专利名称：保健组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物，它具有出色的药理和保健的效果，更具体地说，涉及由冬虫夏草得到的药物型的和/或饮食品型的组合物。
现有技术冬虫夏草是子囊菌类(Ascomycota)、核菌纲(Pyrenomycetes)、麦角菌目(Clavicipitales)、麦角菌科(Clavicipitaceae或Hypocreacea)、冬虫夏草属(Cordyceps)的微生物，它们经过完全变态过程和不完全变态过程。
冬虫夏草的子实体在古代就被评价为对永葆青春和延年益寿有奇特功效或营养、滋补类的药品。迄今为止被认为特别有效的中药的植物性黄蜂的子实体被广泛地制成粉末并使用。
根据本发明，培养特殊的冬虫夏草的菌丝体并将培养好的菌丝体用热水提取。众所周知，从该菌丝体提取的这样的提取物具有强心和抗疲劳的功效。
本发明要解决的问题本发明的目的是为了开发新的具有强心、降低血压、镇咳和抗疲劳功效的药物或具有相同功效的食品和饮料，出于安全性考虑，本发明也是为了开发可以长期施用的天然物质。
解决这些问题的方法为了达到上述目标而进行了各种调查之后，我们，本发明的发明者已经特别地注意到中药和植物性黄蜂，尤其是那些冬虫夏草，在对它们进行了进一步的研究之后，结果发现通过培养得到的菌丝体，尤其是用热水提取培养的菌丝体得到的产物具有适度的强心和抗疲劳的功效。在此发现的基础上，我们进行了进一步的研究，最终获得了本发明。本发明在下文被详细描述。
附图的描述
图1表明了冬虫夏草MF-20008菌丝体的热水提取物对鼠右心房肌肉收缩力的影响。
图2表明了冬虫夏草MF-20008菌丝体的热水提取物对鼠右心房肌肉收缩间隔时间的影响。
图3表明了在施用冬虫夏草MF-20008菌丝体的热水提取物之后，鼠胃腺中形成的溃疡的溃疡指数(cm)。
图4-1表明了鼠肝细胞初期培养物中3H-胸苷的摄取情况；图4-2表明了上述条件下3C-缬氨酸的摄取情况。
图5表明了冬虫夏草MF-20008菌丝体的热水提取物对鼠胃酸分泌的抑制效果。
为了实施本发明，有必要培养冬虫夏草的菌丝体，并收集培养的菌丝体。冬虫夏草的所有微生物都可被用于本发明，并被指称为本发明的微生物。例如，冬虫夏草MF-20008是有用的，该菌株以FERM BP-5149保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所。
根据本发明，冬虫夏草的菌丝体是培养的。
它们被培养于包含麦芽提取物、酵母提取物、蛋白胨、马铃薯肉汤、葡萄糖、维生素、氨基酸、核酸、蛋白质和可选的宿主成分(例如昆虫等)的介质，经过液体或固体培养，菌丝体可在其中充分地繁殖。
液体培养，尤其是通气的搅拌培养是培养大量菌丝体的优选方法，培养在pH值4至7和15至32℃的条件下进行，同时以大约50至500rpm，优选的是100至300rpm的速度轻轻搅拌介质，培养3至10天。
培养之后，培养的菌丝体用热水提取。将水加于菌丝体，然后，可选地在被研磨之后，加热至60至100℃，优选的是从85至100℃，更优选的是从90至95℃，之后用热水提取，可选地搅拌。加入的水的量并未被严格限定，但优选的是每克干菌丝体1毫升至1升。
从获得的热水提取物中除去残留物质，所得的液体提取物被直接或在进一步加工之后用作本发明的活性成分。通过加工液体提取物获得的产物广泛地包含该液体提取物的浓缩产物、糊状产物、干制产物和/或稀释产物。根据具体情况，热水提取物或其加工后的产物可以不用从中除去残留物质而被直接使用，例如作为食品或饮料。
