以核小体为基础的抗肿瘤组合物的制作方法

专利名称：以核小体为基础的抗肿瘤组合物的制作方法
背景技术：
本发明涉及使用核小体治疗和预防癌症。
在寻求对癌症的治疗中，研究人员已尝试激发患各种类型疾病的个体中的有效抗肿瘤免疫反应。为了研究成功，人们首先必需鉴定有效刺激免疫系统的肿瘤抗原。已鉴定了某些肿瘤，例如黑色素瘤的特异性抗原(Darrow等，免疫学杂志，142:3329-3335,1989；Cox等，科学264:716-719,1994)。而且，已描述了可被T细胞识别的人癌相关性抗原(Kantor等，国家癌症研究所杂志，84:1084-1091,1992；Ioannides等，免疫学杂志，151:3696-3703,1993；Tsang等，国家癌症研究所杂志，87:982-990,1995)。然而，可经过用特异性抗原制品免疫接种进行治疗的肿瘤数极其有限。迄今，尚未成功实现有效抗许多不同类型的恶性细胞的疫苗。
本发明概述本文描述的发明以这样一种发现为基础，即抗核自身抗体(ANAs)特异性结合存在于肿瘤细胞表面的核小体。这样命名这些抗体是因为它们识别正常情况下在细胞核中发现的抗原(“抗核”)且它们可自体产生(“自身抗体”)，例如在老年人或具有自身免疫疾病的人类(或其它动物)中。
以标准技术从健康成年Balb/c小鼠获得的脾细胞融合产生称为2C5的单克隆ANA。已表明该抗体与包括来自人类淋巴肿瘤(例如，MOLT-4,HEL92.1.7,Raji，和U-937细胞)和非淋巴肿瘤(例如，SK-BR3细胞(来自乳腺癌)和PC3细胞(来自前列腺癌))的许多肿瘤细胞表面反应。而且，已表明2C5抑制体内淋巴瘤的形成。因此该抗体的体内诱导提供了预防或治疗赘生性细胞生长的方法。
因此，本发明鉴定了一种经过施用诱导产生足以抑制赘生性细胞生长的抗核自身抗体的核小体来治疗哺乳动物(例如人类)的赘生性细胞生长的方法。核小体可从真核细胞纯化或按本文所述使用组蛋白及哺乳动物或细菌DNA在体外重建。核小体可以在生理上可接受的载体，稀释剂或赋形剂中含有或不含佐剂以基本上纯化的形式施用。另外，核小体可以按例如本文所述的方法进行脂质体包裹。而且可在肿瘤出现前或后用药。
也在本发明范围内的还有用于在哺乳动物中诱导抗核自身抗体生产的以核小体为基础的组合物。组合物由核小体(可从真核细胞中分离或在体外重建)和药用上可接受的载体，稀释剂或赋形剂组成。重建的核小体可含有真核或细菌DNA，且可在脂质体中包装，用于例如，作为疫苗施用。
用本文公开的组合物预防或治疗的赘生性细胞生长可以是恶性或良性生长。恶性细胞生长可以产生淋巴瘤，如Burkitt’s淋巴瘤，pre-B淋巴瘤，或组织细胞淋巴瘤，腺癌，例如乳腺，前列腺或肾腺癌，红白血病，胸腺瘤，骨原性肉瘤，肝细胞瘤，黑色素瘤，脑肿瘤，胶质细胞瘤，卵巢或子宫瘤，胰腺肿瘤，或胃或胃肠道内的肿瘤。
本发明可特别有益于认为有形成癌症危险的个体，首先是因为预防性治疗可在出现肿瘤症状前开始。有患病危险的个体包括对一种或多种癌症有遗传诱因的个体和出于疏忽接触核辐射或致癌物的个体。
“核小体”指组蛋白与DNA形成的复合物，包括完整的，天然存在的核小体，人工制备的“重建”核小体，和这些核小体的抗原部分。核小体天然存在于真核细胞核中且可按下文所述在体外重建。天然存在的核小体当用电子显微镜观察时，在DNA链上作为珠状体存在于切片组织中。
提到核小体时本文使用的术语“重建”指人工制备核小体的过程，例如，下文所述的盐逐步透析法。
用核小体免疫宿主来增强免疫系统抗肿瘤潜力的优势在于预期可产生多克隆抗体，它识别结合核小体的肿瘤细胞表面的一些决定簇。因此，抗核小体自身抗体应比施用外源性单克隆抗体能更有效地介导宿主免疫系统的效应器抗肿瘤功能。
