于钙流的有毒物质。参见Jackson，H.，et al.，Soc.Neu.Sci，Abstr.12∶1078(1987)。这些作者公开了一种在该本文称之为AG2的毒物，其分子量低于1000道尔顿，它似乎在许多组织中抑制钙流。另有(Further，Jackson，H.，et al.，Soc.Neu.Sci.Abstr.12∶730(1986))报道了来自棚蛛属aperta蜘蛛的另一种毒物，该成分的分子量约为6000道尔顿。据报道该毒物影响传递过程中突触前阻断，并推测该毒物阻断与释放神经传导递质有关的钙通道。1989年4月28日提交的并转让给受让人的申请号为07/346，181的美国专利申请书中公开了发现于棚蛛属aperta蜘蛛毒液中的某些聚胺类化合物。在该申请中公开的那些聚胺是作为细胞兴奋型氨基酸受体的阻断剂，在该申请中还公开了一种称之为B1的上述聚胺作为细胞钙通道阻断剂。该申请中公开的聚胺如下所述
和AGEL 504它是具有如下鉴别特征的化合物(a)存在于按如下方式洗脱棚蛛属aperta蜘蛛毒液粗品所得的级份中c-18 Vydac 22m×250mm，孔径为300 ，粒度为10μ的柱，流速为15ml/分，采用如下线性梯度程度的溶剂系统5%→20%B，95%→80%A〔0→30分钟。〕，然后，20%→70%B，80%→30%A〔30→55分钟。〕，其中A是0.1%TFA水溶液，B是乙腈，滞留时间大约为22.75分钟;
(b)存在于上述(a)洗脱级份经如下方式再洗脱的级份中c-18 Vydac 22mm×250mm，300 孔径，10μ粒径的柱，流速为15ml/min.，溶剂系统非线性梯度程序0%→0%B，100%→100%A〔0-5分钟.〕，然后0%→10%B，100%→90%A〔5-20分钟〕(Waters曲线1)，然后10%→20%B，90%→80%A〔20→30分钟〕(Waters曲线6)，然后20%→50%B，80%→50%A〔30→40分钟〕(Waters曲线11)，其中A是0.1%TFA的水溶液，B是乙腈，滞留时间约为21.5分钟;和(c)FAB MS高分辨505.3861，经计算为C27H48N6O3。
兴奋型氨基酸神经传导递质拮抗剂化合物具有多种用途。兴奋型氨基酸神经传导递质拮抗剂在临床上可用于治疗下述疾病例如，中风、脑缺血、神经退化性疾病，例如，阿耳茨海默氏病和癫痫，尤其可用作精神治疗剂。参见Excitatory Amino Acids in Health and Disease，D.Lodge，Ed.，John Wiley and Sons Ltd.，New York.NY 1988，该文引为本发明的对比文献。此外，这类化合物还可用于研究细胞(如神经细胞)生理，并用于防治无脊椎类害虫。
本发明涉及某些存在于棚蛛属aperta蜘蛛毒液中的聚胺类化合物。本发明的聚胺如下所述
本发明所述聚胺类化合物及其药物上可以接受的盐是作用于细胞的兴奋型氨基酸神经传导递质拮抗剂。因此，所述聚胺类化合物可用于拮抗这类兴奋型氨基酸神经传导递质本身。本发明的聚胺类也可用于防治无脊椎害虫，用于治疗人类由兴奋型氨基酸神经传导递质诱发的疾病。所述聚胺还可用于人类精神病治疗剂。
本发明还涉及包括所述聚胺的组合物和服用所述聚胺的方法。
按照本领域技术人员所熟知的标准方法，即电刺激挤出法，从棚蛛属aperta蜘蛛制得毒液。所采用的优选方法应保护整个毒液不受腹腔反流或血淋巴的污染。这类方法对本领域技术人员而言是已知的。直到按下述方法纯化前，由此所得的全部毒液应保持在-78℃左右的冷冻状态。
