专利名称：鉴定f18大肠杆菌相关疾病遗传抗性猪的方法和组合物的制作方法
本文提供了鉴定对大肠杆菌相关疾病，尤其是与具菌毛F18的大肠杆菌菌株相关的肠道疾病具有遗传抗性的组合物和非侵害性方法。已鉴定出猪α(1,2)岩藻糖基转移酶(FUT1)基因中的DNA多态性，它可将抗性猪和易感猪区分开，从而H为猪养殖人员提供有用的诊断试验。
养猪过程中的主要问题是使猪免患疾病，断奶后的肠道紊乱是尤其严重的问题。有限数目的毒性大肠杆菌菌株血清型是猪水肿病和断奶后腹泻的致病原，它可导致全世界养猪业遭受严重的经济损失，尤其是4至12周龄幼猪的损失。水肿病典型的临床症状是神经学病征，如运动失调，惊厥和麻痹。在随后的尸检中发现，水肿一般存在于特征性位点，如眼睑和前额，胃壁和结肠系膜。此疾病分别由定居于小肠表面但不影响肠细胞(肠中的细胞)主要形态变化的大肠杆菌产生的志贺样毒素-Ⅱ变体和肠毒素LT,Sta,STb导致。在此方面，某些类型的大肠杆菌菌株F18,F4和K88是主要的致死性的villain。“猪水肿病是肠毒素血症，其特征在于延及全身的血管损伤，后者是由某些大肠杆菌菌株产生的毒素，志贺样毒素-Ⅱ变体导致的”(Bertschinger等，1993)。可以菌毛类型区分大肠杆菌，相关的一组粘附菌毛被称为例如K88或F18(Vogeli等，1997)。
不是所有的猪都易感大肠杆菌，定居依赖于细菌对肠细胞的粘附，这种粘附是由被称为K88或F18的细菌菌毛介导的。已证实对粘附的易感性，即猪中结合菌毛的受体的表达受到宿主的遗传控制，对F18而言，上述易感性作为显性性状被遗传下来，B表示易感的等位基因，b表示抗性等位基因(Vogeli等，1996；Meijerink等，1997)。根据其与染色体6上卤烷(HAL)连锁群中的S基因座和其它基因座的紧密遗传连锁，将大肠杆菌F18-受体(ECF18R)的基因座作图至猪染色体6(SSC6),K88大肠杆菌受体位于染色体13。
抗性机理可能是大肠杆菌未定居于抗性动物的肠表面，即细菌未粘附于抗性猪的肠壁上。某些大肠杆菌粘附和非粘附表型之间的区别取决于肠刷状缘膜的糖蛋白受体，因此，宿主猪的基因型决定抗性。另外还研究了带菌毛的细菌(WO9413811)。
鉴定F18大肠杆菌相关疾病的抗性猪的最新方法是1)收集刚被屠宰的猪的肠样品，在显微镜下进行粘附试验，2)用强毒性的大肠杆菌攻击动物(“定居试验”)，或3)进行AO(S)血型系统血液定型。前两种方法对鉴定抗性动物以用作繁殖原种来说并不实用。尽管血液定型法能鉴定抗性动物，但此试验不能确定易感动物的易感性是纯合的还是杂合的。关于这些等位基因的动物基因型知识(基因状况)是发展成功育种计划所必需的。育种计划的目的是繁殖对大批杀死断奶后牲畜的F18大肠杆菌相关疾病具有抗性的猪。
在一篇文献中，作者在谈及猪水肿病时说到“正在寻找适当的遗传标记”(Bertschinger等，1993,p.87)，并提到Walters和Sellwood,1982繁殖抗性猪是预防无法有效被预防的疾病的好方法，此方法的可行性取决于猪群体中编码抗性的基因的大量存在，检测抗性猪的改良方法，和用此抗性同时选择的阴性遗传性状的缺乏。
遗传“标记”基因座是靠近所需基因座的编码或非编码基因座，但基因座本身并不是必需的。可测的表型包括连续的或不连续的性状，如限制性长度片断多态性，生产性状，细菌粘附性状，生色或酶促反应和抗生素抗性。S基因座控制着A和O血型抗原的表达。S基因座隐性纯合的猪不表达A或O血型抗原。由于编码人血型H的α(1,2)岩藻糖基转移酶基因中具有突变，类似的状况也存在于人中(Kelly等，1994，也见于WO9628967中)。最近测定了猪α(1,2)岩藻糖基转移酶基因的序列(Cohney等，1996)，此基因与猪S基因座上存在的基因非常相似。