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解具有相同的意义。尽管在本发明的实践或试验中可使用与本文所述相似或相当的方法和材料，但合适的方法和材料在下面进行了描述。如有抵触，本说明书，包括定义将会处理。另外，材料，方法和实施例仅仅是说明性的而不打算用于限制。
本发明的其它特征和优点从下面的详细描述和权利要求书来看将是显而易见的。
附图的简要描述

图1是描述单克隆抗体ANA 2C5与含有核酸组蛋白制品的核小体在酶联免疫吸附试验(ELISA)中的选择反应性的线性图。图中试验样品表示如下核酸组蛋白为■，单链DNA为○，双链DNA为△，单个组蛋白的混合物为□，核糖核蛋白为X。
图2是描述单克隆ANA 2C5与重建的核小体反应性的线性图。图中试验样品表示如下使用逐步盐透析法从DNA-组蛋白混合物重建的核小体为■，相似处理的DNA为△，相似处理的组蛋白为□无核小体的DNA-组蛋白混合物为○。
图3是描述C57BL/6小鼠中与注射的核小体发生体液反应的线段图。使用注射后0,5，和12天获得的血浆样品进行ELISA。各孔用50μg/孔双链DNA(线段A),10μg/孔总组蛋白(线段B)，或10μg/孔核酸组蛋白(线段C)致敏且测定光密度(在Y轴上显示)。
图4是显示用核染色质免疫后小鼠脾细胞对S49淋巴瘤细胞的MHC非限制性细胞毒性。
详细描述下面提供的数据证实了核小体是杀肿瘤ANA的靶且用核小体免疫可提供增加免疫系统抗肿瘤潜的体液和细胞抗肿瘤反应。因此，核小体可用作抗癌疫苗的基础。
本发明以这样的发现为基础，即已显示出显著抑制体内进展型癌发育的抗核自身抗体(ANA),2C5(Torchilin等，WO96/00084，在此作为参考文献引用)特异性结合存在于所有检查的肿瘤细胞表面(Torchilin等，出处同上；Iakoubov等，免疫学通讯47:147-149,1995)但不存在于正常非恶性细胞表面的核小体。该特异性以Western印迹分析和以酶联免疫吸附试验(ELISA)证实。2C5针对各种潜在抗原性靶的反应性在表1中报道且试验一组不同核抗原的ELISA结果在图1中显示。
称为1G3和4D11的两个其它ANA也从成年健康Balb/c小鼠获得且同样显示出与人类和啮齿类肿瘤细胞结合，但不与正常细胞结合。这些数据在下面表2中显示。
为了进行起始反应性测定，用包括含有核小体的核酸组蛋白制品，单链DNA，双链DNA，单独的组蛋白混合物或核糖核蛋白(在磷酸缓冲盐(PBS),pH7.2中10μg/孔)的潜在靶覆盖ELISA平板(Corning，纽约，NY)2小时。然后洗涤平板并与在含有0.1％Tween20的PBS(PBST)中的加热灭活的小牛血清的10％的溶液温育30分钟。该方法有效地防止了非特异性结合。以一式两份加入2C5或对照同型匹配骨髓瘤抗体UPC10(在相同溶液中；Cappel,Durham,NC)并在室温下温育60分钟。经过加入过氧化物酶标记的羊抗小鼠抗体，接着加入底物显示结合的抗体；使用0.05％邻苯二胺盐酸和0.01％过氧化氢作底物进行吸附的羊抗体观察。经过加入2.5M硫酸(50μl/孔)终止反应，使用微量平板ELISA阅读器(Fisher Scientific，Pittsburgh,PA)阅读光密度。在各组实验中，以平均值加3倍平均值的标准差(SEM)形成极限值以区分阳性(含有抗原)和阴性血清样品。作为血清滴度，取最大稀释度，在此稀释度下，阳性样品的光密度比阴性样品至少高3倍。
从上述ELISA和从标准Western印迹分析收集的关于2C5特异性的数据在表1中显示。在Western印迹中与相应带无反应性和/或在ELISA中反应性与来自阴性对照的反应性在3个标准偏差内的情况在表1中以(-)表示。如果在ELISA中产生的信号超过阴性对照10个标准偏差，则样品评分为阳性(+++)。
