编码由hla-a2提呈的肿瘤排斥抗原的分离的核酸分子的制作方法

专利名称：编码由hla-a2提呈的肿瘤排斥抗原的分离的核酸分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码一种肿瘤排斥抗原前体的核酸分子，更具体地，本发明涉及一种基因，其编码的肿瘤排斥抗原前体被特别加工成至少一种由细胞表面的HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原。背景和现有技术哺乳动物免疫系统识别外来物质并与之反应的过程是一个非常复杂的过程，这一系统的一个重要方面是T细胞应答。应答需要T细胞识别被称为人白细胞抗原(“HLA”)或主要组织相容性复合物(“MHCs”)的细胞表面分子与肽的复合物并与之相互作用，所述的肽由也携带HLA/MHC分子的细胞从较大分子加工而来，这一方面参见Male等，高级免疫学(J.P.Lipincott Company，1987)，特别是第6-10章。T细胞与HLA/肽复合物的相互作用是受限制的，其需要特异于一种HLA分子和一种肽的特定组合的T细胞。如果不存在特异的T细胞，即使存在其配体复合物也不会有T细胞应答，类似地，如果不存在特异的复合物，即使存在T细胞也不会有T细胞应答。这一机制存在于免疫系统对外来物质的应答中，存在于自身免疫疾病中，以及存在于对细胞异常的应答中。最近，许多工作集中在蛋白质被加工成HLA结合肽的机制上，这一方面的工作参见Barinaga，科学257880(1992)；Fremont等，科学257919(1992)；Matsumura等，科学257927(1992)；Latron等，科学257964(1992)。
在癌症中也涉及T细胞识别细胞异常的机制，例如，1992年5月22日申请、1992年11月26日公开的PCT申请PCT/US92/04354(引入本文作参考)中公开了一个基因家族，其被加工成肽，而后者又表达在细胞表面上，导致肿瘤细胞被特异的CTL溶解。据说，这些基因编码“肿瘤排斥抗原前体”或称“TRAP”分子，由其衍生的肽被称为“肿瘤排斥抗原”或称“TRAs”。关于这一家族基因的更多资料参见Traversari等，免疫遗传学35145(1992)；van der Bruggen等，科学2541643(1991)，另外还可参见美国专利5,342,774，引入本文作参考。
美国专利申请系列号938,334(引入本文作参考)教导了由HLA-A1分子提呈的九肽，该申请指出，如果已知特定肽对特定HLA分子的特异性，则可以预期一特定的肽与一种HLA分子结合而不与其它HLA分子结合，这一点很重要，因为不同的个体拥有不同的HLA表型。其结果是，尽管鉴定一特定肱是一特异HLA分子的结合配体具有诊断和治疗用途，但是这些仅与具有该特定HLA表型的个体相关。在这个领域仍需要进一步的工作，因为细胞异常并非局限于一个特定的HLA表型，并且定向治疗需要一些异常细胞表型的知识。
在1993年1月22日申请的美国专利申请系列号008,446(引入本文作参考)中，公开了MAGE-1表达产物被加工成第二个TRA的事实，该第二个TRA是由HLA-C*1601分子提呈的。这篇文献指出一个给定的TRAP可以产生一系列TRAs。
在1992年12月22日申请的美国专利申请系列号994,928(引入本文作参考)中，公开了酪氨酸酶是一种肿瘤排斥抗原前体。这一文献披露由某些正常细胞(例如黑素细胞)产生的分子在肿瘤细胞中被加工成由HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原。
如上所述的美国专利申请系列号32,978报道了一种编码与以前不同的肿瘤排斥抗原前体的核酸分子。该发明的TRAP被加工成至少一种由HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原；然而序列分析表明该发明的TRAP不是酪氨酸酶也不与酪氨酸酶相关。因此，该母申请涉及一种编码一肿瘤排斥抗原前体或称“TRAP”分子的核酸分子，这一“TRAP”分子不是酪氨酸酶。另外，该母申请的TRAP被加工成至少一种被HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原或称“TRA”，该TRA不与酪氨酸酶相关，由该发明的TRAP衍生的其它TRA可以由其它HLA分子提呈。
在上述母申请之后发表的一篇论文中，Kawakami等(美国国家科学进展913513-3519(1994))也鉴定出该母申请的主题是编码黑素瘤抗原的基因。
进一步的工作表明编码此TRAP的基因(以下称为“Melan-A”)约18kb，含5个外显子。其似乎只在黑素瘤和黑素细胞中表达，因此可作为这些细胞的标志。
本发明及其各个方面将在下面加以描述。附图简述

图1A示出用CTL克隆I/95对LB39-MEL、K562和LB39母细胞进行的细胞溶解实验的结果。
图1B示出用CTL克隆I/95对SK23-MEL和SK29-MEL进行的溶解。