在下述制备或半制备柱上，通过反相高效液相层析(HPLC)纯化整个毒液中的各种成分。所述柱包括C-4和C-18 Vydac 柱(Rainin Instrument Co.Inc.，Mack Road.Woburn Massachusetts 01801)，C-18 Baker柱(J.T.Baker Inc.，22Red School Lane，Phillipsburg，NJ08865)和Dynamax Phenyl柱(Rainin Instrument Co.Inc.，Mack Road.Woburn Massachusetts 01801)。在220-230nm处采用单色法进行峰检测。例如，采用Waters 990二级管列阵检测器(diode array detector)(Millipore Corporation，Waters Chromatography Division，34 Maple Street，Milford，Massachusetts 01757)收集多色UV数据，可以对各级份做进一步分析。采用已知方法，例如，使用ISCO/“FOXY”级份收集器和ISCO 2159峰检测器(ISCO，4700 Superior，Lincoln，Nebraska 68504)收集来自柱的各级份。将各级份收集在适宜大小的容器中，例如，无菌聚乙烯实验室制品。然后采用冻干法将来自洗脱液的各级份浓缩，最后冻干除水。然后可以采用下述方法测定所得各构成级份的纯度即，利用梯度系统采用分析柱进行色谱分析，与各级份最后纯化中所使用的系统相比，上述梯度系统是更强的恒溶剂。
按照已知的分析方法，例如，质谱法和核磁共振法测定各级份中所包含的结构。
就实施本发明及使用前文概述的通法而言，现已发现适用于初分洗脱毒液的柱子是C-18 Vydac 22mm×250mm，孔径为300 ，柱粒径为10μ。采用15ml/分的流速洗脱该柱，并采用下述线性梯度程序100%→80%A，0%→20%B〔0→30分钟〕，其中A是0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液，B是乙腈。按前述方法收集各级份。选出由此所得的六个级份，在本文中分别标为1，2，3，4，5和6，以供进一步分析和/或纯化之用。用于分离整个毒液的另一方法包括C-18 Baker柱(4.6mm×250mm，孔径100 ，粒径为5μ)，按1ml/分的流速，采用8%B，92%A(A和B如前述)的恒溶条件洗脱该柱。但是，就本发明的目的而言，优选采用C-18 Vydac 柱和前文所述程序进行整个毒液的初分离。
经分析发现级份1，2和3含有美国专利申请Serial No.07/346，181所描述的聚胺，它们不属于本发明。采用不同的柱和条件进一步纯化级份4，5和6。下文实施例2，3和4中给出了各粗分物的具体特征及其结果。
如下文实施例所述，级份AGEL 416.AGEL 464.AGEL 489(A)和AGEL 521所包括的聚胺类化合物结构如下AGEL 416
下文所示反应路线A至C示出了生产下式本发明聚胺的合成路线
<p>反应路线A.
反应路线B
反应路线C
按照反应路线A，从丁二胺开始，按各步顺序反应，制得式Ⅳ聚胺中间体。在实施例5A至G部分，给出了适用于按反应路线A制备式Ⅷ中间体的反应条件。反应路线B解释了制备式Ⅸ中间体的方法。在实施例5的H部分给出了适用于按反应路线B制备该中间体的反应条件。反应路线C示出了式Ⅻ所示本发明聚胺化合物的制备方法。在实施例5的I至K部分绐出了适用于将式Ⅷ与式Ⅸ中间体化合物偶合、然后制备式Ⅻ化合物的反应条件。
本发明聚胺可逆性地拮抗作用于细胞的兴奋型氨基酸神经传导递质，所述细胞包括各种生物(包括无脊椎和脊椎类)神经系统中的细胞。贯穿本文所采用的术语“脊椎类”意指包括哺乳类动物、“无脊椎类”包括例如，昆虫，外寄生虫和内寄生虫。