表1
当对重建核小体进行试验时单克隆ANA 2C5也显示出具有限定于核小体的特异性。按Rhodes等(酶学方法，170:575-585,1989)所述体外重建核小体。简单地说，单个的组蛋白的混合物(50μg/ml各组蛋白(H1,H2A,H2B,H3和H4)；Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)溶于含有100μg/ml纯化的商品牛胸腺或细菌DNA(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)的蒸馏水中。溶液用2M NaCl在4℃下透析3小时，接着逐步透析到0.15M NaCl(4℃下在24小时时期内递减0.5M NaCl)。所有溶液含有1mM EDTA和0.1mM苯甲基磺酰氟。
然后试验2C5结合重建核小体的能力。将不同浓度的2C5(从大约0.005到5.0μg/ml)加入到使用逐步盐透析从DNA-组蛋白混合物体外重建的核小体(如上所述(■))中，同样处理的DNA(△)中，同样处理的组蛋白(□)中，和无核小体的DNA-组蛋白混合物(○)中。经过标记2C5，例如用辣根过氧化物酶标记，或经过向反应物中逐步加入标记的第二抗体可产生有色反应产物。经过阅读光密度(在A450下)分析的结果在图2的线性图中描述。以含有重建核小体的样品中随2C5浓度的逐渐增加光密度稳定增大来证明2C5抗体特异性结合重建核小体的能力。
已证实了ANAs 2C5,1G3，和4D11特异性结合许多种类的人和啮齿类肿瘤细胞。试验了这三种ANA结合人和啮齿类正常细胞及人和啮齿类癌，黑色素瘤，肉瘤，白血病和淋巴瘤。这三种ANAs分别结合人和啮齿类肿瘤细胞，但不结合正常细胞。这些数据在表2中显示，其中反应强度表示为单克隆抗体和非特异性对照抗体UPC10流式细胞光度峰之差。如果强度比用UPC10获得的强度超出3个对数，则样品评分为(+++)，如果强度与用UPC10获得的强度在1.5到3个对数之间，则评分为(++)，如果强度与用UPC10获得的强度在0.5到1.5个对数之间，则评分为(+)，如果强度不到0.2个对数的用UPC10获得的强度，则样品评分为(-)。一些样品未测定(n/d)。
表2
为了测定在非自身免疫成年小鼠中是否可增强免疫系统的抗肿瘤潜力，按如下所述制备核小体并用于免疫这些动物。核小体的制备使用上述逐步盐透析的标准方法(也参见Rhodes等，酶学方法，170:575-585,1989)可体外重建两类核小体，一类含有哺乳动物DNA和哺乳动物组蛋白，另一类含有细菌DNA和哺乳动物组蛋白。细菌DNA本身可表现出佐剂功能，因为它存在甲基化不足的CpG二核苷酸，而哺乳动物较少有这一特征(Krieg等，自然374:546-549，1995；至于综述，参见Krieg，临床免疫学杂志，15:284-292,1995)。因此，哺乳动物针对含有细菌DNA的免疫原的免疫反应比对哺乳动物DNA的反应更大。
为了随后免疫，可按下文所述将两种制品进一步与佐剂混合，如Freund’s佐剂，或掺入磷脂酰胆碱(PC)或PC/胆固醇脂质体。
核小体可直接施用或首先包埋进脂质体，该脂质体可以是人工磷脂小泡。脂质体可经过，例如，Szoka等(美国科学院学报74:4191，1978)的反向蒸发方法由例如，纯卵磷脂制成，或由卵磷脂与胆固醇以7∶3的摩尔比组成的混合物制成。脂类在氩气和真空中干燥后，将所得的膜溶于乙醚。例如，含有16mg卵磷脂，含有或不含适当量胆固醇的膜溶于640μl乙醚中，加入100至500μg在磷酸缓冲盐，pH7.5中制备的核小体(1μg/μl)。然后将混合物搅拌1分钟并在超声粉碎器(例如，Lab-Line Ultratip Labsonic System)中以40W 4℃下处理3-5分钟，使用转子蒸发器去掉乙醚。