图2给出用CTL I/95对各种细胞系进行的TNF释放分析的结果。
图3A示出当用CTL克隆I/95测试时由不同细胞系包括转染子诱导的TNF释放。
图3B给出使用CTL克隆IVSB的TNF释放数据。
图3C示出使用CTL克隆10/196的TNF释放。
图4给出用衍生于本文所述的核酸分子的寡核苷酸探针进行的聚合酶链反应(PCR)所测试的组织、细胞系和肿瘤中Melan A基因“AaGlc124”的表达图式。
图5示意性示出Melan-A基因的结构，其中外显子用加粗黑框表示，限制性位点也绘出。点划线代表基因的未测序部分。优选实施方案的详细描述实施例1使用标准方法从取自患者LB39的黑素瘤细胞建立一个黑素瘤细胞系“LB-39-MEL”，细胞系建立后，取出一份细胞样品进行照射以使其变成非增殖性。随后用照射后的细胞分离特异于其的胞溶性T细胞(“CTL”)。
从患者LB39提取外周血单核细胞(“PBMC”)样品并与照射后的黑素瘤细胞接触，观察混合物中黑素瘤细胞的溶解，如果溶解则表明样品中存在特异于由黑素瘤细胞提呈的肽和HLA分子的复合物的CTL。
所采用的溶解分析是Herin等，Int.J.Cancer 39390-396(1987)所述的铬释放分析(该篇文献引入本文作参考)。在此描述该分析方法，体外培养靶黑素瘤细胞，然后以107细胞/ml重悬于补加10mM HEPES和30％FCS的DMEM中，并在37℃与200μCi/ml Na(51Cr)O4保温45分钟。标记的细胞用补加10mM HEPES的DMEM洗三次，然后重悬于补加10mM HEPES和10％FCS的DMEM中，而后将每份含103细胞的100μl分配到96孔微滴板上。加入含在100μl相同培养基中的PBL样品，分析以双份进行。在100g离心板4分钟，并在80％CO2气氛中于37℃培养板4小时。
再次离心板，并以100μl每份收集上清并计数，如下计算51Cr释放百分比 其中ER是观察到的实验51Cr释放，SR是通过在200μl培养基中保温103个标记细胞而测得的自发释放，MR是通过向靶细胞中加入100μl 0.3％ Triton X-100而获得的最大释放。
将那些显示高CTL活性的单核血样品通过有限稀释扩增并克隆，并用相同方法再次筛选，由此分离出CTL克隆LB39-CTL I/95。
采用相同方法测试靶K562细胞和自身PHA诱导的T细胞母细胞，结果示于图1A，其表明这一CTL克隆识别并溶解黑素瘤细胞系，但是不识别和溶解K562或T细胞母细胞。随后以上述相同方式用黑素瘤细胞系SK23-MEL和SK29 MEL测试这一CTL，LB39-CTLI/95，来自这两个细胞系的细胞也被溶解，这两个细胞系均分离自如LB39一样的被分型为HLA-A2的患者。由此提示CTL克隆LB39-CTL I/95识别由HLA-A2提呈的抗原。实施例2进行进一步的研究以确定当LB39-CTL I/95与靶细胞接触时是否也产生肿瘤坏死因子，所用方法如Traversari等在免疫遗传学35145-152(1992)中所述，该文献引入本文作参考。简而言之，在培养基中将CTL细胞系样品与感兴趣的靶细胞样品混合，24小时后，从培养物中取上清，然后在TNF敏感性WEHI细胞上测试。除了上述的LB39-MEL和SK23-MEL以外，还测试了另一HLA-A2细胞系，即SK29-MEL.1，一个HLA-A2缺失变异株，即SK29-MEL.1.22，和一个非HLA-A2细胞系，即MZ2-MEL，其是HLA-A1阳性。
图2示出结果，结果是以暴露于上清后WEHI细胞死亡的百分比表示，这些结果表明HLA-A2缺失变异株SK29-MEL.1.22不能刺激CTL克隆，由此证实被LB39-CTL-I/95识别的抗原是由HLA-A2提呈的。实施例3实施例2的结果表明SK MEL29.1提呈感兴趣的靶抗原，因此，其用作总mRNA的来源以制备cDNA文库。
从该细胞系中分离总RNA，用公知的技术使用寡dT结合试剂盒分离mRNA，一旦得到mRNA，再次使用相同的方法将其转录成cDNA。然后，根据厂商指导，将cDNA与EcoRI接头连接并克隆到质粒pcDNA-I/Amp的EcoRI位点，随后将重组质粒电穿孔转入JM101E.coli(电穿孔条件25微法拉弟，2500V，1次脉冲)。
用氨苄青霉素(50μg/ml)选择转染的细菌，并将其分成800个集合体，每个集合体含100个克隆。每个集合体代表50个不同的cDNA，因为分析表明约50％的质粒含有一个插入片段。将每个集合体扩增至饱和，根据Maniatis等(分子克隆实验手册，冷泉港，纽约，1982)所述方法通过碱裂解、乙酸钾沉淀(不用苯酚抽提)分离质粒DNA。实施例4如实施例3所述制备文库后，将cDNA转染入真核细胞，本文所述的转染均按双份进行。将含在补加10％胎牛血清的Dulbecco氏改良Eagles培养基(“DMEM”)中的COS-7细胞样品以15000个细胞/孔接种到组织培养平底微孔中，于37℃将细胞培养过夜，除去培养基，代之以30μl/孔的含10％Nu血清、400μg/ml DEAE-葡聚糖、100μM氯喹、100ng质粒pcDNA-I/Amp-A2和100ng上述cDNA文库集合体的DNA的DMEM培养基，质粒pcDNA-I/Amp-A2含有来自SK29-MEL的HLA-A2基因。在37℃培养4小时后，除去培养基，代之以50μl含10％DMSO的PBS。两分钟后除去此培养基并用补加10％FCS的200μl DMEM。
