专利名称：水生生物革兰氏阳性疾病的治疗的制作方法
当今世界上的蛋白质，有相当大部分是由水产养殖生产的。然而，水产养殖中动物个体的密度远比自然状态下高，这就存在着日益增长的治疗需求。
鲑科鱼类-如著名的鲑鱼和鳟鱼-很易患一种称为“细菌性肾病”的疾病，这是由一种革兰氏阳性菌Renibacterium salmoninarium所引起的，该病是鲑科鱼类养殖中最具破坏性的两种疾病之一。鲈形鱼也易受革兰氏阳性菌病原体的侵害，例如，日本养殖的一种黄尾鱼，因链球菌属的革兰氏阳性菌而遭受了毁灭性损失。另外，水产养殖中所生产的甲壳类动物也会受到革兰氏阳性菌病原体的感染。
虽然有为数不多的治疗方法用于水产养殖，但无一令人完全满意。与陆地上的物种相比，流体介质促进了疾病在动物之间的传播，而损失也将更大。所以，尚年轻的水产养殖业需要更多对付感染的手段。
本发明提供了一种新的治疗手段，即利用美国专利4，820，695中所述的化合物，来控制鲑鱼类如鲈形鱼类以及甲壳类动物中的革兰氏阳性菌。
这里参考引入美国专利4，820，695，其中描述了某种大环内酯抗生素。为方便读者起见，特将该化合物及其酸加成的盐类描述如下
其中，R是饱和或不饱和的仲氨基，结构式为
其中的氮原子是下面另一碳环体系的一部分含5-16个原子的单环或含8-20个原子的双环或三环的碳环系统;或者是这样的系统其中一个或更多个碳原子被如下基团所取代C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷氧羰基、羟基、C1-C4烷酰氧基、卤素、卤代C1-C4烷基、-N(C1-C4烷基)2、-N(CH2)m、
氰基、亚乙二氧基、苄基、苯基、或者有1-3个取代基的苯基、这1-3个取代基为硝基、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、或者单或双-(C1-C4烷基)氨基;m是4-7的整数;
R1是
R2是氢;C1-C5烷酰基或有1-3个卤素取代基的C1-C5烷酰基;苯甲酰基、苯乙酰基或苯丙酰基或具有1-5个卤素或甲基或1-2个甲氧基、硝基或羟基取代基的苯甲酰基、苯乙酰基或苯丙酰基;
R3是羟基;C1-C5烷酰氧基;具有1-3个卤素取代基的C1-C5烷酰氧基;苯甲酸基、苯乙酸基或苯氧乙酸基;或者是具有1-5个卤素或甲基或1-2个甲氧基、硝基或羟基取代基的苯甲酸基、苯乙酸基或苯氧乙酸基;或者是
4，820，695中的一个化合物其通用名为替米考星(tilmicosin)，由USAN指定(USAN，美国命名组织)，具有如下结构式
现已发现4，820，695中的化合物，特别是替米考星，可用来控制水产养殖中几类水族生物的革兰氏阳性菌所致的疾病，尤其是鲑科鱼类、鲈形鱼类及甲壳类动物。4，820，695中的化合物可以其本身或其生理上可接受的盐类的形式使用。
鲑科鱼类包括鲑鱼、鳟鱼和湖红点鲑。
特定的鲑鱼包括大西洋鲑(Salmo salar)阿迈格鲑(Oncorhynchus rhodurus)
大麻哈鱼(O.keta)吗苏鲑(O.masou)银大麻哈鱼(O.kisutch)细鳞大麻哈鱼(O.gorbuscha)红大麻哈鱼(O.nerka)大鳞大麻哈鱼(O.tshawytscha)鳟鱼包括美洲红点鲑(Salvelinus fontinalis)河鳟(Salmo trutta)虹鳟(Oncorhynchus mykiss)湖鳟(Salvelinus namaycush)最重要的湖红点鲑是北极红点鲑(Salvelinus alpinus)所谓鲈形鱼是指鲈形目的成员，包括鲑科、刺鲈科、鲈科、