另外，按照Senior等，生物化学和生物物理学报1003:58-62，1989的泡囊脱水-再水化方法，或Trubetskoy等，FEBS Lett.299:79-82,1990所述的延长共同超声处理方法可将核小体包埋于脂质体中。在前一种方法中，将150μl无热源去离子水加入脂类膜中(从氯仿中的一种或多种脂类溶液经溶剂蒸发制备)，将膜重悬于磷酸缓冲盐，pH7.5中。以核小体脂类为1∶10的重量比经剧烈搅拌掺入核小体。将最终混合物声处理3次，每次在氩气流中0℃下处理1分钟，然后冷冻干燥。干燥残留物用1ml无热源盐水重建。在后一种方法中，在相同量盐水和核小体存在下在氩气流中0℃下声处理重悬脂类膜。
可经过用异硫氰酸荧光素(FITC,Sigma化学公司，St.Louis,MO)标记核小体并随后以Ficoll密度梯度离心分离脂质体包埋与未包埋的核小体来测定核小体掺入脂质体的效率。为做到这点，将250μl脂质体-FITC标记的核小体制品与在PBS中的60％Ficoll-400(体积比为1∶1)剧烈混合，转移到塑料试管中，用3ml 40％Ficoll-400(在PBS中)和250μl PBS小心覆盖在顶部，不混合该相。然后试管以35,000rpm在例如Beckman超速离心机中17℃离心1小时。掺入了核小体的脂质体分进上层，从由10个各375μl的连续馏份组成的等分试样中加入去污剂，如Triton X-100前和后获得的荧光强度读数可得到证明。
使用例如，日立荧光分光光度计，按照厂商说明书可测定脂质体包埋或未包埋的核小体的荧光。与脂质体相联系的荧光强度也反应了核小体掺入的效率。如果必要，可改变脂质体组合物以提供最大程度的核小体掺入(参见，例如，Lesserman，脂质体作为寡核苷酸的转运体，在“脂质体作为基础研究和工业中的工具”，第215-223页，J.R.Philippot和F.Schuber编辑，CRC出版社，1995)。
将核小体包埋于脂质体中，然后按本文所述施用，包埋后提供的额外优势在于脂质体是多用途的且是有效的免疫佐剂(Gregoriadis，当今免疫学，第89-97页，1990；van Rooijen，脂质体作为疫苗抗原的载体和免疫佐剂，在“细菌疫苗”第255-279页，Alan R.Liss,Inc.,1990)。认为它们多用途是因为可经过改变其化学和物理组成来改变其特性，且已证实它们有效；在脂质体内施用的流感抗原诱导的免疫反应比用其它佐剂施用时高几倍(Mbawnike等，疫苗8:347-352，1990)。而且，脂质体可生物降解，无免疫原性，毒性小且比常规佐剂刺激性小，它们刺激体液和细胞免疫反应(Alving，免疫学方法杂志，140:1-13,1991；Fries等，美国科学院学报89:358-362,1992)。免疫接种可用不同的核小体制品，例如与佐剂组合或按照Mohan等(实验医学杂志177:1367-1381,1993)公开的方法包埋于脂质体中免疫接种啮齿类。对小鼠以两周的间隔用核小体或作为对照的PBS腹膜内注射三次。当使用Freund’s佐剂时，首次注射由核小体(10μg在50μl PBS中/小鼠)或PBS(50μl/小鼠)与完全Freund’s佐剂(Gibco实验室，Gaithersburg,MD)的1∶1混合物，两次随后的注射在不完全Freund’s佐剂中施用。当施用脂质体包埋的核小体时，所有三次注射可由相同的抗原制品组成，即，核小体的量和注射体积与用Freund’s佐剂施用时相同。