按照下述方法，根据它们在新生大鼠小脑中阻断N-甲基-D-天冬氨酸诱发(NMDA)的cGMP上升的能力，可以证实本发明聚胺类化合物拮抗兴奋型氨基酸神经传导递质的能力。所述方法是从10只出生8-14天的Wistar大鼠中迅速切除小脑，并将其置于PH为7.4的温度为4℃的Krebs/碳酸氢盐缓冲液中，然后用McIIwain组织切片机(The Nickle Laboratory Engineering Co.，Gomshall，Surrey，England)将其切割成0.5mm×0.5mm的小块。将所得脑组织碎片移至100ml，37℃、用95∶5 O2/CO2不断平衡的Krebs/碳酸氢盐缓冲液中。以这种方式将脑组织碎片保温90分钟，并将缓冲液更换3次。然后倾出缓冲液，将该组织离心(1分钟.，3200r.p.m)，继之混悬于20ml Krebs/碳酸氢盐缓冲液中。接着以250μl的等份(约2mg)移出，放入1.5ml的微型离心管中。在这些管中加入10μl受试化合物储液，然后加入10μl.2.5mM NMDA溶液使反应开始。最终NMDA浓度是100μM。对照组不加NMDA。在振荡水浴中，于37℃将这些管保温一分钟，然后加入750μl 50mM Tris-Cl，5mM EDTA溶液使反应停止。立即将这些管放入沸水浴中持续5分钟。然后采用探管近程声电定位器(proke sonicator)将功率水平设置在3，将每只管中的组份用声波处理15秒。取出10微升，按Lowry，Anal.Biochem.100∶201-220(1979)所述方法测定蛋白。然后将这些管离心(5分钟、10000xg)，移出100μl上清液，采用New England Nuclear(Boston，Massachusetts)cGMP测定仪，按厂商提供的方法，测定环化GMP(cGMP)水平。所得数据是每毫克蛋白产生cGMP的皮摩尔数。
此外，按照下述方法，根据本发明聚胺类化合物通过阻断裂解小脑粒细胞的NMDA/甘氨酸，从而使胞液中游离〔Ca+2〕i增加的能力来证实其对兴奋型氨基酸神经传导递质的拮抗能力。所述方法是从出生8天大鼠的小脑中制备小脑粒细胞(Wilkin，G.P.et al.，Brain Res∶115∶181-199，1976)。用聚-L-赖氨酸涂布聚三氟氯乙烯小块(1cm2)(Proplastics Inc.，5033 Industrial Ave.，Wall，N.J.，07719)，然后置于含有1ml Eagles Basal培养基的12孔培养皿中。将细胞打散，将含有6.25×106细胞的等份加到每个含有聚三氟氯乙烯块的孔中。接种后24小时加入胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷(终浓度为10μM)。将第6、7和8天的培养物作细胞fura2分析。将细胞(连接于聚三氟氯乙烯块)移至含有(1ml)于HEPES缓冲液中的2μM fura2/AM(Molecular Probes Inc.，Eugene，OR，97402)的12孔培养皿中，所述缓冲液含有0.1%小牛血清白蛋白，0.1%右旋糖，pH＝7.4，无镁离子。将该细胞在37℃保温40分钟;移出含fura2/AM的缓冲液，用1ml不含fura2/AM的相同缓冲液代替之。将2.0ml预温(37℃)过的缓冲液加到一石英杯中。将连接在聚三氟氯乙烯上的细胞放入杯中，将该杯插入装有磁力搅拌器的恒温(37℃)箱中，用荧光分光光度计(Biomedical IustrumentGroup，University of Pennsylvania)测定荧光。使荧光信号稳定约2分钟。