专利名称：牛生长激素释放因子的前体形式及有关的dna化合物的制作方法
生长激素释放因子(GRF)可用来刺激人和动物体内生长激素的产生。牛GRF(bGRF)的兽医学应用特别重要。现已阐明了成熟bGRF的氨基酸顺序(Esch等，BBRC 117772-779，1983)。然而，在本发明之前，一直没有搞清编码bGRF的天然DNA顺序。本发明提供了前所未知的多肽化合物，包括两种形式的bGRF前体和bGRF肽。本发明还包括编码本发明多肽化合物和成熟bGRF的DNA化合物。
本发明提供的DNA化合物包括编码牛生长激素释放因子、bGRF前体及bGRF先导肽的DNA顺序。本发明提供的多肽化合物中除了与bGRF前体相连的bGRF先导肽之外，还包括bGRF前体。
本发明的多肽化合物为SEQ ID No.4或6及其可药用酸加成盐或羧酸加成盐。
本发明的DNA化合物包括编码成熟bGRF、bGRF前体和bGRF先导肽的DNA顺序。编码成熟bGRF的优选DNA顺序为SEQ ID No.1。
编码bGRF前体的优选DNA顺序为SEQ ID No.3。
编码前面接有先导肽顺序的bGRF前体的优选DNA顺序为SEQ ID No.5。
本发明还提供了一些药物组合物，其中的活性成分为包含bGRF前体的多肽化合物。最后，本发明提供诱导生长激素释放的方法，该方法包括给予包含bGRF前体的多肽化合物。这些组合物和方法可用于在包括人、猪、牛、羊、禽类和鱼在内的各种动物体内诱导生长激素的释放。这些组合物和方法优选用于牛。
下列章节对本发明作了更详细的叙述。为清楚和便于理解本发明起见，下列术语和缩写定义如下。
GRF具有生长激素释放因子活性的多肽。
GRF(1-29)NH2GRF中达到全部效力所需的最少部分。
大肠杆菌中的高水平表达以能用考马斯蓝染色法检测出基因产物的水平生产由克隆基因编码的GRF类似物。
孤立DNA顺序其位置与其在基因组DNA中的天然位置不同的任何DNA顺序，无论是怎样构建或合成的。此定义包括除天然态以外所有形式的孤立DNA顺序。例如，该DNA顺序可以插入到质粒或噬菌体载体中，或者插入到它原来所在的有机体或任何其他有机体的基因组中，以增加基因剂量。
成熟bGRFbGRF(1-44);SEQ ID No.2bGRF前体bGRF(1-76);SEQ ID No.4这里提供的附图未按确切比例画出。
图1质粒pHS 507的限制位点和功能图谱。
本发明提供一些孤立DNA化合物，这些化合物包含编码成熟生长激素释放因子、bGRF前体和与bGRF前体相连的bGRF先导肽的DNA顺序。本发明还提供一些多肽化合物。
虽然以前已阐明了一种形式的成熟bGRF的氨基酸结构(Esch等，Biochem.Biophys.Res.Commun.117772，1983)，但本发明提供的是迄今为止尚属未知的bGRF前体。该前体化合物可由SEQ ID No.4及其可药用酸加成盐或羧酸加成盐表示。这种bGRF前体特别有用，因为它满足了本领域对具有bGRF活性且能在大肠杆菌中高水平产生的化合物的需求。这些化合物的大小足以避免在大肠杆菌中成熟GRF表达过程中所遇到的严重降解问题(参见例如Kirschner等，J.Biotech.12247-248，1989)。
本发明的另一种多肽化合物是在氨基末端连有bGRF先导肽的bGRF前体。该化合物可由SEQ ID.No.6及其可药用酸加成盐或羧酸加成盐表示。
SEQ ID No.6化合物在哺乳动物细胞中产生时特别有用。先导肽引起多肽产物的分泌，随着产物的分泌而切除先导肽。
本发明的所有肽化合物都可由本领域公知的化学方法来制备，包括固相肽合成法或重组法。这两种方法都描述于美国专利4，617，149，该专利在此列为参考。如果希望达到高产率，则优选重组法。构建任何所需DNA顺序的一般方法见Brown等人的报导(Methods in Enzymology，68109，1979)，该文献在此列为参考。
这些DNA顺序可以用DNA自动合成仪来合成，例如用ABS(Applied Biosystems，850 Lincoln Center Drive，Foster City，CA 94404)380B型DNA合成仪。这些DNA顺序也可通过聚合酶链反应来产生。参见例如1987年3月2日公开的美国专利公告0258017。
本发明多肽化合物的氨基酸顺序可由多个不同的DNA顺序来编码，因为大部分氨基酸都由不止一个DNA三联体编码。由于这些可替换DNA顺序编码相同的氨基酸顺序，所以本发明还包括这些可替换顺序。
专业人员公认，多肽在大肠杆菌中的翻译是通过甲硫氨酸残基起始的。本发明的多肽并不以甲硫氨酸起始。所以上述化合物可以以多种方式产生。该多肽化合物表达后，通过多种公知途径中的任一途径切除由甲硫氨酸或甲硫氨酸与另一些氨基酸组成的先导顺序。参见例如美国专利4，745，069和4，782，139;Villa等，Eur.J.Biochem.171137，1988;Geli等，Gene 80129，1989;欧洲专利公开0199018。