当施用脂质体包埋的核小体时，阴性对照可以是不含核小体的脂质体。体液免疫反应分析例如，第一次免疫注射7和12天后，和第二及第三次免疫注射5和9天后，可试验免疫反应的体液成分。检查了单个免疫小鼠的血液样品中IgM和IgG同种型核小体反应性和肿瘤细胞表面反应性抗体的生产，以及在未免疫的小鼠或用单独的佐剂或单独的脂质体免疫的小鼠中这些抗体的生产。在各情况下使用允许定量不同类型核小体反应性抗体，特别是具有DNA-，组蛋白-，和核小体限定的特异性的抗体的以ELISA为基础的不同系统鉴定核小体反应性抗体的类型。
按如下筛选免疫小鼠血液样品中ANAs的存在。将从不同免疫小鼠获得的大约5μl血浆(例如，按上述，第一次免疫注射7和12天后，和第二及第三次免疫注射5和9天后获得)在10％小牛血清(在PBS中)中系列稀释。然后试验稀释的样品的核反应性，以可作为商品买到的Hep-2细胞(Immunoconcepts,Sacramento,CA)的免疫荧光染色来证明。来自未免疫小鼠的样品可用作阴性对照，2C5抗体可用作阳性对照。用PBS洗涤Hep-2细胞5次，在含有各种稀释度的血浆样品或mAb 2C5的10％小牛血清(在PBS；HyClone,Logan,Utah)中培养15分钟。然后用PBS洗涤细胞两次，用以1％小牛血清对FITC-标记的羊抗小鼠IgG的F(ab)2片断(完整分子；在PBS中)的工作稀释液培养，用PBS再次洗涤。经过比较这些动物的血浆样品产生的Hep-2染色的强度与2C5产生的染色可评价免疫动物的体液免疫反应。
用于染色活细胞的相同稀释度的血浆样品的等分试样(来自用各种核小体制品免疫的小鼠和来自非免疫小鼠)可用于染色固定的Hep-2细胞。开始该分析前，应测定细胞活力，例如用苔盼蓝排斥试验测定，且活力至少应为95％。用Hank’s缓冲盐溶液(HBSS)洗涤细胞两次，用来自免疫小鼠的血浆，来自未免疫小鼠的血浆，或单克隆抗体2C5(作为阳性对照，以5μg/ml溶于含有10％小牛血清的培养基中)温育30分钟，并用HBSS洗涤两次。然后用在含有1％小牛血清的培养基中1∶100稀释的FITC标记的羊抗小鼠抗体的F(ab)2片断染色细胞30分钟。染色后，用HBSS洗涤细胞两次，并用在PBS中的4％戊二醛固定。在20℃进行所有的温育。可使用FACScan(Becton Dickinson,Mountain View,CA)分析细胞，活细胞通道使用向前和90°散射以排除碎片和死细胞。
按如下方法用ELISA分析注射核小体的早期免疫反应。用50μg/孔的双链DNA(图3中线段A)，10μg/孔的总组蛋白(图3中线段B)，或10μg/孔的核酸组蛋白(图3中线段C)，致敏ELISA平板，在含有0.1％Tween 20的PBS(PBST)中洗涤并用在PBST中的10％的热灭活的胎牛血清溶液温育30分钟以防止非特异性结合。来自免疫小鼠的血浆样品在PBST中1∶100稀释并以一式三份加入。在室温中温育1小时后，经过加入过氧化物酶连接的羊抗小鼠IgG 1小时(Cappel,Durham,NC；1∶1000溶于PBST中)随后加入在0.05M柠檬酸缓冲盐(pH4.0)中的2,2’-asino-双(3-乙基苯-thuazoline-6-磺酸)显示结合的物质。将过氧化氢(0.01％)用作底物以获得颜色反应。测量各样品的光密度。如图3所示，核酸组蛋白诱导最有效的免疫反应，在起始免疫5天内在血液中出现核小体反应性抗体。如本文所述，这些抗体特异性结合在肿瘤细胞表面表达但在正常细胞表面不表达的核小体。细胞免疫反应的分析还研究了细胞免疫反应的效力。