通过加入50μM NMDA和1μM的甘氨酸可使胞液游离钙增加，(以荧光增强表示)。将5-20μl受试化合物储液置磷酸缓冲液(PBS，pH7.4)中，以适宜浓度加入杯中。采用Grynkiewicz.G.等(J.Biol.Chem.260∶3440(1985))建立的方法标定荧光信号及fura2/AM溢出校正。在完成各步试验后，加入伊屋诺霉素(35μM)测定最大荧光值(Fmax)，继之加入EGTA(12mM)将钙螯合，测定最小荧荧光值(Fmin)。采用前述程序时，根据加入题目化合物所出现的荧光降低，即表示该化合物拮抗兴奋型氨基酸神经传导递质的能力。
本发明的聚胺本身就可用于拮抗兴奋型氨基酸神经传导递质。因此，也可将这类聚胺用于防治无脊椎害虫，以及用于治疗哺乳动物类兴奋型氨基酸神经传导递质诱发的疾病和症状，例如，中风，脑缺血，神经退化病(如Alzheimer氏病)和癫痫。所述聚胺还可用作哺乳类动物的精神病治疗剂。此外，该聚胺还可用于研究包括(但不限于)神经细胞在内的细胞生理。
本发明聚胺的药物上可以接受的盐也属于本发明的范畴。采用本技术领域普通技术人员熟知的方法即可制得这些盐。例如，采用常规方法可以制得聚胺的酸成盐。该聚胺的酸成盐优选例如盐酸盐，三氟乙酸盐。特别优选者是盐酸盐。
当将本发明聚胺或其药物上可以接受的盐施用于哺乳动物时，即可单独服用，也可按规范制药方法以药用组合物的形式与药物上可接受的载体或稀释剂配伍使用。该类聚胺或其药物上可以接受的盐既可口服也可胃肠道外给药。胃肠道外给药包括静脉、肌内、腹膜内、皮下及外用给药。
口服使用本发明聚胺或其药物上可接受的盐时，可以下列剂型服用该化合物，例如，片剂或胶囊剂，或者是水溶液或混悬液。就口服片剂而言，通常加入惯用的载体，其中包括乳糖、玉米淀粉，以及润滑剂，例如，硬脂酸镁。就用于口服的胶囊剂而言，有用的稀释剂是乳糖和干燥玉米淀粉。在将含水混悬液用于口服时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂混合。如有必要，还可加入某些甜味剂和/或香味剂。
就肌内、腹膜内、皮下及静脉给药而言，通常配制成活性成分的无菌溶液，并应适当地调整该溶液的pH并制成缓冲液。在用于静脉注射时，应控制所有溶质的总浓度以制成等渗制剂。
在将本发明聚胺或其盐用于人类时，一般临床医生即可确定其日剂量。但是，本发明聚胺适宜的剂量范围是约3至30mg/kg/天。另外，该剂量可根据下述因素而变患者本身的年龄、体重和反应、以及患者症状的严重程度和所服用具体化合物的效力。因此，也可超出上述给定的剂量范围，并且这也属于本发明的范畴。
在将本发明聚胺或其盐用于防治无脊椎害虫时，将所述化合物直接施用于所说无脊椎害虫，或施于所说无脊椎害虫的生活环境。例如，将本发明化合物的溶液喷洒于所说无脊椎害虫。控制所说无脊椎害虫所需化合物的量随害虫及其生存环境而异，并且也可由施用该化合物的人员决定。
在将本发明聚胺或其盐用于研究细胞生理时，可根据本领域普通技术人员熟知的方法将所述化合物施用于细胞。例如，以适宜的生理缓冲液将所述化合物施用于细胞。用于这类研究中的本发明化合物的适宜浓度是100μM。但是，在这类研究中，所述化合物的浓度可以高于或低于100μM。按照众所周知的方法，本领域普通技术人员可以确定施用化合物的量。
