专利名称：蕲蛇酶注射液及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种医疗药品及其制备工艺，特别适用于血栓患者的治疗。
蕲蛇酶系福建医学院蛇毒研究室自蕲蛇毒中分离而得的一种具有抗血栓作用的酶类，由于其抗凝血性质类似凝血酶，故通称为凝血酶样酶。目前在该领域，国外主要产品有Arain(ancrocl)(红口蝮蛇毒抗栓酶)和Batronolin(Difibrase)(茅头蝮蛇毒抗栓酶)，作用和用途基本上和蕲蛇酶类似，但蛇毒资源有限，药品价格较贵，专利文献CN1063041A中公开了“一种蛇毒溶栓素的配方和制备工艺”，该蛇毒溶栓素是由纤溶组分，舒缓组分，抑聚组分，类凝血酶组分组成，该制备工艺是分别将两种蛇毒的有效组分，经分离、纯化、再配方制得，由于该配方中含有纤溶组分，混有出血毒或神经毒素等，毒性较大，易造成治疗性出血或神经毒征状，另外该制备工艺需用两种蛇毒溶液分别进行分离纯化，工艺较为复杂。
本发明的目的在于提供一种纯度高、组分清楚、药源广、能克服治疗性出血和再血栓等副作用的蕲蛇酶注射液及其制备工艺。
本发明提出的蕲蛇酶注射液是由三种分子量分别为14、31及66KD的同功酶溶液用0.9%的Nacl稀释组成，其中三种同功酶含量比例为4∶5∶1，等电点(PI)在4.0-5.0，本发明蕲蛇酶注射液在体内作用机理为
蕲蛇酶属凝血酶样酶(Thrombin-likeenzgmes，TLES)，作用于人体的Aα键的16精-17甘键，并裂解出A肽，形成(Aα、Bβ、γ)n型纤维蛋白，此种纤维蛋白易受纤溶酶(Plasmin)作用，迅速分解，产生纤维蛋白肽，由肾脏清除出体外，导致血浆纤维蛋白原含量明显降低，血浆凝血酶作用时间延长，纤维蛋白降解产物增多，凝血酶样酶还能阻止凝血酶诱导血小板聚集，对ADP-Na，胶元及肾上腺素等血小板诱导剂亦同样有抑制效应。本发明制备工艺如下步骤(a)、将蛇毒溶液低温离心去沉渣后上柱;
(b)、用葡聚糖凝胶G-75(sephadexG-75)，0.01mol/LTris-Hcl缓冲液(PH8.6)洗脱出A、B、C三个蛋白峰、弃去无活性的C峰及沉淀部分，得A、B峰，再上DEAE-scphadexA-50层柱分离，0.01mol/lTris-Hcl为洗脱液，加0.0～0.3mol/LNacl直线梯度洗脱;
(c)、分别收集层柱第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ层;
(d)、将上述三种蛋白峰分别用sephadexG-75纯化，并用0.01mol/LTris-HCL缓冲液洗脱两次，弃去无活性的峰，得到三种同功酶溶液;
(e)、将三种同功酶溶液按比例混合即得到蕲蛇酶溶液;
(f)、用0.9%Nacl稀释，滤过除菌，待无菌无热源后罐封安瓶。
本发明制备的蕲蛇酶注射液，按卫生部规定的方法测定，8分钟内不出现纤维蛋白凝块，注射液中精氨酸酯酶活力达1000μmolTAME/mg·min以上，含蕲蛇酶蛋白质为标示量的100±15%，在药理方面，本发明所制备注射液具有抗凝、降低血浆纤维蛋白原含量，并经对抗血小板聚时，对抗动、静脉血栓形成毒理学方面进行急性毒性及长期毒性和特殊毒性测定，均符合新药审批的各项要求，本发明提出制备工艺，步骤明确，顺序稳定，所用缓冲液恒定，且其离子强度及PH均恒定，使得分离产物恒定提取物品质纯，适用于大规模生产。
附