此次替换培养基后，将COS细胞在37℃培养48小时，然后弃去培养基，并加入含在100μl补加25U/ml IL-2并含10％浓集人血清的Iscove氏培养基中的1000个CTL I/95细胞。24小时后取出上清，如Traversari等(文献同上，引入本文作参考)所述用WEHI细胞分析测定TNF含量。
在800个所测的集合体中，有99％刺激TNF释放，上清中的TNF浓度为3-6pg/ml。有2个集合体的TNF产率超过8pg/m1，其平行孔的产率也超过8pg/ml。实施例5选择上清中显示高TNF产率的2个集合体进行进一步研究。具体地，克隆细菌，每个集合体测试800个细菌，从细菌中抽提质粒DNA，以上述相同方式转染一新的COS细胞样品，再次测试细胞对LB39-CTL克隆I/95的刺激。发现1个阳性克隆，称为AaG1c124。通过用来自阳性克隆的cDNA和HLA-A2基因一起转染的COS细胞、仅用HLA-A2转染的COS细胞以及细胞系SK29-MEL的对比试验得到了令人信服的证据表明转染细胞被CTL识别。如上所述，在WEHI细胞上测试CTL上清中的TNF释放，用MTT测定存活WEHI细胞的光密度。图3A示出了用CTL克隆I/95得到的结果。
进一步的测试表明在转染细胞中由HLA-A2提呈的肽不同于以前观察到的肽，即酪氨酸酶衍生的肽。CTL克隆IVSB特异于酪氨酸酶衍生的肽和HLA-A2的复合物。当将这一CTL克隆与用AaG1c124和HLA-A2转染的细胞接触时，TNF释放很低，如图3B所示。实施例6将阳性克隆的cDNA用现有技术公知的技术测序。序列检索揭示该质粒插入片段与已知的基因或蛋白质无同源性。SEQ ID NO1是代表SEQ ID NO2的mRNA转录本的cDNA序列，其是完整肿瘤排斥抗原前体编码分子，即基因组克隆。该cDNA序列在75-431位核苷酸处有一大的开放读框。
SEQ ID N02的完整核苷酸序列尚未推导出，但大多数已推导出。未解码的区域在9422-9456位用35个“N”表示，其长度大约为4.7kb-5.3kb。因为核苷酸序列来源于核酸分子，所以未提供进一步的信息。实施例7以分离CTL克隆LB39-CTL I/95相同的方式，使用PBMC样品和由患者SK29(AV)开发的黑素瘤细胞系分离CTL克隆SK29-CTL 10/196。以实施例5所示相同的方式测试这一新的细胞系，检测结果由图3C示出，表明由AaG1c124编码的肿瘤排斥抗原(以下称为抗原“LB39-Aa”)也被这一CTL克隆识别。这些实验提示其它患者可以并且确实产生特异于这一抗原的CTL。
从所述的序列设计寡核苷酸探针并用于标准聚合酶链反应以确定该基因在正常组织、肿瘤以及肿瘤细胞系中的表达，结果示于图4，表明在所测试的正常组织中只有黑素细胞表达该基因。请注意在所测试的所有肿瘤样品和/或黑素瘤细胞系中的表达。实施例8上述的cDNA长度为675个碱基对，其用作针对黑素瘤细胞系SK29-MEL的总RNA的探针。根据Van den Eynde等，J.Exp.Med.1731373(1991)(引人本文作参考)所述进行Northern印迹，鉴定出一条约0.75kb的带。而后，使用上述相同的方法学，用675碱基对长的序列(SEQ ID NO1)探查SK29-MEL衍生的cDNA以筛查cDNA。鉴定出一个760bp的克隆，其序列为SEQ ID NO3。这一序列与SEQ ID NO1的区别在于其5’端有83个另外的碱基对。实施例9随后，分离对应于上述cDNA的基因。为此，根据DePlaen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852274(1988)(引入本文作参考)的方法学，使用来自黑素瘤细胞系LB33-MEL的DNA在粘粒c2RB中构建人总DNA的基因组文库(700000个独立的粘粒)。从22组70000个粘粒中分离DNA并进行标准Southern印迹分析，所用的探针为32P标记的SEQ IDNO1。探针与9组杂交，对产生最强杂交带的组进行亚克隆，随后再次使用该标记的cDNA与之进行菌落杂交。对产生最强信号的粘粒进行测序，所用引物是从该cDNA序列推导出的如下序列OPC 695′ GTA AGA GTG GCC GTG CCC CT 3′(SEQ ID NO4)OPC 705′5′CCA TCA AGG CTC TGT ATC CAT TC′(SEQ ID NO5)OPC 715′ATA AAA GTC TTC ATG TTG GCA CTC 3′(SEQ ID NO6)OPC 725′ACA GGT TCA CAG TTT TTC TCT TGA AG 3′(SEQ ID NO7)OPC 735′GTA GGT CCG CTA GCA GTA C 3′(SEQ ID NO8)OPC 755′AGA AGC AGT CTT CAT ACA CGC GG 3′(SEQ ID NO9)测序工作揭示出一个1512bp的第一内含子，一个5kb的第二内含子，第三内含子的部分序列以及一个1462bp的第四内含子。