菌丝体的热水提取物(包括其加工后的产物)具有适度的强心、降低血压、镇咳和抗疲劳的功效，并且包含该物质的本发明的组合物可以被用作具有相同功效的食品和饮料、为特殊保健目的的食品和饮料、保健饮料、保健食品、营养食品，以及其它各种类型的食品和饮料，也可以用作药品，例如强心剂、降压剂、镇咳剂、滋补药等。
对于食品-饮料型组合物，热水提取物活性成分(或其加工后的产品)可以直接使用或与其它食品或食品组分通过普通方法混合。包含活性成分的本发明的组合物可以以固体(粉末、颗粒等)、糊剂、液体和悬液中的任何一种形式存在，并且它适合于与甜味剂、酸味剂、维生素和其它各种用于普通饮料的添加剂共同配制成保健饮料。
对于药物型组合物，活性成分可以以不同形式施用。所述的形式是各种口服组合物，包括如片剂、胶囊、颗粒剂、粉剂、糖浆等。这些不同的制剂可以用本技术领域配制药物通常所使用的已知的辅助添加剂，例如赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、调味剂、助溶剂、悬浮剂、包衣剂等，用普通的方法配制而成。用的活性成分的剂量随病情、受施者的年龄和体重，以及施用途径和制剂的形式等的不同而不同，但是一般每次施用从0.1mg/成人至1,000mg/成人。
本发明的活性成分是从天然原料得到的，它们已经被当作中药使用了许多年了，并且完全无毒或仅有轻微毒性。因此，它们是安全的。将它们以500mg/天的剂量让鼠口服，结果没有任何剧烈的毒性。因此，对任何预防疾病、保健和日常食用等应用并不特别限定加入食品-饮料型组合物的活性成分的量。对药品，加入的活性成分的量可以根据患者的情况在上述范围内限定。由于本发明的活性成分即使大量服用时仍没有显示出毒性，因此，如果需要，施用剂量可以超出上述范围而不会有任何问题。
本发明通过如下的制造例和实施例详细描述。
制造例11升的M20Y2培养基(1升中包含20g锥形的麦芽提取物(Oxoid)和2g的酵母提取物(Difco)，pH值为5.5)被分别注入46个3升的锥形瓶，然后在高压釜中121℃灭菌15分钟。
一个冬虫夏草MF-20008菌丝体(FERM BP-5149)的铂环(从中国福建三明真菌研究所获得)，用M20Y2琼脂斜面培养基预培养，接入每个灭过菌的培养基中，并于25℃以180rpm摇动培养5天。于是，在这46个烧瓶里得到了46升的培养液。
将46升的培养液离心，分离出的菌丝体被冰冻干燥，得到323.6g的干菌丝体。将干菌丝体放入一个洁净的容器中，加入7升水，然后用polytoron研磨，之后在搅拌的情况下90-95℃加热2小时并抽提。抽提后，残留物质通过过滤除去，所得的滤液冰冻干燥，获得130g的淡黄色粉末。
制造例2用与制造例1中相同的方法，将150毫升的M20Y2培养基加入一个500毫升的锥形瓶中并用高压釜灭菌，1毫升的冻干冬虫夏草MF-2008接种到其中并在25℃以180rpm摇动培养的5天。它被用作种子培养基，并在150毫升的下述培养基里用下面的方法培养。