科和丽鱼科。水产养殖中所放养的鲈形鱼包括以下几种黄尾鱼各种河鲈各种鲈大眼狮鲈太阳鱼罗非鱼梭鱼鲑(兰鱼)最后，水产养殖中的甲壳动物也会受革兰氏阳性病菌病原体的侵害。(河)虾是水产养殖业中最主要的甲壳动物，但龙虾及蟹类也有水产养殖生产的。
作为水族生物病原体的革兰氏阳性菌种类很多，甚至如对陆地生物一样。但对水产养殖业目前危害最严重的有两种，即对鲑科鱼的Renibacterium salmoniarum(细菌性肾病)及对鲈形鱼的链球菌(Streptococcus SP)。另外，尚有较次要但并非无害的细菌，如对蟹类的伯雷克氏菌属(Beneckia SP)及引起虾类败血症综合症的杆菌。
在本发明实践中，对水族生物给予US 4，820，695中的化合物，其给药量应能有效地治疗或预防革兰氏阳性菌所致的疾病。给药方式可采用水产养殖中任何有用的技术。一个普通技术就是将治疗剂包含在标准水产饲料中经口服给药，此食物可撒布于养殖水族生物的水面上。另一种给药方式是，将水族生物短时间地浸泡于含较高浓度治疗剂的溶液中。再者，还可用注射给药。该给药途径有时用于控制Renibacterium salmoninarum，此药可通过鱼卵传播到下一代。处理卵是另一种可采用的技术，即将卵浸在含有治疗剂的池子中。
本发明中，有关US 4，820，695中化合物的用量并不是严格的，它随着水族生物种类、细菌类别、给药途径以及水产养殖中的其它熟知的因素而变化。当化合物通过饲料给药时，有效剂量将随着年龄和消耗速度而改变，但是，一般来说，饲料中化合物浓度在100至1000ppm时即是有效的。在通过注射给药时，有效剂量一般在每公斤体重1-20mg化合物的范围内。
根据本发明，4，820，695中化合物的典型用法是将其与一种或多种生理上可接受的载体组合在一起制成制剂，例如正常的饲料成分、注射用载体及类似物等等。水产饲料的组成是一个很值得研究的课题。当本发明通过饲料给药时，可使用标准水产饲料，这种饲料是典型的营养平衡的完全性饲料，很适合于这种水族生物。参见鱼医学(Fish Medicine;Harcourt Brace Jovanovich，Inc.，Copyright 1993)中的第22章(鲈形鱼类)和第34章(鲑鱼类)。甲壳类动物的食物成分与鱼饲料相似。对于本发明而言，任何这些常规饲料都可加以改造以便与4，820，695中的化合物合用。
实施例1替米考星抗Renibacterium salmoninarum作用的体外评价取Renibacterium salmoninarum菌株12个，按标准方法培养。其中8个生长良好并用于替米考星的抗性评价。
按不同浓度评测替米考星，并确定出对每个菌株的最低抑制浓度(MIC)。对其中3个菌株来说，MIC是1μg/ml;对其余5个菌株，MIC为2μg/ml。甚至在低于0.25μg/ml的浓度时仍可见到显著的生长下降。
实施例2大西洋鲑的口味和生长研究该实验用以确定含不同浓度替米考星的饲料对St.John河种系的大西洋鲑(Salmo salar)的口味及生长所产生的影响。使用入海之前的鲑鱼，每条约重50克，并保证没有细菌性肾病。这些鱼先要用4周时间适应环境，在此期间，鱼被置于保持着新鲜单向流动水的水箱内，水温为10±2℃，光周期为12/12，水流速度达到足以使投料后溶解氧的浓度≥5mg/升，处于正常活动状态时要使溶解氧的浓度≥8mg/升。所有鱼均喂以标准饲料。在适应期的最后一周以及此后的处理过程中，将鱼分箱饲养，每箱25条鱼，水温也从10±1℃升至12±1℃，水流速度为1-4升/分钟(平均，2.5升/分)。光周期保持不变。