在进一步的实验中，用EcoRI和BglII消化粘粒DNA，已从序列中确定在基因中存在这些限制性位点。以每个已测序的内含子为基础制备寡核苷酸，用32p标记并用在上述消化片段的标准Southern印迹分析实验中。这一工作导致一个7kb的EcoRI片段与来自内含子3末端的32P标记的寡核苷酸杂交。该内含子的预计大小为9.5kb，因此Melan-A的总长度约为18.5kb，这一预计结果来自下述若干资料，即(i)在Southern印迹研究中，该寡核苷酸与7kb EcoRI片段的两端均可结合；以及(ii)该基因的内含子3的2.5kb已被测序位于最下游的EcoRI位点的上游。实施例10使用反转录和聚合酶链反应(PCR)分析了Melan-A的表达模式，为进行此项工作，根据Davis等(Basic Methods in Molecular Biology，1986，纽约，Elsevier，130页)所述从肿瘤样品中分离总RNA或从黑素细胞中获得总RNA。
反转录使用寡(dT)引物，每个样品使用2μg总RNA。相应于100ng总RNA(相当于104个细胞)的cDNA样品通过PCR在63℃扩增35个循环，所用引物为5’-ACTGCTCATCGGCTGTTG-3’(有义)(SEQ ID NO10)5’-TCAGCCATGTCCAGGTG-3’ (反义)(SEQ ID NO11)。这些引物位于Melan-A基因(SEQ ID NO2)的外显子3和5内，用于排除任何基因组DNA污染物的扩增。PCR反应物的小份在1％琼脂糖凝胶上电泳，用溴乙锭染色。为确保无降解的RNA，测试cDNA产物中是否存在人β反应。
结果示于下表1中，在21个黑素瘤细胞系中有12个是阳性的。而对于正常组织，只有黑素细胞是阳性的。皮肤活组织检查是阳性的，据推测这是由于其有高于通常比例的黑素细胞。表1 Melan-A基因的表达阳性样品的比例正常组织黑素细胞2/2皮肤2/3肝脏0/1肾脏0/1心脏0/1前列腺 0/1乳腺0/4卵巢0/1睾丸0/2肾上腺 0/3肺 0/2胎脑0/1小脑0/1黑质0/1肿瘤黑素瘤样品 26/26黑素瘤细胞系 12/21乳腺癌样品 0/5肉瘤样品0/5非小细胞肺癌样品0/5肾癌样品0/4结肠癌样品 0/4前述实验描述了以基因组DNA、cDNA和mRNA形式存在的编码肿瘤排斥抗原前体即“TRAP”分子的分离的核酸分子。这些核酸分子编码的蛋白质分子在细胞内被加工生成至少一种由HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原，或称“TRA”。尽管以前已观察到HLA-A2分子提呈酪氨酸酶衍生的肽，但是本发明的核酸分子并不编码酪氨酸酶，TRA也不是酪氨酸酶衍生的。
本发明因此涉及编码肿瘤排斥抗原前体或称“TRAP”的分离的核酸分子，条件是TRAP不是酪氨酸酶，该核酸分子例如是但不限于SEQ ID NOS1、2和3。所编码的TRAP被加工成至少一种由细胞表面的HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原，或称“TRA”。本发明的核酸分子可以是例如基因组DNA(“gDNA”)、互补DNA(“cDNA”)或者RNA。本发明还涉及与上述分子互补的分离的核酸分子。本发明的特别优选的形式是含有SEQ ID NOS1、2和3所示序列的分子。
本发明还包括含有与一启动子可操作连接的本发明的核酸分子的载体，载体还包括编码HLA-A2的分子。由于这两个分子即HLA-A2和TRAP对于产生胞溶性T细胞应答是必须的，所以本发明还涉及编码TRAP和HLA-A2的核酸分子以独立的部分在例如试剂盒中存在的表达系统。本发明还包括由本文所述的载体转染的细胞系，其为原核细胞如大大肠杆菌，或真核细胞如中国仓鼠卵巢细胞(“CHO”)或COS细胞。
如所述，TRA和HLA-A2的复合物激发胞溶性T细胞应答，所以这种肿瘤排斥抗原和HLA-A2分子的分离的复合物也包括在本发明内，正如由前述的核酸序列编码的分离的肿瘤排斥抗原前体也包括在本发明内。
本文所述的本发明具有许多用途，其中一些已有描述。首先，对由HLA-A2分子特别提呈的肿瘤排斥抗原的鉴定以及对编码其相应肿瘤排斥抗原前体的核酸分子的鉴定使得本领域技术人员可以诊断以TRAP表达为特征的疾病，例如黑素瘤。这些方法涉及确定TRAP基因的表达和/或由其衍生的TRA，如由HLA-A2提呈的TRA，这些可以通过使用由所述序列或其片段作为探针、引物等来实现。其他的TRA也可由本发明的TRAP衍生并由不同的HLA分子提呈。在前一种情况，这种鉴定可通过任何标准的核酸鉴定分析来进行，包括聚合酶链反应，或者使用标记的杂交探针分析。在后一种情况，特别优选使用TRA和HLA复合物的结合配体如抗体来分析。