实施例1.棚蛛属aperta蜘蛛全毒液的初分离将棚蛛属aperta蜘蛛全毒液(得自Natural Produet.Sciences.Inc.，Salt Lake City，Utah 84108，并在-78℃冷冻贮存)解冻，并将其从10-60μl稀释至200μl，载于C-18 Vydac (22mm×250mm，孔径300 ，粒径10μ)柱，以15ml/min的流速洗脱，采用下述线性梯度程序0%→20%B，100%→80%A〔0→30分钟〕，其中，A是0.1%三氟乙酸(TFA)水溶液，B是乙腈。在220nm处进行单色峰检测，采用ISCO/“FOXY”级份收集器及ISCO 2159峰检器收集级份。收集0至30分钟的级份。根据峰检测，特别收集了如下级份级份 洗脱时间1 约13.8分钟2 约19.25分钟3 约21.0分钟4 约22.3分钟5 约23.1分钟6 约26.0分钟采用相同的柱及前述条件对级份1作了再分离，不同之处是使用了Waters 990二极管阵列检测器，结果发现级份1含有聚胺AGEL 452。在共同未决的申请号为07/346，181的美国专利申请书中介绍了该聚胺，它并不构成本发明的部分。按照再分离级份1的方法对级份2再分离。结果发现级份2含有聚胺AGEL 448和AGEL 468，在上述美国专利申请书(序号为07/346，181)中对两者均作了介绍。这两个聚胺均不构成本发明的任何部分。此外，采用C-4 Vydac (22mm×250mm，孔径300 ，粒径10μ)柱，对级份3进行了再分离，所采用的线性梯度为5%→10%B，95%→90%A〔0→30分钟〕，其中，A和B如前所述，并且还采用了Waters 990二极管阵列检测器。现已发现级份2含有序号为07/346，181的美国专利申请书所介绍的聚胺504和505，这并不构成本申请的部分。
实施例2.对级份4的再分离并确定其中的结构将按实施例1所得的级份4载于C-18 Baker(4.6mm×250mm，孔径300 ，粒度5μ)柱，以1ml/分的流速洗脱，并采用8%B，92%A的恒溶条件，其中A和B如实施例2所述。采用Waters 990二极管阵列峰检器(λ＝220nm)进行峰检测，按实施例1所述收集级份。在大约19.50分洗脱出再分离级份，在此，称之为AGEL 521。按照标准方法，通过冻干除去洗脱剂，然后再冻干除水来制备供光谱分析用的级份AGEL 521。将冻干的级份AGEL 521化合物充氩下于大约-80℃保存，直到使用。
然后，采用FAB MS测定级份AGEL 521所含化合物的结构。所得数据及由此推论出的结构如下AGEL 521FAB MS(高分辨)观察到(M+H)M/Z＝522.3774，经计算为分子式C26H48N7O4(要求值522.3768)。
结构1H-吲哚-3-乙酰胺-N-(20-氨基-4，8-二羟基-4，8，12，17-四氮杂二十烷-1-基)
实施例3.级份5的再分离并测定其结构将按实施例1所得级份5载于Dynamax Phenyl柱(4.6mm×250mm，孔径60 ，粒径8μ)，以1ml/分的流速进行洗脱，采用10%B，90%A的恒溶条件，其中A和B如实施例1所述。按实施例2所述方法进行峰检测并收集级份。如下所述得到本文称之为AGEL 464和416的级份级份 洗脱时间AGEL416 约26.47分钟AGEL464 约37.76分钟按实施例2所述方法制备并贮存供光谱分析用的级份AGEL 416和AGEL 464。
采用FAB MS测定级份416所含化合物的结构，结果如下FAB MS(高分辨)观察到(M+H)M/Z＝417.3336，经计算为C23H41N6O4(要求值417.3342)结构1H-吲哚-3-乙酰胺-N-(16-氨基-4，8，13-三氮杂十六烷-1-基)
采用FAB MS测定了级份AGEL 464所含化合物的结构，结果如下FAB MB(高分辨)观察到(M+H)M/Z＝465.3173，经计算为C23H41U6O4(要求值465.3189)结构1H-吲哚-3-乙酰胺-N-(16-氨基-4，8-二羟基-4，8，13-三氮杂十六烷-1-基)