在遗传和物理图谱上，血型H和Se基因座位于人染色体19q13.3,此区域在进化中是保守的，含有与猪基因HAL连锁群同源的基因。编码血型H的基因是所谓的FUT1，而Se基因等同于FUT2基因。FUT1决定红细胞谱系中的H抗原表达，而FUT2调节分泌上皮和唾液中H抗原的表达。在如大鼠和兔的低等哺乳动物中，FUT1基因是保守的，兔脑组织和大鼠结肠中显示出mRNA的表达。在所有这些物种中，已报道了两种类型的α(1,2)岩藻糖基转移酶基因，其结构非常类似于人FUT1和FUT2基因，但FUT1同源基因特别地显示出物种特异性的表达模式。人FUT1基因负责红细胞前体中H抗原的合成，然而，猪红细胞被动地吸附血清中的H样抗原，此时为人Lewis抗原。猪中所有的H样抗原都与外分泌组织相关，在其它动物的分泌组织中也观察到FUT2(secretor)基因的表达。因此，FUT2基因可能会影响到与抗人血型H和A抗体交叉反应的猪A-O血型决定簇的表达。
有关血型和猪大肠杆菌疾病的其它信息包括血型抗原的碳水化合物结构介导一些病原体微生物与宿主组织的粘附，如幽门螺杆菌与Lewisb血型抗原的粘附，和导致尿道感染的大肠杆菌与血型P物质的粘附。因此，负责血型特异性碳水化合物结构形成的糖基转移酶的编码基因代表着宿主控制细菌定居的候选基因。这些基因与负责猪小肠中F18阳性大肠杆菌的粘附/非粘附的基因座定位于相同的染色体区域。猪直至断奶后才表达血型抗原A和O，此时猪容易感染F18大肠杆菌所致的疾病。
迫切需要诊断和治疗猪大肠杆菌相关肠疾病的新方法，有人建议将基因突变的检测作为一些猪疾病(恶性过热)的诊断试验(Fujii等，1991；美国专利5,358,649)，但无人报道过用于诊断的多态性标记。对大肠杆菌定居产生抗性的疫苗已被描述(美国专利5,552,144；WO8604604)，但由于给新生猪口服活疫苗的困难和调节的限制性，使其不可能成为预防大肠杆菌疾病的优选方法。抗生素可以用于治疗，但无法成功地预防疾病。
发明简述本发明的组合物和非侵害性的方法可以检测和排除易感大肠杆菌相关疾病的猪。鉴定大肠杆菌F18肠定居的抗性猪的非侵害性方法包括下列步骤测定猪生物样品中是否存在与定居抗性相关的遗传多态性；如果猪的多态性1(1多态性是种群中存在的核苷酸序列因突变所致的变化)是纯合的，则可推断猪是抗性的。
更具体地说，此方法是测定猪生物样品中猪α(1,2)岩藻糖基转移酶基因第307位的含氮碱基仅是腺嘌呤还是仅为鸟嘌呤；如果第307位的含氮碱基仅是腺嘌呤,即可将猪鉴定为抗性。
为了测定生物样品中是否存在多态性，在通过分子量进行分离的凝胶上分析限制性片断长度的多态性。限制性内切核酸酶是能在特异性位点再现地切割核酸分子的酶，根据切割的位置产生不同分子量的核酸片断。
本发明还涉及繁殖对大肠杆菌相关疾病具有抗性的猪的方法，所述方法包括选择α(1,2)岩藻糖基转移酶1基因中具有遗传多态性因而将其鉴定为对大肠杆菌相关肠疾病具有抗性的猪的繁殖猪；并繁殖所选择的猪。
本发明的一个方面是猪α(1,2)岩藻糖基转移酶1基因具有多态性的DNA分子，尤其是根据
图1的序列。本发明的另一方面是具有与图1序列互补的核苷酸序列的分子。
本发明的一个方面是第307位的鸟嘌呤被腺嘌呤取代的分离的DNA分子，此分子第857位的鸟嘌呤也被腺嘌呤取代。本发明其它分离的DNA分子包括图1序列第229位的核苷酸具有突变的分子，其中编码亮氨酸的密码子CTT被变为编码苯丙氨酸的密码子TTT。第714位核苷酸的突变是由GAT变为GAC，但编码的产物中没有相伴随的氨基酸取代。
由本发明的DNA分子编码并具有α(1,2)岩藻糖基转移酶活性的多肽也是本发明的内容。
检测猪中大肠杆菌F18受体的分子测定法是(a)从猪成核细胞(nucleated cell)中分离DNA；(b)使用与猪α(1,2)岩藻糖基转移酶基因1的DNA序列互补的寡核苷酸作为引物，在聚合酶链反应(PCR)中扩增DNA；(c)用至少一种限制性酶，如CfoI进行限制性酶消化；(d)通过凝胶电泳分离所得片断；和(e)测定凝胶上各片断的数目和长度；和(f)由F18片断的数目和长度确定猪细胞中存在哪一种受体。使用本文公开的较大的扩增片断而不是较小的片断进行限制性长度多态性分析(RFLP)较为便宜，因为DNA带可在相对低浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳。另外，为了产生一些片断，与可变诊断位点相邻的恒定限制性位点仅需要一种限制性酶。