对TRAP基因的分离也使得可以分离TRAP分子本身，特别是含有SEQ ID NO1的氨基酸序列的TRAP分子。这些分离的分子，当以TRA形式、或者TRA和HLA如HLA-A2的复合物形式存在时，可以与如佐剂等材料联合使用以生产用于治疗以TRAP分子的表达为特征的疾病的疫苗。另外，疫苗也可从在其表面存在TRA/HLA复合物的细胞中制备，这些细胞如非增殖性癌细胞、非增殖性转染子等。在细胞用作疫苗的所有情况下，这些细胞可以是用编码导致CTL应答必须的一种或两种组分的编码序列转染的细胞，或者是未经转染而表达两种分子的细胞。另外，也可使用TRAP分子、其相关的TRA以及TRA和HLA的复合物通过本领域熟知的标准技术生产抗体。
当术语“疾病”用于本文时，是指任何有肿瘤排斥抗原前体表达的病理状态，这种疾病的一个例子是癌症，特别是黑素瘤。
本申请披露的治疗和一些诊断方法是以患者的导致TRA提呈细胞如HLA-A2细胞溶解的免疫系统的应答为前提的。其中一种方法是将特异于该复合物的CTL给予具有所述表型异常细胞的患者。体外开发这种CTL属于本领域技术人员的技能范畴。具体而言，将细胞样品如血细胞与提呈该复合物并能激发特异CTL增殖的细胞接触，靶细胞可以是转染子如上述类型的COS细胞。这些转染子的细胞表面存在所需的复合物，并且当与感兴趣的CTL结合时可以刺激其增殖。如本文所用的COS细胞和其他合适的宿主细胞的来源很广泛。
以下详细描述称为过继转移的治疗方法学(Greenberg，J.Immunol.136(5)1917(1986)；Reddel et al.，Science 257238(7-10-92)；Lynch et al.，Eur.J.Immunol.211403-1410(1991)；Kast et al.，Cell 59603-614(1l-17-89))，将存在所需复合物的细胞与CTL结合使特异于其的CTL增殖，随后将增殖的CTL给予患有细胞异常的患者，该细胞异常的特征是一定的异常细胞存在特定的复合物。CTL随后溶解异常细胞，由此达到希望的治疗目的。
上述治疗假定患者的至少一些异常细胞存在HLA/TRA复合物，这一点可很容易地确定，现有技术非常熟悉鉴定存在特定的HLA分子的细胞的方法，以及如何鉴定表达含所述序列的DNA的细胞的方法。分离到这种细胞后，可将该细胞与患者异常细胞样品一起用于体外检测溶解。如果观察到溶解，则在这种治疗中使用特异性的CTL可以减轻与该异常细胞相关的症状。一种较简单的方法学是使用标准分析检查异常细胞的HLA表型，并通过使用例如PCR的扩增检测表达。这种诊断方法不必也不与前述的治疗方法相联系，因为诊断方法本身即是有用的。
根据本发明，过继转移不是唯一的治疗形式。还可使用各种方法在体内激发CTL，上面已描述了其中一种方法，即使用表达复合物的非增殖性细胞，在这一方法中使用的细胞可以是正常表达复合物的细胞如照射过的黑素瘤细胞，或者用提呈复合物必须的一个或两个基因转染的细胞。Chen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88110-114(1991年1月)论述了这一方法，示出了在一个治疗方案中使用表达HPVE7肽的转染的细胞。可以使用各种细胞类型，类似地，也可使用携带一或两种感兴趣基因的载体，特别优选的是病毒或细菌载体。在这些系统中，感兴趣的基因由例如疫苗病毒或细菌BCG携带，这些材料确实“感染”宿主细胞。所得到的细胞提呈感兴趣的复合物并被自身CTL识别，随后增殖。通过将肿瘤排斥抗原或前体本身与促进其掺入提呈感兴趣的HLA分子的HLA-A2提呈细胞的佐剂结合可以达到类似的效果。TRAP被加工以产生HLA分子的肽配体，而不需进一步的加工TRA即被提呈。
本发明的其他方面对于本领域熟练技术人员是清楚的，不需在此重复。
已采用的术语和表达方式是用作描述的术语而非限制性的，使用这些术语和表达方式并非意在排除所示和所述的特征或其部分的任何等价物，应理解的是在本发明范围内的各种改动是可能的。(1)一般信息(i)申请人文森特·布里夏尔，阿兰·范佩尔，卡蒂亚·特拉韦尔萨里托马斯·韦尔费尔，皮埃尔·库利耶，蒂尔瑞·博恩-法勒尔艾蒂安·德普莱恩(ii)发明名称编码被加工成至少一种由HLA-A2提呈的肿瘤排斥抗原的肿瘤排斥抗原前体的分离的核酸序列(iii)序列数11(iv)联系地址(A)收信人Felfe & Lynch(B)街道805 Third Avenue(C)城市纽约市(D)州纽约州(E)国家美国(F)邮编10022(v)计算机可读形式(A)媒介类型软盘，5.25英寸，360kb存储容量(B)计算机IBM PS/2(C)操作系统PC-DOS(D)软件Wordperfect(vi)本申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(vi)本申请数据(A)申请号08/272,351(B)申请日1994年7月8日(vii)在先申请数据(A)申请号08/032,978(B)申请日1993年3月18日(viii)律师/代理人信息(A)姓名Hanson，Norman D.