150毫升的D培养基(1升中包含4.0g的蔗糖，4.0g的磷酸氢二钾，0.5g的天门冬酸酰胺，2.0g的磷酸氢二铵，2.0g的7水合硫酸镁，0.25g的碳酸钙，0.1g的氯化钙和4.0g的酵母提取物B-2，pH值为5.6)在灭菌和过滤之后，加入一个150升的发酵罐，150毫升的上述种子培养基接种到其中，并控制在25℃、pH值5.5、DO50％的条件下，用157rpm的速度摇动培养3天。培养过程中产生的泡沫通过向发酵罐中加入硅胶消泡剂除去。所得到的150升的培养物用澄清器(clarifier)处理以分离菌丝体。于是，获得菌丝体的水悬液。在搅拌的情况下90-95℃加热2小时并抽提。然后，用澄清器分类以分离出上清夜。它通过0.45微米和0.22微米的无菌过滤器过滤，得到80升的淡黄色热水提取物(固体成分的干重800克)。
实施例1在制造例1中制备的培养的冬虫夏草MF-2008的菌丝体(干菌丝体)和其热水提取物(淡黄色粉末)被用于对鼠进行游泳疲劳试验，在该试验中，它们是口服的。
试验动物是雄性ICR鼠(5至7周龄)，它们被分成三组并在下述条件下进行疲劳试验。用药方法冬虫夏草MF-2008菌丝体的热水提取物或菌丝体本身与粉末状CRF-1饲料以2.5％或5％的比例混合，所得的粉末饲料混合物给鼠连续服用16天。鼠的分组每组20只(1)对照组只用粉末状CRF-1饲料喂养。
(2)服用热水提取物组用包含2.5％热水提取物的饲料混合物喂养。
(3)服用菌丝体的组用包含5％干菌丝体的饲料混合物喂养。试验程序在开始服药后第15天，对鼠进行强迫游泳试验。第16天，从每只鼠身上收集所有的血液并进行全血分析和血清分析。
(1)游泳疲劳试验如下一个36升的游泳池(49厘米×33.5厘米×22厘米(深))充满17℃的水，并加入10毫升的中性清洁剂。鼠被强迫在池中游泳(无负重)，每只鼠的游泳试验停止于它的鼻子没入水中5秒钟时。所得结果列于表1。
表1
上述结果用Aspin-Welch法分析其显著性。在第一组和第二组之间存在着显著性差异，试验的显著性水平为1％。但是，在第一组和第三组之间没有显著性差异，试验的显著性水平为5％。
游泳疲劳试验是基于试验动物总反应的变化，为评价试验物质抗疲劳功效而通常采用的试验之一。因此，上述结果正是科学地验证了本发明的活性成分在提高运动力量持久能力方面的出色功效，及其出色的抗疲劳功效。
(2)在服药后第16天，从每只经过上述游泳疲劳试验的鼠身上收集全血，并分析其血小板的数量(×10,000/平方毫米)、血色素量(克/dl)、红细胞的数量(×10,000/平方毫米)、白细胞的数量(/平方毫米)，以及血细胞比容(％)。
全血分析的结果列于表2。从这些结果可以明显看出，对于所有的检测项目来说，在试验组和对照组之间没有显著性差异，试验的显著性水平为5％。(分析全血使用的是Student测试。但是，在第三组中血小板数量计数使用的是Aspin-Welch法。)表2
(3)在试验过程中，测量每只鼠的体重，试验鼠的平均体重(克)的差异性列于表3(接受强迫游泳试验的鼠的重量的差异)。
表3
实施例2根据Tsunoo等人的方法(见Kurokawa M.和Tsunoo A.，《生理学杂志》，第407卷，135-153页，1988年；Tsunoo A.等，《生理学杂志》，第433卷，163-181页，1991年)检测在制造例1中制备的冬虫夏草MF-20008菌丝体热水提取物对从SD鼠取出的右心房、右心室乳头状肌肉、主动脉和支气管的影响，并评价提取物的功效。
(1)心肌样本在对雄性的SD鼠的心肌样本使用热水提取物时，测量右心房心肌的收缩力及其收缩间隔时间。