适应期结束后，开始处理。每个处理组有两个水箱(4个水箱作为对照)，处理如下进行饲料中的替米考星浓度-(对照)200mg/kg600mg/kg1000mg/kg所有鱼在一周中每天均喂3×，周末喂1×或2×，但其中两箱对照组例外，它们要给予充分的饲料直至喂饱。其余两箱对照组作为接受600mg/kg替米考星鱼的“配对组”，对这些对照组的鱼所投放的饲料量要等于处理组前一天所消耗的饲料量。实验持续4周，并测定下列数据进食量进食量占体重的%体重增加量体重增加量占体重的%饲料转化量4周结束后，将鱼处死，取出肝、肌肉和肾组织，用HPLC检测替米考星。检测时，按下述步骤提取替米考星，首先将组织用甲醇制成匀浆，离心，从甲醇提取液中分去沉淀，将甲醇提取液用盐溶液稀释，并用CCl4萃取，然后将水相碱化，用CHCl3∶己烷提取替米考星，提取液蒸干并复溶后用于HPLC检测。替米考星的定量测定是使用苯基甲硅烷作固定相的反相HPLC，用U.V.检测器，测定波长为280nm。
另外，还应观察所有鱼的喂食反应以及任何行为变化或中毒迹象。实验结束后所有的鱼均作尸检。
饲料配方及实验结果见下面的表1-5。在这些表中，具有相同字母上标的平均值在0.05水平上没有统计学上的差异。
表1 基础混合物的组成基础混合物 %鲱鱼粉 38.0血粉 5.2黄豆粉 8.0啤酒干酵母 4.0谷麸粉 5.0家禽副产品粉 3.0干乳清 6.0复合维生素 2.0复合矿物质 4.0氯化胆碱 0.2DL-蛋氨酸 0.275.6
表2 饲料配方实验饲料的配方组分的克数OT**200T**600T**1000T**基础混合物 6048(75.6%) 2268 2268 2268替米考星预混物*0(0.0%) 75 225 375小麦麸粉 1152(14.4%) 357 207 57鲱鱼油 800(10.0%) 300 300 3008000(100.0%) 3000 3000 3000＊＊T＝mg替米考星/kg配成饲料＊替米考星预混物由11.23g替米考星碱(替米考星活度为8.0g)与988.77g麦麸混合而成。
表3 进食重、体重增加量及饲料转化量A.进食量及其占体重的百分比每kg饲料中的替米 进食量(克) 进食量占体重的%考星(mg)报告1 报告2 平均 S.D. 报告1 报告2 平均 S.D.
0 370.2 376.6 373.4a3.2 1.41 1.45 1.43b0.02200 375.5 391.88**383.7a8.2 1.39 1.45 1.42b0.03600 363.7 372.5 368.1a4.4 1.45 1.43 1.44b0.011000 427.0 326.4 376.7a50.3 1.50 1.29 1.39b0.11B.体重增加量及其占体重的百分比每kg饲料中的替米 体重增加量(克) 体重增加量占体重的%考星(mg)报告1 报告2 平均 S.D. 报告1 报告2 平均 S.D.
0 337.1 338.2 337.7a0.6 35.7 35.5 35.6b0.1200 352.4 370.2**361.3a8.9 36.4 38.1 37.3b0.9600 334.1 360.4 347.3a13.2 37.0 37.4 37.2b0.21000 429.5 318.5 374.0a55.5 42.1 34.2 38.2b4.0
C.饲料转化量每kg饲料中的 饲料转化量替米考星(mg)报告1 报告2 平均 S.D.