(B)注册号30，946(C)案号/文档号LUD 5377.1(ix)电讯信息(A)电话(212)688-9200
(B)传真(212)838-3884(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度676碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO1TCTTCATACA CGCGGCCAGC CAGCAGACAG AGGACTCTCA TTAAGGAAGG TGTCCTGTGC 60CCTGACCCTA CAAGATGCCA AGAGAAGATG CTCACTTCAT CTATGGTTAC CCCAAGAAGG 120GGCACGGCCA CTCTTACACC ACGGCTGAAC AGGCCGCTGG GATCGGCATC CTGACAGTGA 180TCCTGGGAGT CTTACTGCTC ATCGGCTGTT GGTATTGTAG AAGACGAAAT GGATACAGAG 240CCTTGATGGA TAAAAGTCTT CATGTTGGCA CTCAATGTGC CTTAACAAGA AGATGCCCAC 300AAGAAGGGTT TGATCATCGG GACAGCAAAG TGTCTCTTCA AGAGAAAAAC TGTGAACCTG 360TGGTTCCCAA TGCTGCAGGT GCTTATGAGA AACTCTCTGC AGAACAGTCA GGACCACCTT 420ATTCACCTTA AGAGCCAGCG AGACACCTGA GACATGGCTG AAATTATTTC TCTCACACTT 480TTGCTTGAAT TTAATACAGA CATCTAATGT TCTCCTTTGG AATCCTGTAG GAAAAATGCA 540AGCCATCTCT AATAATAAGT CAGTGTTAAA ATTTTAGTAG GTCCGCTAGC AGTACTAATC 600ATGTGAGGAA ATGATGAGAA ATATTAAATT GGGAAAACTC CATCAATAAA TGTTGCAAAT 660GCATAGTAAA AAAAAA 676(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度13585碱基对(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑线性(ix)特征(D)其他信息在9421-9456位，“Ns”指4.7-5.3kb的未测序部分(xi)序列描述SEQ ID NO2CCGTCAGAAA 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NO3的信息(i)序列特征(A)长度760碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO3CCGTCAGAAA TCTAAACCCG TGACTATCAT GGGACTCAAA ACCAGCCCAA AAAATAAGTC 60AAAACGATTA AGAGCCAGAG AAGCAGTCTT CATACACGCG GCCAGCCAGC AGACAGAGGA 120CTCTCATTAA GGAAGGTGTC CTGTGCCCTG ACCCTACAAG ATGCCAAGAG AAGATGCTCA 180CTTCATCTAT GGTTACCCCA AGAAGGGGCA CGGCCACTCT TACACCACGG CTGAACAGGC 240CGCTGGGATC GGCATCCTGA CAGTGATCCT GGGAGTCTTA CTGCTCATCG GCTGTTGGTA 300TTGTAGAAGA CGAAATGGAT ACAGAGCCTT GATGGATAAA AGTCTTCATG TTGGCACTCA 360ATGTGCCTTA ACAAGAAGAT GCCCACAAGA AGGGTTTGAT CATCGGGACA GCAAAGTGTC 420TCTTCAAGAG AAAAACTGTG AACCTGTGGT TCCCAATGCT GCAGGTGCTT ATGAGAAACT 480CTCTGCAGAA CAGTCAGGAC CACCTTATTC ACCTTAAGAG CCAGCGAGAC ACCTGAGACA 540TGCTGAAATT ATTTCTCTCA CACTTTTGCT TGAATTTAAT ACAGACATCT AATGTTCTCC 600TTTGGAATGG TGTAGGAAAA ATGCAAGCCA TCTCTAATAA TAAGTCAGTG TTAAAATTTT 660AGTAGGTCCG CTAGCAGTAC TAATCATGTG AGGAAATGAT GAGAAATATT AAATTGGGAA 720AACTCCATCA ATAAATGTTG CAATGCATGA TAAAAAAAAA760(2)SEQ ID 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(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO5CCATCAAGGC TCTGTATCCA TTC 23(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度24碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO6ATAAAAGTCT TCATGTTGGC ACTC 24(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度26碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO7ACAGGTTCAC AGTTTTTCTC TTGAAG 26(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO8GTAGGTCCGC TAGCAGTAC 19(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征