右心房是在使用工作的起搏器的同时从雄性的SD鼠(380至450克)身上取得。心肌样本被固定于一个体积为0.8毫升的水平灌注容器，其收缩力被等长记录。灌注液使用的是已被95％的氧气和5％二氧化碳平衡的克莱布溶液，或包含140mM氯化钠、5mM氯化钾、2.6mM氯化钙、1.3mM氯化镁、10mM葡萄糖和5mM的HEPES的充气的盐溶液。灌注液被保持在36至37℃，流速为3至4毫升/分钟。
结果，与对照组相比，菌丝体的热水提取物(从50至100微克/毫升)使右心房心肌的收缩力增加了9±3％(平均值±标准方差，n＝5)。与对照组相比，由起搏器产生的自动收缩间隔时间被延长了14±10％(n＝4)。图1和图2表明了右心房心肌收缩力的基于时间的增加，也表明了收缩间隔时间的基于时间的延长。
在图1和图2中，提取液(60微克/毫升)在粗实线表示的期间被用于检测系统。纵轴表示相对于对照组(在使用提取液之前)标准值为1(一)时的收缩力的相对值。横轴表示时间，0(零)的意思是提取液加入检测系统的时刻，负数的意思是使用前的时刻。
从上面可以明显地看出，热水提取物对右心房心肌自发收缩的效果被图中数据所证实。而且，右心室的乳头状肌肉被从鼠中取出，按上述方法固定于灌注容器中，通过一根铂导线施加电刺激(2Hz)，测量提取物对右心室乳头状肌肉收缩的有效性，该收缩是由电刺激产生，并非自发收缩。结果，与对照组相比，提取物(从30至100微克/毫升)使电刺激产生的右心室乳头状肌肉的拉力增加了13±1％(n＝3)。
(2)主动脉样本通过将热水提取物应用于雄性SD鼠的主动脉样本，测量提取物对主动脉的作用以及由50mM钾离子对主动脉造成的持续收缩的抑制作用。
主动脉从雄性SD鼠取出，制成螺旋状切片样本。样本在与上述相同的条件下，固定于灌注容器。用来刺激样本的50mM钾离子溶液是在容器中以氯化钾替代氯化钠制备而成。
结果，菌丝体的热水提取物(从50至100微克/毫升)在统计意义上对主动脉没有显著效果。但是，它缓解了50mM钾离子造成的主动脉的持续收缩。若50mM钾离子造成的主动脉的收缩拉力被定为100％，提取物使拉力降低了2至12％(n＝5)。
(3)支气管样本通过将热水提取物应用于雄性SD鼠的支气管样本，测量提取物对由电刺激或50mM钾离子对支气管造成的收缩的抑制作用。
支气管从雄性SD鼠取出，制成螺旋状切片样本。样本在与上述相同的条件下，固定于灌注容器。用来刺激样本的50mM钾离子溶液按上述方法制备。电刺激通过灌注容器中一根铂导线以30秒的间隔施加于样本。
结果，与对照组相比，菌丝体的热水提取物(从50至100微克/毫升)使电刺激造成的支气管短暂收缩被抑制了23至65％(n＝3)。它也缓解了由50mM钾离子造成的支气管持续收缩。若50mM钾离子造成的支气管的收缩拉力被定为100％，提取物使拉力降低了9至13％(n＝3)。它与茶碱(50μM)有相似或更高的缓解效果。
从上述(1)至(3)的结果中可以看出的，菌丝体的热水提取物具有①在延长心肌收缩间隔时间的同时，对增强心肌的持续收缩力有适度的效果，②在增加系统血液流量的同时，提取物具有舒张血管的作用，以及③由于提取物抑制支气管的短暂和持续收缩，因此它降低了呼吸的阻力并加强了肺通气量。因此，从这些科学数据我们可以确认，本发明的组合物具有强心的功效、降低血压的功效以及镇咳的功效。
实施例3使用在制造例1中制备的冬虫夏草菌丝体的热水提取物(冰冻干燥粉)，进行鼠的浸水的、限定压力的溃疡试验来检测提取物的抗压力功效。
试验动物从日本查尔斯河公司购买的五周龄的雄性的丝普瑞格-道利鼠，预饲养约一周。这样饲养后的六周龄鼠被用作试验动物。