0 1.10 1.14 1.12a0.02200 1.07 1.07 1.07a0.00600 1.09 1.03 1.06a0.031000 0.99 1.05 1.02a0.03＊每天平均饲料消耗量为体重的1.43%，相应的每天的替米考星剂量为2.9、8.6和14.3mg/kg体重＊＊该箱有26条鱼，相应数据已校正到25条表4 鱼组织HPLC检测饲料中替米考星 替米考星浓度,ppm浓度,ppm肝 肌肉 肾0 BLOQ*BLOQ BLOQ200 0.9 0.2 2.7600 2.5 0.4 6.71000 4.1 0.9 14.5
＊BLOQ＝低于检测水平表5 进食量、体重增加量和饲料转化量配对研究A.进食量及其占体重的百分比＊每kg饲料中的替米 进食量(克) 进食量占体重的%考星(mg)报告1 报告2 平均 S.D. 报告1 报告2 平均 S.D.
600 363.7 372.5 368.1a4.4 1.45 1.43 1.44b0.010 359.1 334.0 346.6a12.6 1.33 1.26 1.29b0.03B.体重增加量及其占体重的百分比每kg饲料中的替米 体重增加量(克) 体重增加量占体重的%考星(mg)报告1 报告2 平均 S.D. 报告1 报告2 平均 S.D.
600 334.1 360.4 347.3a13.2 37.0 37.4 37.2b0.20 378.7 309.1 343.9a34.8 38.5 32.4 35.5b3.1
C.饲料转化量每kg饲料中的 饲料转化量替米考星(mg)报告1 报告2 平均 S.D.
600 1.09 1.03 1.06a0.030 0.95 1.08 1.01a0.07＊对照组鱼的进食量略低于处理组鱼的进食量，因为在数天里对照组鱼没有吃完所投放的饲料。
表1-5证实含有替米考星200、600及1000mg/kg的饲料对于大西洋鲑是可口的，其消耗速度与对照组相同。处理的鱼与对照组的鱼一样生长得很好。实验结束后全部鱼的尸检结果也未显示明显的异常。
实施例3大西洋鲑的口味及生长研究，替米考星碱与磷酸盐的比较本实验用来确定含有替米考星(游离碱)或者替米考星磷酸盐的饲料对St.John河品系的大西洋鲑(Salmo salar)的口味的影响。所用的鲑来自保证无病的类族，系入海之前的每条约50克的鲑鱼。这些鱼分成9箱，每箱30条，用约两周时间以适应环境。在此期间以及实验过程中，水箱中始终维持着新鲜的单向流动的水，每分钟2升，水温为12±1℃，光周期是12/12。在适应期内，所有鱼均喂以标准饲料。此后，三个水箱中的鱼继续给予标准饲料作为对照;另外三个水箱中的鱼接受每公斤食物中含800mg替米考星(游离碱)的改造饲料;最后三箱鱼所吃的饲料中含有替米考星磷酸盐，其含量相当于每公斤食物中含800mg替米考星(游离碱)。所有鱼均喂到饱腻为止，此点可由喂食反应显著下降来判断。喂食在一周每天均为3×，而周末为1×。实验持续4周，在此期间测定下列数据进食量进食量占体重的%体重增加量体重增加量占体重的%饲料转化量所有生存下来的鱼均予以处死。结果列于下表中;具有相同字母上标的平均值在0.05水平上无统计学差异。
表6 饲料组成饲料成分 %鲱鱼粉 38.0血粉 5.2黄豆粉 8.0啤酒干酵母 4.0谷麸粉 5.0家禽副产品粉 6.0干乳清 6.0维生素预混物 2.0
氯化胆碱 0.2DL-蛋氨酸 0.2矿物质预混物 2.0鲱鱼油 10.0抗生素预混物*13.4100.0＊所用的几种预混物按下法制备对照组抗生素预混物只含有麦麸。成品饲料在适应期内喂所有的处理组鱼，在实验期内喂对照组。
替米考星碱抗生素预混物按下列方法制备6.845克替米考星碱(5.97克活性替米考星)与993.155g麦麸混合。最终饲料中，每公斤食物含有相当于800mg替米考星活度的替米考星碱。