其他生产途径是专业人员所公知的。例如，用SV40衍生载体在真核细胞中产生这些化合物。通过bGRF前体cDNA顺序实现在真核细胞中的表达。美国专利4，775，624描述了这样一种方法。一些可替代的表达方法描述于J.Sambrook，E.F.Fritsch & T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual 16.3-17.44，1989。在啤酒酵母中进行基因表达的方法详述于《Current Protocols in Molecular Biology》一书(F.M.Ausubel，R.Brent，R.E.Kingston，D.D.Moore，J.G.Seidman，J.A.Smith & K.Struhl，1989)。
本发明的DNA顺序编码本发明的多肽化合物和成熟bGRF。成熟bGRF的氨基酸顺序是已知的，但编码它的DNA顺序在本发明之前一直是未知的。
本发明的多肽化合物包括它们的可药用无毒酸加成盐，以及它们的可药用无毒羧酸盐。
术语“可药用无毒酸加成盐”既包括有机酸加成盐也包括无机酸加成盐，包括例如由下列酸制得的盐盐酸、氢氟酸、硫酸、磺酸、酒石酸、富马酸、氢溴酸、羟基乙酸、柠檬酸、马来酸、磷酸、琥珀酸、乙酸、硝酸、苯甲酸、抗坏血酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸、丙酸等。酸加成盐最好是由盐酸、乙酸或琥珀酸制得的盐。所有上述盐都可由常规方法制备。
术语“羧酸盐”包括，例如胺盐、铵盐、季铵盐、碱金属和碱土金属盐(例如钙盐、镁盐、钠盐、钾盐和锂盐)等。
本发明还提供一种药物组合物，该组合物包含作为活性成分的多肽化合物或其可药用的酸加成盐或羧酸加成盐，以及可药用的固体或液体载体，其中所述多肽化合物为SEQ ID No.4。
本发明还提供一种诱导生长激素释放的方法，该方法包括给予有效量的由SEQ ID No.4表示的多肽化合物或其可药用的酸加成盐或羧酸加成盐。
在需要刺激生长激素释放的时间内，给予受药者若干剂量的本发明前体化合物。受药者的体重和给药方式将影响诱导特定反应所需剂量的大小。对牛来说，优选剂量估计为约3毫克/天。
肠胃外给予本发明的多肽化合物时，适于注射用的药物剂型包括无菌水溶液或分散液，以及可供复原为无菌注射液或分散液的无菌粉末。载体可以是含有以下物质的溶剂或分散介质例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、上述物质的合适混合物、或植物油。可以用以下手段保持适当的流动性例如，使用包衣如卵磷脂、在分散液的情况下保持所要求的粒度、以及使用表面活性剂。用各种抗细菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以确保防止微生物的作用。在许多情况下都希望加入等渗剂，如糖类、氯化钠等。使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以使注射用药物剂型达到长期吸收。
将本发明化合物与所需要的各种其它试剂一起加到所需量的适当溶剂中，即可制得无菌注射液。如果需要，或者为了使化合物分布更为有效，可以把化合物掺入缓释体系或定靶释放体系，如聚合物基质、脂质体和微球体。可以通过机械释放装置、渗透压泵、或能连续或脉动释放的任何其他释放装置或体系来释放。由于肽类化合物的给药技术刚刚起步，预计这一技术将会出现重大进展。本发明化合物可用这些新方法给药。
特别有利的是把本发明化合物配制成单位剂型，这样既便于给药也能使剂量均一。这里所用的单位剂型是指对治疗对象来说适于作为单位剂量的物理上独立的单元。每个单元含有经计算能达到预期疗效的预定量的化合物，以及可药用的载体。具体的单位剂型受制于或直接取决于以下两个因素(a)特定组合物的独特特征;(b)所要达到的特定疗效。
下列实施例说明本发明，但并不打算限制其范围。
实施例1bGRF前体在大肠杆菌中的表达质粒pHS 507可从NRRL以大肠杆菌DH5 a/pHS 507株得到，其登记号为B-18766(保藏日1991年2月9日)。用美国专利4，828，988的方法表达bGRF前体，上述专利在此列为参考。
实施例2bGRF前体的纯化用S Sepharose(Pharmacia，800 Centennial Ave.，Piscataway，NJ 08854)树脂制备阳离子交换柱。该柱中每50克材料含有1升树脂。将含有bGRF前体的物料以0.1升/厘米2/小时的流速加到柱中，用2个柱体积的含0.05N乙酸-7M脲的0.1M氯化钠洗涤。用各为3个柱体积的0.25M和1.6M氯化钠在乙酸-脲中的溶液形成0.25M-1.6M线性梯度，对多肽进行洗脱，以0.1个柱体积为一个级分进行收集。利用导电性、O.D.276、HPLC和聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定出含多肽的级分，然后合并这些级分。
各级分合并后向其中加入等体积的乙酸-脲溶液。将该物料加到装有S Sepharose树脂并以乙酸-脲为介质的柱上，树脂的粒度为每升树脂能容纳50克蛋白质。流速为0.02升/厘米2/小时。用0.25M氯化钠在乙酸-脲中的线性梯度洗脱bGRF前体级分。以0.1个柱体积为一个级分进行收集。如上所述分析各级分，合并含bGRF前体的级分。