实施例4.将级份6再分离并测定其结构将按实施例1制得的级份6按实施例3方法载于Dynamax Phenyl柱，并洗脱。按实施例2所述方法进行峰检测并收集级份。如下所示制得本文称之为AGEL 489(A)和AGEL 489的级份
级份 洗脱时间AGEL 489 约41.95分钟AGEL 489(A) 约55.27分钟按实施例2所述方法制备并贮存供光谱分析用的级份AGEL 489(A)和AGEL 489。
采用FAB MB测定了级份AGEL 489(A)所含化合物的结构，结果如下FAB MS(高分辨)观察到(M+H)M/Z＝489.3896，经计算为C27H49N6O2(要求值489.3917)。
结构1H-吲哚-3-乙酰胺-N-(18-氨基-13，13-二甲基-4-羟基-4，8，13-三氮杂十八烷-1-基)。
采用FAB MS测定了级份AGEL 489所含化合物的结构，发现它是申请号为07/346，181的美国专利申请所述化合物AGEL 489。后者并不构成本发明的部分。
实施例5.1H-吲哚-3-乙酰胺-N-(16-氨基-4，8，13-三氮杂十六烷-1-基)。
按下述方法合成了题目化合物，经确定为是实施例3所述级份AGEL 416所含的化合物
按Yamamoto，Hisashi，(J.Am.Chem.Soc.103∶6133-6136(1981))公开的方法，由丁二胺和丙烯腈制得了式Ⅰ化合物。
在氮气下，将5.78g(0.041mole)式Ⅰ化合物(按前述A部分制得)加到75ml CH3CN和11.48g KF-硅藻土中，并搅拌之。搅拌下，将溶于25ml CH3CN中的9.75g(0.041mole)式Ⅱ化合物(按制备A所述方法制得)加到前述混合物中。将该反应物加热回流6小时，然后冷却至室温，放置过夜。然后滤除KF-硅藻土，用CH3CN充分洗涤滤饼，将滤液减压浓缩，得到14g粗油产物。将该粗产物在400g硅胶上进行层析，依次采用下述溶剂洗脱500ml二氯甲烷，然后1升85∶15 CH2Cl2/MeOH;继之1升75∶25 CH2Cl2/MeOH;加有25ml异丙胺的1升75∶25 CH2Cl2/MeOH;加有50ml异丙胺的1升75∶25 CH2Cl2/MeOH;最后是加有75ml异丙胺的400ml 75∶25 CH2Cl2/MeOH。采用薄层层析监测级份，经NMR确认含有所期产物的级份，收集、减压浓缩，得到4.7g前述式Ⅲ产物。
在氮气条件下，将4.7g(15.8mmoles)式Ⅲ化合物(按前文B部分制备)溶解在150ml二氯甲烷中，然后加入7.56g(34.7mmoles)二叔丁基二碳酸酯，将该反应混合物在室温下搅拌过夜，然后将该反应混合物减压浓缩，在400g硅胶上进行层析，采用50∶50乙酸乙酯/己烷洗脱，采用TLC(50∶50乙酸乙酯/己烷)监测级份，合并含有式Ⅳ产物的级份，减压浓缩，得到7.9g油状产物。
在氮气条件下，将7.85g(15.8mmoles)式Ⅳ化合物(按前文C部分制备)及6.5g Pd(OH2)/炭加到125ml乙酸中。在50p.s.i下将该混合物氢化2小时。滤除催化剂，用乙酸充分洗涤滤饼，将滤液浓缩，移至250ml二氯甲烷中，用100ml 1N NaOH洗涤两次，用K2CO3干燥。将该溶液过滤，将滤液减压浓缩，得到7.8g式Ⅴ化合物。
在氮气条件下，将7.15g(14.2mmoles)式Ⅴ化合物(按前述D部分制备)溶于150ml甲醇中，然后加入1.03ml(15.6mmoles)丙烯腈，将该反应物在室温下搅拌72小时，然后减压浓缩，加入二氯甲烷反复浓缩3次，汽提除去溶剂后，得到7.65g油状式Ⅵ产物。