(A)长度23碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO9AGAAGCAGTC TTCATACACG CGG 23(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO10ACTGCTCATC GGCTGTTG18(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑线性(xi)序列描述SEQ ID NO11TCAGCCATGT CCAGGTG 17
权利要求书按照条约第19条的修改1、编码一种肿瘤排斥抗原前体的分离的核酸分子，或者与编码一种肿瘤排斥抗原前体的核酸分子互补的分离的核酸分子，该肿瘤排斥抗原前体被加工成由HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原，其中所述的分离的核酸分子为基因组DNA。
2、权利要求1的分离的核酸分子，其中所述的核酸分子编码所述的肿瘤排斥抗原前体。
3、权利要求1的分离的核酸分子，包括SEQ ID NO2的核苷酸序列。
4、由SEQ ID NO3的核苷酸序列组成的分离的核酸分子。
5、包括与一启动子可控连接的权利要求1或8的核酸分子的重组表达载体。
6、权利要求5的重组表达载体，包括与启动子可控连接的SEQ ID NO2或SEQ IDNO3的核苷酸序列。
7、用权利要求1的分离的核酸分子转染或转化的原核或真核细胞系。
8、权利要求7的原核或真核细胞系，其中所述的核酸分子包括SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核苷酸序列。
9、用载体转染或转化的权利要求7的原核或真核细胞系。
10、权利要求9的原核或真核细胞系，其中所述的载体包括SEQ ID NO2或SEQ IDNO3的核苷酸序列。
11、用编码HLA-A2的核酸分子共转染或共转化的权利要求9的原核或真核细胞系。
12、用编码HLA-A2的核酸分子共转染或共转化的权利要求8的原核或真核细胞系。
13、权利要求5的重组载体，进一步包括编码HLA-A2的核酸分子。
14、治疗患有以表达一种肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病的患者的方法，该肿瘤排斥抗原前体被加工成由HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原，所述方法包括给予所述患者足以减轻所述疾病的量的胞溶性T细胞，该胞溶性T细胞特异于所述肿瘤排斥抗原和HLA-A2分子的复合物并溶解提呈所述复合物的细胞。
15、治疗患有以表达一种肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病的患者的方法，该肿瘤排斥抗原前体由包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核苷酸序列的核酸分子编码，所述方法包括给予所述患者足以减轻所述疾病的量的胞溶性T细胞，该胞溶性T细胞特异于HLA分子和所述肿瘤排斥抗原前体衍生的肿瘤排斥抗原的复合物。
16、治疗患有以表达一种肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病的患者的方法，该肿瘤排斥抗原前体被加工成由HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原，所述方法包括给予所述患者一种激发针对所述肿瘤排斥抗原和HLA-A2分子的复合物的免疫应答的制剂，该制剂的量应足以激发针对提呈所述复合物的细胞的所述应答。
17、治疗患有以表达一种肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病的患者的方法，该肿瘤排斥抗原前体由包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核苷酸序列的核酸分子编码，所述方法包括给予所述患者一种激发针对HLA分子和所述肿瘤排斥抗原前体的复合物的免疫应答的制剂，该制剂的量应足以激发针对提呈所述复合物的细胞的所述应答。
18、诊断以表达一种肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病的方法，该肿瘤排斥抗原前体被加工成与HLA-A2分子形成复合物的肿瘤排斥抗原，所述方法包括将取自患者的样品与特异于所述复合物的制剂接触，并测定所述复合物与所述制剂之间的相互作用以确定所述疾病。
19、诊断以表达一种肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病的方法，该肿瘤排斥抗原前体由具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的序列的核酸分子编码，所述方法包括将取自患者的样品与特异于所述序列或其表达产物的抗原接触，并测定所述制剂与所述序列或所述表达产物之间的相互作用以确定所述疾病。
20、鉴定样品中肿瘤排斥抗原前体Melan-A的表达的方法，包括将所述样品与至少一种由核苷酸组成的探针接触，其中所述的至少一种探针与编码Melan-A的核苷酸序列杂交，确定杂交作用以确定Melan-A在所述样品中的表达。
21、权利要求20的方法，包括聚合酶链反应。
22、权利要求20的方法，其中所述的至少一种探针包括SEQ ID NO10或SEQ IDNO11。
23、权利要求21的方法，包括将所述样品与SEQ ID NO10和SEQ ID NO11接触。
24、分离的核酸分子，选自由SEQ ID NO10和SEQ ID NO11组成的一组。
25、由权利要求2的核酸分子编码的分离的肿瘤排斥抗原前体。
权利要求