以0.02M甘氨酸(pH 2.5)为介质制备一个Sephadex G-15(Pharmacia)柱，其柱体积相当于前面所合并各级分总体积的5倍。分离出含O.D.276峰的级分。
然后制备一个装有SP20SS树脂(Sephabeads，Mitsubishi Chemical，Tokyo)并以10%乙腈-0.02M甘氨酸(pH 2.5)为介质的柱。将含bGRF前体的合并液调至乙腈浓度为10%，然后加到柱中，流速为每小时1.5-2个柱体积。用2个柱体积的乙腈-甘氨酸缓冲液洗柱。由三个柱体积的10%乙腈-0.02M甘氨酸与三个柱体积的50%乙腈-0.02M甘氨酸混合形成梯度，用该梯度来洗脱bGRF前体。以0.1个柱体积为一个级分进行收集，并分析各级分中是否含有bGRF前体。
然后，将含bGRF前体的物料在用0.25M乙酸平衡过的Sephadex G 15柱上进行层析。然后分离出O.D.276峰，冷冻干燥后备用。
顺序表(1)概况(ⅰ)申请人Bierman，Kristin L.
Chan，GingHeiman，Mark L.
Hsiung，Hansen M.
(ⅱ)发明名称牛生长激素释放因子的前体形式及有关的DNA化合物(ⅲ)顺序数目6(ⅳ)通讯地址美国印第安纳州印第安纳波利斯利利总部中心专利部/AEH。邮区46285。
(ⅴ)计算机可读形式(A)存储介质类型软盘(B)计算机Macintosh(C)操作系统Macintosh(D)软件Microsoft Word(ⅵ)本申请资料(A)申请号
(B)申请日(C)分类(ⅷ)代理机构情况(A)名称中国专利代理(香港)有限公司(B)代理机构代码72001(C)代理案号CPCH 926116W(B032)(ⅸ)电信通讯(A)电话8284688(B)传真8271018、8271172、8271638(2)SEQ ID No.1情况(ⅰ)顺序特性(A)长度132碱基对(B)类型核酸(C)成链性双链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)名称/关键字CDS(B)存储位置1..132(ⅹⅰ)顺序说明SEQ ID No.1
(2)SEQ ID No.2情况(ⅰ)顺序特性(A)长度44个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)顺序说明SEQ ID No.2
(2)SEQ ID No.3情况(ⅰ)顺序特性(A)长度228碱基对(B)类型核酸(C)成链性双链
(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)名称/关键字CDS(B)存储位置1..228(ⅹⅰ)顺序说明SEQ ID No.3
(2)SEQ ID No.4情况(ⅰ)顺序特性(A)长度76个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)顺序说明SEQ ID No.4
(2)SEQ ID No.5情况(ⅰ)顺序特性(A)长度318碱基对(B)类型核酸(C)成链性双链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)名称/关键字CDS(B)存储位置1..318(ⅹⅰ)顺序说明SEQ ID No.5
(2)SEQ ID No.6情况(ⅰ)顺序特性(A)长度106个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)顺序说明SEQ ID No.权利要求
1.一种在动物体内诱导生长激素释放的方法，该方法包括给予有效量的SEQ LD No.4多肽化合物及其可药用的酸加成盐或羧酸加成盐。
2.一种在重组宿主细胞中产生式SEQ ID No.4多肽化合物的方法，该方法包括(1)用一种重组载体转化宿主细胞，该重组载体包括(a)一个转录和翻译活化顺序;(b)SEQ ID No.3的DNA化合物，其定位使它能够由活化顺序得到表达;(2)在允许基因表达的条件下培养步骤(1)中转化的宿主细胞。
3.一种在重组宿主细胞中产生式SEQ ID No.6多肽化合物的方法，该方法包括(1)用一种重组载体转化宿主细胞，该重组载体包括(a)一个转录和翻译活化顺序;(b)SEQ ID No.5的DNA化合物，其定位使它能够由活化顺序得到表达;(2)在允许基因表达的条件下培养步骤(1)中转化的宿主细胞。
全文摘要
本发明提供一些多肽化合物，这些化合物为两种形式的牛生长激素释放因子(bGRF)前体和bGRF先导肽，以及一种新形式的成熟bGRF。本发明还提供编码这些多肽化合物和成熟bGRF的DNA化合物、诱导生长激素释放的药物组合物及方法。
文档编号A61K38/00GK1066193SQ9210268
公开日1992年11月18日 申请日期1992年4月16日 优先权日1991年4月19日
发明者K·L·比尔曼, G·陈, M·L·海曼, H·M·熊 申请人:伊莱利利公司