施用冬虫夏草的热水提取物溶于蒸馏水，配成浓度为50毫克/毫升的注射液，然后被分为若干部分，每部分为一天的剂量。它们被冷冻并贮存于-20℃。使用前，它们在室温融解。对照组的鼠只注射蒸馏水。提取物溶液或蒸馏水是通过一只鼠的金属胃探针从口腔施用的。活性成分的剂量、溶液(或蒸馏水)的剂量以及施用时间表列于表4。溶液(或蒸馏水)的剂量的计算是基于每只鼠的最新的体重，通常，施用在上午9至12点时间进行。
表4
(1)对照组的每只鼠的施用是注射4毫升/公斤/日剂量的蒸馏水。
(2)施用开始的那天定为0。
浸水的、限定压力的溃疡试验(在第10-11天过夜加压)在浸水、限定压力施加前12小时，停止喂鼠。之后，将鼠放入一个压力计并进入水中至剑突处。浸水时间限定为15小时。在施加压力后，鼠被麻醉并被处死，结扎胃上部的贲门和十二指肠，并取出胃。将生理盐水注入胃中，然后将胃浸入福尔马林溶液。15分钟后，剖开胃，测量胃腺中形成的溃疡的长度。测量后，胃用福尔马林固定，进行病理解剖检查，所形成的溃疡按下述条件评析。
分数0无异常1粘膜上部2粘膜固有层3粘膜肌肉层4浆膜层结果示于图3和表5。
表5
实施例4作为培养的冬虫夏草菌丝体的热水提取物抗疲劳功效的一个指标，我们测量了在鼠的肝细胞原代培养时，提取物促进DNA合成和蛋白质合成的活性。
从牛小肠上皮粘膜获得的包含肝细胞生长因子的提取物的制备及提取物的特性一种牛小肠上皮粘模细胞的可溶于甲醇的提取物基本上包含如凝胶渗透色谱所测定的小分子物质，它被称作低分子量部分(LMW)。另一方面，牛小肠上皮粘膜用甲醇提取后，其残留物经过PBS进一步提取而获得的提取物，基本上包含蛋白质类的大分子量物质，它被称作高分子量部分(HMW)。
当LMW加入原代培养的鼠肝细胞后，在细胞中存在胰岛素的情况下，它促进了DNA和蛋白质的合成。当加入LMW和HMW的混合物后，与HMW的基本活性相比，DNA和蛋白质的合成被进上步加速了。换句话说，LMW在该检测系统中显示了基本的活性，而HMW具有附加的活性。冬虫夏草的热水提取物包含基于上述提取方法的低分子量部分。在存在1％HMW和1×10-7M胰岛素的情况下，将提取物加入原代培养的鼠的肝细胞中，在这些细胞中，提取物促进DNA和蛋白质合成的功效是通过细胞摄取3H-胸苷和14C-缬氨酸来检测的。
结果在存在胰岛素和HMW的情况下，将冬虫夏草菌丝体的热水提取物加入原代培养的鼠肝细胞中后，明显地促进了DNA和蛋白质在这些细胞中的合成。结果示于图4-1和图4-2。但是，在胰岛素和HMW不存在时，没有检测到提取物的任何显著的活性。在只存在胰岛素时，也没有检测到提取物的活性。从这些结果，我们相信提取物在存在胰岛素和HMW的情况下，促进了DNA和蛋白质在细胞中的合成。
实施例5在制造例1中制备的冬虫夏草MF-20008菌丝体的热水提取物对鼠施用，并检测提取物对延缓鼠胃酸分泌的功效。
在这个试验中，使用的是健康的雄性SD鼠(日本查尔斯河公司)；购买5周龄的鼠并预饲养4天，然后用于本试验。
这些鼠被分成两组，试验组和对照组，每组有4只鼠。试验组的鼠服用的是冬虫夏草菌丝体的热水提取物。
冬虫夏草菌丝体的热水提取物溶于纯水(批号YLE9566，和光纯药工业公司生产)，浓度为100毫克/毫升，以配制成让鼠服用的试验材料，并将它们冷冻、保存。
纯水或预定浓度的试验材料每天上午9点通过金属胃探针从口给鼠服用。第12天，在幽门被结扎后，将其注射进十二指肠。组别动物数施用用 剂量 施用途径 施用时间(只) 物质 (mg/kg/day) 表对照组4 纯水 -口服 第1至11天冬虫夏草 4 试验材200 口服 第1至11料天胃液的分泌用下述方法检测。