图1为本发明制备工艺流程图现结合实例对本发明作进一步地说明取尖吻蝮蛇毒10.0g，用0.01mol/LTris-Hcl缓冲液(PH8.6)50ml溶解，5000转/分低温离心15分钟，去沉淀上清液留待上柱;分离载体为DEAE-Sephadex-50)经碱-酸-碱处理后，装柱(5×100cm)，用0.01mol/LTris-Hcl缓冲液(PH8.6)平衡24小时后，取上述蛇毒溶液上柱，并用同一缓冲液洗脱，用自动部分收集器收集洗脱液，洗脱液用紫外分光光度计，检测吸收度;待洗脱出A、B、C三个蛋白峰，弃去无活性的C峰及沉淀，得A、B峰，再上(DEAE-Sephadex-50)层柱分离，0.01mol/LTris-Hcl缓冲液(PH8.6)为洗脱液，加0.3mol/LNacl直线梯度洗脱，分别收集层柱第Ⅴ、第Ⅵ、第Ⅵ蛋白峰，低温浓缩，分别用sephadexG-75纯化，并用0.01mol/LTris-HCL缓冲液洗脱两次，弃去无活性的峰，得到三种分子量为14、31及66KD同功酶的纯溶液，取三种同功酶含量比4∶5∶1或4∶2∶2、3∶5∶2，等电点(PI)在4.0-5.0，混合各组分，得到蕲蛇酶母液，将蕲蛇酶母液经6号垂熔漏斗过滤后，作蛋白质含量测定(用药典规定Lowry氏法)，再作凝血酶活力及精氨酸酯酶活力测定，热原及过敏反应试验，全部合格后，用无菌、无热源的0.9%Nacl稀释成150ug/ml溶液，再经6号垂熔漏斗过滤后，灌封安瓶，每支1ml∶1u(150ug)即得。用上述工艺制备的蕲蛇酶母液，也可用无菌、无热原的0.9%Nacl稀释成75ug/ml溶液。该注射液使用方法为每日一支，用0.9生理盐水稀释成100ml，静脉滴注，5-7天为一疗程，重症者一疗程后，停药5天，再用第2疗程。注意事项用药前须做过敏试验，用药期间如发生过敏，可与蕲蛇酶注射液同时静脉内注入地塞米松。该注射液生产及贮藏温度在4-15℃。
权利要求
1.一种蕲蛇酶注射液，其特征是它由三种分子量分别为14、31及66KD的同功酶组成，蕲蛇酶射液，其含量比例为4∶5∶1，等电点在4.0-5.0，并由0.9%Nacl稀释成不同规格的注射液。
2.一种蕲蛇酶注射液制备工艺，其特征是按下述步骤实现的(a)、将蛇毒溶液低温离心去沉渣后上柱;(b)、用葡聚糖凝胶G-75(sephadexG-75)，0.01mol/LTris-Hcl缓冲液(PH8.6)洗脱出A、B、C三个蛋白峰、弃去无活性的C峰及沉淀部分，得A、B峰，再上DEAE-scphadexA-50层柱分离，0.01mol/lTris-Hcl为洗脱液，加0.3mol/LNacl直线梯度洗脱;(c)、分别收集层柱第Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ层;(d)、将上述三种蛋白峰分别用sephadexG-75纯化，并用0.01mol/LTris-HCL缓冲液洗脱两次，弃去无活性的峰，得到三种同功酶溶液;(e)、将三种同功酶溶液按比例混合即得到蕲蛇酶溶液;(f)、用0.9%Nacl稀释，滤过除菌，待无菌无热源后罐封安瓶。
3.根据权利要求1所述的蕲蛇酶注射液，其特征是将蕲蛇酶溶液用0.9%Nacl稀释成150ug/ml。
4.根据权利要求1所述蕲蛇酶注射液，其特征是将蕲蛇酶溶液用0.9%Nacl稀释成75ug/ml注射液。
全文摘要
本发明涉及一种蕲蛇酶注射液及其制备工艺，该注射液是由分子量分别为14、31、66KD，等电点在4.0—5.0的三种的三种同功酶，用0.9％NaCl溶液稀释而成；其制备工艺主要步骤是对蛇毒溶液进行层柱分离，分离出A、B、C蛋白峰后，弃去无活性部分，继续纯化分离，取其层柱第V、VI、VII层蛋白峰，制得蕲蛇酶溶液，最后用0.9％NaCl稀释成不同规格的注射液，本发明制备的蕲蛇酶注射液纯度高，组分清楚。
文档编号A61K38/46GK1106699SQ9410100
公开日1995年8月16日 申请日期1994年2月8日 优先权日1994年2月8日
发明者王晴川, 刘广芬 申请人:福建省三明制药厂, 福建医学院