免疫反应的细胞成分是MHC限定的或MHC-非限定的，经过在体外试验中检查细胞的细胞毒性可试验这些成分，该试验中来自免疫和对照小鼠的脾细胞用作效应细胞，且51-Cr-标记的EL4 T淋巴瘤细胞和S49 T淋巴瘤细胞用作同源性或异源性靶。用于研究细胞免疫反应的肿瘤细胞包括那些来自EL4淋巴瘤细胞系的细胞，它在用二甲基苯并蒽处理的C57BL/6小鼠中产生。用少量这些细胞接种导致进展型肿瘤形成和随后所有动物死亡。这种攻击性致瘤力使得这些肿瘤细胞作为实验模型具有吸引力。图4所示的试验中使用的S49细胞来自小鼠淋巴瘤细胞系，该细胞系从经过注射噬菌体和油在Balb/c小鼠中诱导的淋巴瘤建立。这些细胞不携带表面免疫球蛋白。
EL4 T淋巴瘤和S49细胞分别以保藏号TIB-39和TIB-28从美国典型培养物保藏中心(A.T.C.C.；Rockville,MD)获得。
按如下方法用核小体免疫后证实了小鼠脾细胞对S49 T淋巴瘤细胞的MHC-非限制性细胞毒性。用在完全Freund’s佐剂中的核染色质(100μg/小鼠)腹膜内免疫C57BL/6小鼠。在第5天分离脾细胞，用50μg/ml核染色质体外(5％CO2,37℃)加强免疫24小时，洗涤后，以一式三份加入到含有51-Cr-标记的S49 T淋巴瘤细胞(E∶T=20∶1)的园底96孔平板的孔中。培养8小时后，在γ-计数器中定量释放的放射活性且细胞毒性程度测定为按下式的％裂解
观察到来自免疫小鼠的脾细胞(见图4第3栏)比仅用Freund’s佐剂注射的小鼠(见图4第1和2栏)具有明显更高的细胞毒性。当实验过程中培养基中存在核小体时(见图4第2和4栏)毒性效果会受到部分抑制。鉴定负责细胞毒性的细胞亚类为了测定细胞免疫反应的机制和类型，必需测定脾细胞的具体种群。因此，应在使用pan-T,pan-B，抗-CD4，抗-CD8或抗-NK单克隆抗体介导的补体依赖性裂解排除不同细胞亚类后测定来自免疫小鼠的脾细胞的细胞毒性(Boyle等，免疫学方法杂志，15:135-146,1977)。分析以核小体为基础的免疫对防止肿瘤形成的影响可较容易地评价以核小体为基础的疫苗在癌症治疗中的效力。为达到该目的，按照标准技术将同源肿瘤细胞施用给核小体免疫后的C57BL/6小鼠。例如，腹膜内注射2×104个EL4淋巴瘤细胞或静脉内注射2×106个B16.F10黑色素瘤细胞。可试验免疫的肿瘤预防效力(a)在体液IgG抗核小体反应峰值处，(b)在针对肿瘤靶的免疫诱导的细胞毒性峰值处，和/或(c)同等充分地存在体液和细胞两种成分时。这些数据可用于选择用核小体免疫的最佳方案。
B16.F10黑色素瘤细胞是对于肺具有高度转移潜力的B16黑色素瘤细胞的衍生物且可从A.T.C.C.(保藏号CRL-6322)获得。分析2C5用药对人肿瘤形成的影响为了测定ANA 2C5用药对人肿瘤细胞的影响，将BT20人乳腺癌细胞皮下植入裸鼠，在施用肿瘤细胞的当天开始每到第二天用4次2C5(75μg/次注射)静脉内注射处理动物。一组对照小鼠接受相似程序的同种型匹配的对照抗体UPC10注射。40天后，75％的治疗的小鼠无肿瘤，而各对照小鼠形成肿瘤。在形成肿瘤的25％的2C5处理的小鼠中肿瘤平均大小只到未用2C5处理的小鼠形成的肿瘤的10至15％。用核小体免疫接种防止肿瘤形成使用下面的免疫方案和两种同源肿瘤模型EL4 T淋巴瘤和Lewis癌试验用核小体接种(C57BL/6)小鼠的影响。用含有单核小体和寡聚核小体的核酸组蛋白制品(Sigma化学公司)经过腹膜内或皮下注射免疫小鼠，然后如下所述用肿瘤细胞注射。
使用两种佐剂方案用于免疫接种。按照第一种方案，核小体在不完全Freunds佐剂中注射。按照第二种方案，使用核小体和含有来自细菌DNA的核苷酸序列的寡聚核苷酸的混合物(5μg/只小鼠/次注射)。寡核苷酸具有强烈的佐剂活性。