鼠被停止喂食17小时。之后，当它们被麻醉时，剖开腹腔并结扎幽门。4小时后，用颈椎脱位处死鼠，取出它们的胃，收集残留其中的胃液。这样收集的胃液用3,000rpm的速度离心5分钟。检测胃液的体积(毫升/鼠)、胃液的酸度(mEq/升)及其pH值。最高至pH7.0的酸度用一个使用0.01N的氢氧化钠的pH计测量。从这样测量出的胃液的体积和其酸度计算每小时释放的酸量(μEq/小时)。结扎幽门后立即向十二指肠注射试验材料。
结果示于图5。
实施例6将水加入100克从制造例1中获得的热水提取物粉末、150克糖、15克蜂蜜、1克抗坏血酸、0.5克柠檬酸和适量的香味剂配制成总共1公斤的溶液。将其在95℃灭菌20分钟，然后在无菌条件下分装到小瓶中，每瓶100毫升。这样，饮食品型的保健饮料就制备好了。
实施例7将去离子水加入200克从制造例1中获得的热水提取物粉末的20％液体溶液、5克生育酚乙酯、10克硝酸硫胺、20克尼克酰胺、50克无水咖啡因以及适量的安息香酸和香味剂配制成总共30升的溶液。
灭菌后，在无菌条件下分装到小瓶中，每瓶30毫升。于是，药品型的保健饮料就制备好了。
实施例8(1)制造例1中制备的物质 50克(2)乳酸90克(3)玉米淀粉29克(4)硬脂酸镁1克(1)、(2)和(3)(17克)与(3)(7克)配制成的膏体混合并粒化。(3)(5克)和(4)加入这样获得的颗粒并充分混合，用压片机将所得的混合物在压力下压成片，得到1000片，每片包含活性成分(1)50毫克。
本发明的优点本发明提供了一种从天然物质得到的组合物，它极其稳定，并具有适度的强心、降低血压、镇咳和抗疲劳的功效。虽然它是从天然物质获得的，但是仍然有可能通过培养法稳定地、工业化地提供该组合物。
在条例13-2下保藏微生物的参考1.MF-20008a.保藏该微生物的授权机构的名称和地址名称通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所地址 305日本茨城县つくぼ市东1丁目1番3号b.a中机构的保藏日期1994年6月29日c.a中机构给出的保藏号FERM BP-5149
权利要求
1.含有冬虫夏草的培养菌丝体热水提取物的组合物。
2.权利要求1中的组合物，其特征在于所使用的是冬虫夏草MF-20008。
3.权利要求1或2中的组合物，其特征在于热水提取物是通过用85至100℃，优选的是从90至95℃的热水提取培养菌丝体获得的。
4.权利要求1至3中任一权项中的组合物，其特征在于热水提取物包含热水提取物本身、从提取物中除去提取残留物所获得的液体部分、它(它们)的浓缩物、糊状物、稀释物和/或干燥物。
5.权利要求1至4中任一权项中的组合物，该组合物是药品型的和/或饮食品型的。
6.权利要求5中的药品型的组合物，该组合物是强心剂、降压剂、镇咳剂或抗疲劳剂。
7.权利要求5中的饮食品型的组合物，该组合物是保健饮料。
全文摘要
一种包含培养的冬虫夏草菌丝体热水提取物的保健组合物。它是一种非常安全的口服保健组合物，并具有出色的强心、降低血压和抗疲劳的功效。
文档编号A61P37/00GK1151699SQ9519389
公开日1997年6月11日 申请日期1995年6月29日 优先权日1994年6月30日
发明者竹友直生, 角尾彰信, 伊藤裕之 申请人:明治乳业株式会社