在氮气氛下，将6.45g(11.6mmoles)式Ⅵ化合物(按前述E部分制备)溶于125ml二氯甲烷中，在该溶液中加入2.6g(12mmoles)二叔丁基二碳酸酯，并将该反应物在室温下搅拌过夜。然后将该反应混合物浓缩，在400g硅胶上进行层析，采用50∶50乙酸乙酯/己烷洗脱。将产物级份合并，浓缩，得到6.6g油状式Ⅷ产物。
在氮气氛下，将6.6g(10.1mmoles)式Ⅶ化合物(按前述F部分制备及6g pd(OH)2/炭加到150ml乙酸中。在50p.s.i下将该混合物氢化2小时，滤除催化剂，用乙酸反复洗涤滤饼，将滤液浓缩，移入200ml二氯甲烷中，用100ml 1N NaOH洗涤两次，将滤液减压浓缩，得到6.5g式Ⅷ产物。
在氮气氛下，将1.75g(10mmoles)吲哚乙酸，1.15g(10mmoles)N-羟基琥珀酰亚胺，2.06g(10mmoles)二环己基碳化二亚胺加到75ml四氢呋喃中。在室温下搅拌该反应混合物，大约5分钟后出现沉淀。大约1.5小时后，滤除沉淀，用75ml四氢呋喃洗涤滤饼，将该滤饼空气干燥(1.84g)。合并滤液，浓缩，移至乙酸乙酯中，过滤，用乙酸乙酯洗涤滤饼。浓缩滤液，得到一泡沫状物，将该泡沫状物在75ml乙酸乙酯中研制，得到一硬质凝胶。然后加入约30ml乙酸乙酯，继之加入乙醚。过滤分离固体，用乙醚洗涤，在氮气中干燥，得到1.74g式Ⅸ产物。用石油醚处理母液还可得到0.47g产物。
在氮气氛下，将0.33g(5mmoles)式Ⅷ化合物(按前述G部分制备)在搅拌下溶于10ml二氯甲烷中，然后加入0.136g(5mmoles)式Ⅸ化合物(按前述H部分制备)。将该反应物在室温下搅拌过夜。用二氯甲烷将该反应混合物稀释至35ml，用10ml 0.5N NaOH洗涤，用K2CO3干燥，浓缩。该浓缩物经硅胶层析，用4∶1乙酸乙酯/己烷洗脱。将产物级份浓缩，得到0.37g含有式Ⅹ产物及少量乙酸乙酯的白色泡沫状物体。
在氮气氛下，将0.37g(0.45mmoles)式Ⅹ化合物(按前述Ⅰ部分制备)溶于10ml二氯甲烷中，然后加入0.218g(1mmole)二叔丁基二碳酸酯，继之加入12ml(0.1mmole)4-(N，N-二甲基氨基)吡啶。将该反应物在室温下反应1小时，然后静置过夜。该反应混合物经硅胶层析，用4∶1乙酸乙酯/己烷洗脱，浓缩产物级份，得到0.32g白色泡沫状式Ⅺ产物。
在氮气氛下，将0.32g(0.35mmoles)式Ⅺ化合物(按前述J部分制备)加到15ml三氟乙酸中，搅拌15分钟，然后将该反应混合物减压浓缩，用乙醚研制，得到0.30g白色粉末状产物。
制备A.
在氮气氛下，将34.5g(157.6mmoles)3-溴丙胺·HBr置于600mlN，N-二甲基甲酰胺中，搅拌，在该溶液中加入34.4g(157.6mmoles)二叔丁基二碳酸酯，然后加入32.3ml(236mmoles)三乙胺。立即出现沉淀。将该反应物搅拌过夜，然后用乙酸乙酯将该反应物稀释至1.5升，用500ml 1NHCl洗涤1次，用500ml水洗涤3次，再用盐水洗涤1次，最后用Na2SO4干燥。经浓缩后，将产物在800g硅胶上进行层析，用4∶1己烷/乙酸乙酯洗脱，采用TLC(KMNO4/I2)监测级份，合并含产物的级份，减压浓缩，用50ml二氯甲烷共蒸馏2次，高真空蒸馏纯化，得到25.8g本制备的产物。
权利要求
1.一种制备基本纯净的选自下述化合物及其药学上可以接受的盐的方法
式中各R相同，并代表H或OH，该方法的特征在于(a)如果期望得到下式化合物