1.编码一种肿瘤排斥抗原前体的分离的核酸分子，或者与编码一种肿瘤排斥抗原前体的核酸分子互补的分离的核酸分子，该肿瘤排斥抗原前体被加工成由HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原。
2.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述的核酸分子编码所述的肿瘤排斥抗原前体。
3.权利要求2的分离的核酸分子，其中所述的核酸分子是DNA。
4.权利要求3的分离的核酸分子，其中所述的DNA是cDNA。
5.权利要求3的分离的核酸分子，其中所述的DNA是gDNA。
6.权利要求4的分离的核酸分子，包括SEQ ID NO1的核苷酸序列。
7.权利要求5的分离的核酸分子，包括SEQ ID NO2的核苷酸序列。
8.权利要求4的分离的核酸分子，包括SEQ ID NO3的核苷酸序列。
9.包括与一启动子可控连接的权利要求1的核酸分子的重组表达载体。
10.权利要求9的重组表达载体，包括与启动子可控连接的SEQ ID NO1、SEQ IDNO2或SEQ ID NO3的核苷酸序列。
11.用权利要求1的分离的核酸分子转染或转化的原核或真核细胞系。
12.权利要求11的原核或真核细胞系，其中所述的核酸分子包括SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核苷酸序列。
13.用载体转染或转化的权利要求11的原核或真核细胞系。
14.权利要求13的原核或真核细胞系，其中所述的载体包括SEQ ID NO1、SEQID NO2或SEQ ID NO3的核苷酸序列。
15.用编码HLA-A2的核酸分子共转染或共转化的权利要求11的原核或真核细胞系。
16.用编码HLA-A2的核酸分子共转染或共转化的权利要求12的原核或真核细胞系。
17.权利要求9的重组载体，进一步包括编码HLA-A2的核酸分子。
18.治疗患有以表达一种肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病的患者的方法，该肿瘤排斥抗原前体被加工成由HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原，所述方法包括给予所述患者足以减轻所述疾病的量的胞溶性T细胞，该胞溶性T细胞特异于所述肿瘤排斥抗原和HLA-A2分子的复合物并溶解提呈所述复合物的细胞。
19.治疗患有以表达一种肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病的患者的方法，该肿瘤排斥抗原前体由包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核苷酸序列的核酸分子编码，所述方法包括给予所述患者足以减轻所述疾病的量的胞溶性T细胞，该胞溶性T细胞特异于HLA分子和所述肿瘤排斥抗原前体衍生的肿瘤排斥抗原的复合物。
20.治疗患有以表达一种肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病的患者的方法，该肿瘤排斥抗原前体被加工成由HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原，所述方法包括给予所述患者一种激发针对所述肿瘤排斥抗原和HLA-A2分子的复合物的免疫应答的制剂，该制剂的量应足以激发针对提呈所述复合物的细胞的所述应答。
21.治疗患有以表达一种肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病的患者的方法，该肿瘤排斥抗原前体由包含SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的核苷酸序列的核酸分子编码，所述方法包括给予所述患者一种激发针对HLA分子和所述肿瘤排斥抗原前体的复合物的免疫应答的制剂，该制剂的量应足以激发针对提呈所述复合物的细胞的所述应答。
22.诊断以表达一种肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病的方法，该肿瘤排斥抗原前体被加工成与HLA-A2分子形成复合物的肿瘤排斥抗原，所述方法包括将取自患者的样品与特异于所述复合物的制剂接触，并测定所述复合物与所述制剂之间的相互作用以确定所述疾病。
23.诊断以表达一种肿瘤排斥抗原前体为特征的疾病的方法，该肿瘤排斥抗原前体由具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的序列的核酸分子编码，所述方法包括将取自患者的样品与特异于所述序列或其表达产物的抗原接触，并测定所述制剂与所述序列或所述表达产物之间的相互作用以确定所述疾病。
24.鉴定样品中肿瘤排斥抗原前体Melan-A的表达的方法，包括将所述样品与至少一种由核苷酸组成的探针接触，其中所述的至少一种探针与编码Melan-A的核苷酸序列杂交，确定杂交作用以确定Melan-A在所述样品中的表达。
25.权利要求24的方法，包括聚合酶链反应。
26.权利要求24的方法，其中所述的至少一种探针包括SEQ ID NO10或SEQ IDNO11。
27.权利要求25的方法，包括将所述样品与SEQ ID NO10或SEQ ID NO11接触。
28.分离的核酸分子，选自由SEQ ID NO10和SEQ ID NO11组成的一组。
29.由权利要求2的核酸分子编码的分离的肿瘤排斥抗原前体。
全文摘要
本发明涉及编码一种肿瘤排斥抗原前体的核酸分子，具体地，该肿瘤排斥抗原前体或称“TRAP“被加工成至少一种由HLA-A2分子提呈的肿瘤排斥抗原，这一发现的各种应用也包含在本发明中。
文档编号A61K48/00GK1152251SQ95194017
公开日1997年6月18日 申请日期1995年6月27日 优先权日1994年7月8日
发明者文森特·布里夏尔, 阿兰·范佩尔, 皮埃尔·库利耶, 蒂尔瑞·博恩-法勒尔, 艾蒂安·德普莱恩, 卡蒂亚·特拉韦尔萨里, 托马斯·韦尔费尔 申请人:路德维格癌症研究所