将小鼠分成两组实验组(其中小鼠用100μg核小体在第0天和第9天免疫接种)和对照组(接受由PBS组成的假免疫)。用核小体第二次免疫接种9天后将肿瘤细胞施用给小鼠，如下所述。一组实验小鼠接受一次EL4 T淋巴瘤细胞的注射(50,000细胞/小鼠)，另一组实验小鼠接受一次Lewis癌细胞的注射(250,000细胞/小鼠)。为了避免产生和观察到简单的局部效应，将核小体和肿瘤细胞注射进不同的位点。即，以i.p.注射核小体来免疫的小鼠经皮下注射接受Lewis癌细胞。同样，以皮下注射核小体来免疫的小鼠经i.p.注射接受EL4 T淋巴瘤细胞。
不论用药的途径或位点如何，肿瘤形成受到强烈抑制。在第15天，在核小体处理的小鼠中施用Lewis癌细胞后形成的肿瘤的平均重量不到未处理小鼠(即，PBS假免疫小鼠)中肿瘤重量的三分之一。未处理小鼠中肿瘤称重为0.34±0.49g，而在用核小体和不完全Freunds佐剂处理的小鼠中肿瘤称重为0.08±0.07g，在用核小体和寡核苷酸处理的小鼠中肿瘤称重为0.11±0.08g。在免疫小鼠中也强烈抑制EL4 T淋巴瘤的形成。在这种情况中，未处理的小鼠肿瘤称重为3.3±0.49g，但在用核小体和寡核苷酸处理的小鼠中肿瘤称重仅为1.3±0.21g。分析以核小体为基础的免疫对形成的肿瘤进展的影响当在宿主中已存在肿瘤时，用核小体免疫也应有效。为了分析本发明的这一方面，当形成肉眼可见的肿瘤病灶时进行免疫(例如，在i.p.注射EL4 T淋巴瘤细胞后的第7天或i.v.注射B16黑色素瘤细胞后的第20天的小鼠中)。根据体液免疫反应和显示负责细胞毒性的细胞亚类选择免疫剂的类型。应用技术人员将明白含有核小体的任何核材料会诱导产生特异性结合核小体的抗核自身抗体。该核材料包括，例如，核酸组蛋白，它是复合的核酸蛋白质，包括核小体和另外的蛋白性核材料，如充当转录因子的结合DNA的蛋白质。对于核提取物，核染色质或亚核小体，它们是具有不同于天然存在的核小体的结构，但也能诱导产生ANAs的核小体，因此认为在本发明的范围内。
除了上述用药的腹膜内途径外，可经过静脉内，肌肉内，跨粘膜或皮下施用以核小体为基础的疫苗。也可组合使用这些用药方式。例如，第一次用药可以是跨粘膜用药，随后的用药可以是腹膜内用药。
疫苗可以在任意药用上可接受的载体或稀释剂，包括水，生理盐水，磷酸盐缓冲液或碳酸氢盐溶液，如0.1M NaHCO3中施用。根据用药方式和途径以及标准药用实践选择载体或稀释剂。其它合适的药用载体和稀释剂及其用于药用配制品的药用必需品在，例如，Remington’s药用科学(药学领域的标准参考教科书)中描述。
施用的疫苗量依赖于具体的疫苗抗原(不论是否共同施用佐剂)，用药的方式和频率以及所需的效果。这些因素分别是技术人员所理解的。一般来说，本发明的疫苗抗原(核小体)以在例如，1μg和100mg之间变动的量施用。如果佐剂与疫苗一起施用，可使用在例如，1ng和1mg抗原之间变动的量。该剂量也可以按经验计算，例如，根据动物实验，且可以对病人体重来表达，范围从0.2到200μg/kg。
技术人员将认识到本文所述的疫苗可以与其它治疗方法结合施用。例如，疫苗可以在施用化疗剂，放射疗法或对恶性肿瘤的手术部分切除术或细胞良性生长之前，期间或之后施用。其它实施方案除了上述那些外，许多佐剂是技术人员已知的且可用于进行本文所述的免疫。例如，霍乱毒素(CT)，大肠杆菌的热易变性肠毒素(LT)或其具有佐剂活性的片断或衍生物可用于跨粘膜用药。另外，诸如RIBI(ImmunoChem,Hamilton,VT)或氢氧化铝的佐剂可用于肠胃外用药。