将棚蛛属蜘蛛(Agelenopsisaperta)的全毒液载于C-18Vydac 柱(22mm×250mm，300 孔径，粒径为10μ)，采用15毫升/分的流速进行洗脱，采用下述线性梯度程序溶剂系统0%→20%乙腈、100%→80%0.1%三氟乙酸水溶液，在220nm处进行单色谱峰检测，收集在大约26.0分钟时洗脱出的级份，如果采用DynamaxPheny1柱(4.6mm×250mm，60 孔径，粒径为8μ)，以1毫升/分的流速洗脱，采用10%乙腈和90%0.1%三氟乙酸恒溶条件，在220nm处进行峰检测，则收集在大约55.27分钟洗脱出的级份，任意地冻干，再混悬于水中，冻干除去水；(b)如果制备下式化合物
将棚蛛属蜘蛛(Agelenopsis aperta)全毒液载于C-18 Vydac 柱(22mm×250mm，孔径300 ，粒径10μ)，采用15毫升/分的流速洗脱，采用下述线性梯度程序溶剂系统0%→20%乙腈、100%→80% 0.1%三氟乙酸水溶液，在220nm进行单色谱峰检测，收集大约22.3分钟洗脱出的级份;如果采用C-18Baker柱(4.6mm×250mm，孔径300 ，粒径5μ)，则以1毫升/分的流速进行洗脱，采用8%乙腈和92% 0.1%三氟乙酸水溶液的恒溶条件，在220nm处进行峰检测，收集大约19.5分钟洗脱出的级份;任意地冻干，再混悬于水中，冻干除去水; (c)如果制备下式化合物
式中各R是羟基，将棚蛛属蜘蛛(Agelenopsis aperta)全毒液载于C-18 Vydac 柱(22mm×250mm，孔径300 ，粒径10μ)，采用15毫升/分的流速洗脱，采用下述线性梯度程序溶剂系统0%→20%乙腈，100%→80% 0.1%三氟乙酸水溶液，在220nm进行单色谱峰检测，收集大约23.1分钟洗脱出的级份;如果采用Dynamax Phenyl柱(4.6mm×250mm，孔径60 ，粒径8μ)，则以1毫升/分的流速进行洗脱，采用10%乙腈和90% 0.1%三氟乙酸水溶液的恒溶条件，在220nm处进行峰检测，收集大约37.76分钟洗脱出的级份;任意地冻干，再混悬于水中，冻干除去水; (d)如果制备下式化合物
式中各R是H将棚蛛属蜘蛛(Agelenorsis aperta)全毒液载于C-18Vydac
柱(22mm×250mm，孔径300
，粒径10μ)，采用15毫升/分的流速洗脱，采用下述线性梯度程序溶剂系统0%→20%乙腈，100%→80% 0.1%三氟乙酸水溶液，在220nm进行单色谱峰检测，收集大约23.1分钟洗脱出的级份;如果采用Dynamax Phenyl柱(4.6mm×250mm，孔径60
，粒径8μ)，则以1毫升/分的流速进行洗脱，采用10%乙腈和90% 0.1%三氟乙酸水溶液的恒溶条件，在220nm处进行峰检测，收集大约26.47分钟洗脱出的级份;任意地冻干，再混悬于水中，冻干除去水;或者，另一方法是在反应惰性溶剂中，在惰性气氛下，下式(Ⅸ)化合物与式(Ⅷ)化合物反应，
使其产物在惰性气氛下与二叔丁基二碳酸酯反应，然后与4-(N，N-二甲基氨基)吡啶反应，并使其产物在惰性气氛中与三氟乙酸反应;任意地采用众所周知的已知方法，将所述化合物转化为药物上可以接受的盐。
全文摘要
本发明涉及某些发现于棚蛛属aperta蜘蛛毒液中的聚胺类化合物。这类聚胺及其盐拮抗兴奋型氨基酸神经传导递质，该传导递质作用于各种生物的细胞，并可用于拮抗兴奋型氨基酸神经传导递质本身，以及用于治疗由兴奋型氨基酸神经传导递质诱发的疾病和症状，防治无脊椎类害虫，还涉及包括所述聚胺及其盐的组分物。
文档编号A61P25/00GK1053059SQ90110248
公开日1991年7月17日 申请日期1990年12月31日 优先权日1990年1月2日
发明者尼古拉斯·A·萨科曼诺, 罗伯德·A·福尔克曼 申请人:美国辉瑞有限公司, 自然产品科学有限公司