检测与大肠杆菌F18受体相关的多态性的试剂盒在各个独立的容器中使用了与猪α(1,2)岩藻糖基转移酶基因1的DNA序列互补的寡核苷酸，它能将抗性猪和敏感猪区分开来。可对任何年龄的猪进行此试验。
多态性也可用于开发治疗患大肠杆菌相关疾病的猪的药物。突变形式的猪α(1,2)岩藻糖基转移酶可以干扰正常的酶，防止其产生F18的肠受体。
附图简述图1显示了本发明的猪α(1,2)岩藻糖基转移酶多态性的核苷酸序列(FUT1)(下)，并使用单字母氨基酸密码显示了推定的氨基酸序列(上)。氨基酸序列下方的双实线(=)是推定的跨膜区；氨基酸序列下方的点线表示3个潜在的N联糖基化位点(…)。
□是抗性猪中鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)取代的位置。
*表示终止密码子。
氨基酸残基的缩写如下A,Ala；C,Cys；D,Asp；E,Glu；F,Phe；G,Gly；H,His；I,Ile；K,Lys；L,Leu；M,Met；N,Asn；P,Pro；Q,Gln；R,Arg；S,Ser；T,Thr；V,Val；W,Trp；和Y,Tyr。
优选实施方案的描述与猪对大肠杆菌相关疾病的抗性有关的DNA多态性分子分析便于进行选择繁殖所用抗性猪的诊断试验。通过本发明的多态性标记鉴定出抗性猪与敏感猪的大肠杆菌F18受体基因座不同。
本发明提供了以高水平的敏感性和特异性将在遗传上对F18大肠杆菌感染的相关疾病敏感的猪与抗性猪区分开来的非侵害性方法和组合物。鉴定出猪α(1,2)岩藻糖基转移酶(FUT1)基因的DNA多态性，籍此区分抗性猪和易感猪。多态性由核苷酸序列中导致新等位基因的突变(变化)引起。等位基因是基因的一种状况，在一个种群中，一个基因有很多等位基因，其通过含氮碱基的取代而有所不同，所述取代可能是由亲代DNA分子中的突变引起的。一个种群中共存有一个以上的等位基因(有时称之为“变体”)被称为基因的多态性。在种群中，一个以上的等位基因作为明显稳定的成分存在的基因座是多态性基因座。通常，其中一个多态性基因座在种群中是低频的。
由生物样品，优选为血液中测得抗性猪的基因组具有多态性，其中在核苷酸序列第307位(见图1)测定的唯一碱基是腺嘌呤，而纯合易感猪的相同位置的碱基是鸟嘌呤。杂合猪会显示出两种类型的DNA，并且会是易感的。多态性是Cohney等，1996所报道的猪基因序列的变异。
对猪家族进行遗传连锁分析，测定FUT1的多态性和远系繁殖猪的疾病抗性之间的遗传联系。根据本发明，已在α(1,2)岩藻糖基转移酶1基因(FUT1)中发现多态性。第307位具有单个核苷酸碱基取代的多态性被用于确定岩藻糖基转移酶基因和S-系统，ECF18R基因座和HAL连锁群的其它基因座之间的紧密连锁。
检测FUT1和ECF18R的突变的紧密连锁使得分子试验发展成为可鉴定大肠杆菌F18粘附抗性，杂合(载体)和纯合的易感猪。此诊断试验以高敏感性和特异性鉴定出易感水肿病和断奶后腹泻的猪。在猪群中，本发明多态性的发生率有差异。据Vogeli等(1997)报道，猪群中5只猪的M307等位基因频率互不相关。本发明多态性诊断试验的可用性为养猪者提供了从猪群中有效消除ECF18R易感等位基因，从而消除导致水肿病和断奶后腹泻的必要条件大肠杆菌F18细菌粘附。
本发明还包括核苷酸序列，其为α(1,2)岩藻糖基转移酶基因1的序列的变体，代表bp307处的多种多态性，本发明还包括基于诊断分子试验的试剂盒，可用于鉴定α(1,2)岩藻糖基转移酶基因中的多态性。