替米考星磷酸盐抗生素预混物按下列方法制备取由20%替米考星磷酸盐(以替米考星活度计)和80%粗谷粉构成的混合物20克，再与650克麦麸混合。最终饲料中，每公斤含有相当于800mg替米考星活度的替米考星磷酸盐。
表7 进食量、体重增加量和饲料转化量替米考星碱与磷酸盐的比较＊总进食量 平均喂食 整箱体重 整箱体重 饲料转(g) 速度(% 增加(g) 增加量 化量替米考星 体重) (%体重)对照) 664.6 1.45 827.0 54.4 0.80(37.5)a(0.08)a(40.4)a(2.4)a(0.01)a游离碱,800 658.9 1.40 831.0 53.5 0.79mg/kg (22.9)a(0.06)a(51.8)a(0.9)a(0.02)a磷酸盐,浓 625.5 1.38 802.3 53.7 0.78度=800mg/ (15.5)a(0.02)a(52.9)a(3.9)a(0.04)akg游离碱＊具有相同字母上标的平均值在0.05水平上无统计学差异。
三组之间的数据分析没有显示出显著性差异，因此，食物中含有(1)替米考星(游离碱)800mg/kg以及(2)浓度相当于800mg/kg替米考星游离碱的替米考星磷酸盐对于大西洋鲑是可口的，与未加药饲料的消耗速度相同。投放替米考星磷酸盐饲料的箱中有一条鱼死亡，致死原因不能确定。吃未加药饲料的一条鱼表现出轻微的失衡感，但投料反应未见变化。所有接受两种形式替米考星的鱼中，其尸体检验均未见任何异常。
权利要求
1.如结构式Ⅰ所示的化合物及其生理上可接受的加成盐。
其中，R是饱和或不饱和的仲氨基，结构式为
其中的氮原子是另一碳环系的一部分含5-16个原子的单环或含8-20个原子的双环或三环的碳环系统；或者是这样的系统其中一个或更多个碳原子被如下基团取代C1-C4烷基、C2-C4链烯基、C2-C4链炔基、C1-C4烷氧基、C1-C4烷氧羰基、羟基、C1-C4烷酰氧基、卤素、卤代-C1-C4烷基、-N(C1-C4烷基)2、-N(CH2)m、
氰基、亚乙二氧基、苄基、苯基、或者有1-3个取代基的苯基，这1-3个取代基为硝基、卤素、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、羟基、氨基、单或双-(C1-C4烷基)氨基；m是4-7的整数；R1是
R2是氢；C1-C5烷酰基或有1-3个卤素取代基的C1-C5烷酰基；苯甲酰基、苯乙酰基或苯丙酰基或具有1-5个卤素或甲基或1-2个甲氧基、硝基或羟基取代基的苯甲酰基、苯乙酰基或苯丙酰基；R3是羟基；C1-C5烷酰氧基；具有1-3个卤素取代基的C1-C5烷酰氧基；苯甲酸基、苯乙酸基或苯氧乙酸基；或者是具有1-5个卤素或甲基或1-2个甲氧基、硝基或羟基取代基的苯甲酸基、苯乙酸基或苯氧乙酸基；或者是
用于治疗或预防革兰氏阳性菌在水族生物即鲑鱼、鲈形鱼或甲壳类动物中所引起的感染。
2.如权利要求1所述的化合物，为替米考星(tilmicosin)或者是其生理上可接受的酸加成盐。
3.如权利要求1或2所述的化合物，用于治疗或预防鲑鱼类由Renibacterium salmoninarum所致的感染。
4.如权利要求1或2所述的化合物，用于治疗或预防鲈形鱼由链球菌(Streptococcus spp.)所致的感染。
全文摘要
本发明旨在利用US4,820,695中的替米考星(tilmicosin)和其它化合物来治疗水族生物中的由革兰氏阳性菌病原体引起的感染。
文档编号A61K31/075GK1093371SQ9312162
公开日1994年10月12日 申请日期1993年12月15日 优先权日1992年12月21日
发明者额尔·尤金·奥斯 申请人:伊莱利利公司