与佐剂(例如，CT,LT，或其具有佐剂活性的片断或衍生物)融合的含有核小体的融合蛋白质认为在本发明范围内，且可使用标准方法制备(参见，例如，Ausubel等，“分子生物学常规方法，第Ⅰ卷”，Green Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,NY,1989)。另外，本发明的疫苗可与佐剂共价偶连或交联。共价偶连或化学交联佐剂与抗原的方法在例如，Cryz等(疫苗13:67-71,1994),Liang等(免疫学杂志141:1495-1501,1988)和Czerkinsky等(感染和免疫学57:1072-1077,1989)中描述。
如上所述，核小体可作为含有赋形剂的生理上可接受的配制品施用。可包含在配制品中的赋形剂的例子有缓冲液，如柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，乙酸盐缓冲液，和碳酸氢盐缓冲液，氨基酸，尿素，乙醇，抗坏血酸，蛋白质，如血清白蛋白和明胶，EDTA，氯化钠，聚乙烯吡咯烷酮，甘露醇，山梨糖醇，甘油，丙二醇和聚乙二醇(例如，PEG-4000,PEG-6000)。
应明白尽管结合上述详细描述已描述了本发明，但以上描述是打算说明而不是限制本发明的范围，其范围由所附权利要求书的范围来限定。其它一些优点和改变均在下面权利要求书的范围内。
权利要求
1．一种治疗哺乳动物中存在的赘生性细胞生长的方法，所述的方法包含给哺乳动物施用对于诱导哺乳动物产生足够的抗核自身抗体以抑制赘生性细胞生长有效量的核小体。
2．权利要求1的方法，其中所述的核小体包含哺乳动物DNA。
3．权利要求1的方法，其中所述的核小体包含细菌DNA。
4．权利要求1的方法，其中所述的核小体被脂质体包裹。
5．权利要求1的方法，其中所述的哺乳动物是人类。
6．权利要求1的方法，其中所述的赘生性细胞生长是恶性的。
7．权利要求1的方法，其中所述的赘生性细胞生长是良性的。
8．一种在具有赘生性细胞生长危险的哺乳动物中抑制赘生性细胞生长的方法，所述的方法包含给哺乳动物施用对于诱导哺乳动物产生足够的抗核自身抗体以抑制赘生性细胞生长有效量的核小体。
9．权利要求8的方法，其中所述的核小体包含哺乳动物DNA。
10．权利要求8的方法，其中所述的核小体包含细菌DNA。
11．权利要求8的方法，其中所述的核小体被脂质体包裹。
12．权利要求8的方法，其中所述的哺乳动物是人类。
13．权利要求8的方法，其中所述的人类具有赘生性细胞生长危险。
14．权利要求8的方法，其中所述的赘生性细胞生长是恶性的。
15．权利要求8的方法，其中所述的赘生性细胞生长是良性的。
16．一种用于在哺乳动物中诱导抗核自身抗体生产的组合物，所述的组合物包含基本上纯的核小体和药用上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
17．权利要求16的组合物，其中所述的核小体从真核细胞分离。
18．权利要求16的组合物，其中所述的核小体从DNA和组蛋白存体外重建。
19．权利要求18的组合物，其中所述的DNA来自真核细胞。
20．权利要求18的组合物，其中所述的DNA来自细菌细胞。
21．权利要求16的组合物，进一步包含脂质体包裹的核小体。
22．权利要求16的组合物，进一步包含一种佐剂。
23．权利要求16的组合物用作抗癌剂。
24．权利要求16的组合物在生产治疗癌症的药物中的应用。
全文摘要
一种抑制哺乳动物中赘生性细胞生长的方法,经过给哺乳动物施用核小体,它诱导产生足以抑制赘生性细胞生长的抗核自身抗体。
文档编号A61K38/16GK1233185SQ97198742
公开日1999年10月27日 申请日期1997年9月12日 优先权日1996年9月12日
发明者弗拉基米尔·P·托尔基林, 列昂尼德·Z·雅可波夫 申请人:通用医疗公司