为了得到大肠杆菌F18受体基因座(ECF18R)的候选基因，从猪基因组文库中分离出含基因的5个粘粒和1个基因组克隆，其含有α(1,2)岩藻糖基转移酶基因FUT1和FUT2(Meijerink等，1997)。通过荧光原位杂交作图将所有这些克隆定位于猪染色体6的q11带上(SSC6q11)。对粘粒的序列分析鉴定出(a)开放阅读框(ORF)，其长度为1098个碱基对，与人FUT1序列82.3％相同，和(b)第二个ORF，其长度为1023个碱基对，与人FUT2序列85％相同。因此，FUT1和FUT2基因座似乎是人血型H和Secretor基因座的猪等同物。对易感或抗具有F18菌毛的大肠杆菌(ECF18R)的粘附和定居的猪中的两个ORF进行直接测序，揭示出FUT1 ORF的碱基对307(M307)和碱基对857(M857)处的两个多态性。核苷酸位置是从ATG(编码甲硫氨酸)开始计数的。在具有221个后代的Landrace家族34次交配中分析这些突变，结果表明与控制对大肠杆菌F18粘附和定居于小肠的抗性和易感性的基因座(ECF18R)和血型抑制剂S的基因座紧密连锁。因此，M307突变是标记-辅助选择大肠杆菌F18粘附抗性动物的良好标记。发现第229位核苷酸的另一突变也导致多态性，其中编码亮氨酸的密码子(CTT)变为TTT(编码苯丙氨酸)。第714位(编码天冬氨酸)的突变(GAT变为GAC)不产生氨基酸取代。在FUT2中未鉴定出可以区分易感猪和抗性猪的多态性。
实施例下列实施例提供了本发明的实施方案。
实施例1抗性猪试验使用PCR-RFLP试验可轻易地鉴定本发明的多态性，试验的一个实施方案使用了下列引物5’CCAACGCCTCCGATTCCTGT3’和5’GTGCATGGCAGGCTGGATGA3’。此实施方案的优选PCR条件是在下列时间和温度下进行25轮循环94℃,30秒；60℃,45秒；72℃,90秒。通过限制性酶HgaⅠ消化抗性猪的扩增DNA，但不用限制性酶HinPI消化此DNA。用限制性酶HinPI消化纯合易感猪的扩增DNA，用上述两种酶部分消化杂合易感猪的扩增DNA。
或者，根据标准方法从猪成核细胞中分离DNA，对不同ECF18R基因型(Bb,bb)动物的猪FUT1和FUT2序列及其侧翼区直接测序，结果鉴定出FUT1 ORF的第307和857位(分别称之为M307和M857)有两个G→A的转换。M307转换消除了CfoI限制性位点，根据标准方法，用引物P6和P11扩增分离自猪成核细胞的DNA(95℃3分钟，然后是95℃,30秒；56℃,30秒；72℃,30秒共30轮循环，接着是72℃最后延伸7分钟)，接着进行CfoI消化，在3％琼脂糖凝胶上分离，产生限制性片断长度多态性(RFLP)。纯合M307AA动物显示出2条带，纯合M307GG动物显示出93-，241-和87bp的片断，杂合动物显示出所有4个片断。
实施例2使用α(1,2)岩藻糖基转移酶检测F18大肠杆菌抗性猪的试验的敏感性和特异性研究测定疾病抗性和FUT1基因第307位多态性之间的联系。183头断奶的猪(年龄为2至6个月)得自6个不同的猪群。研究开始前只知道其中一个猪群含有抗性动物，已知该猪群压力综合征的发病率高，其它5个猪群没有猪压力综合征的迹象，疾病抗性的发生率是未知的。从各猪群中随机选择猪，人为地使其安乐死，取出脾脏和小肠样品。从脾组织中提取DNA，并用于实施例1所述的PCR-RFLP试验。通过从小肠上刮下粘膜表层，在低渗EDTA溶液中裂解细胞并通过离心洗涤以纯化肠细胞。将纯化的肠细胞刷状缘与F18大肠杆菌一起保温，通过相差显微镜检查此混合物，此试验可测定猪是易感的(肠样品粘附有细菌)还是抗性的(肠样品未粘附细菌)。在所有53个抗性猪和130头易感猪的128头中，多态性的PCR-RFLP试验与细菌-肠细胞结合试验相关。使用细菌-肠细胞结合试验测定为易感猪的两头猪被PCR-RFLP试验不正确地测定为抗性猪。被检查的6个猪群中有2个含有抗性猪，而只有1个猪群具有猪压力综合征，这表明PCR-RFLP试验可鉴定不具有猪压力综合征的动物中的疾病抗性动物。
实施例3将FUT1定位于染色体6(SSC6)用得自猪基因组DNA的FUT1核苷酸探针筛选粘粒文库之后，用引物P7和P11鉴定粘粒ETHsl,-s2,-s3,-s4和-s6，并通过FISH和DISH-PCR将其作图至染色体6的q11带上。
实施例4鉴定猪FUT1 ORF将KspI,EcoRI和KspI/EcoRI粘粒消化物与经放射性标记的猪FUT1片断P6-P11和P7-P10进行杂交以进行Southern印迹分析，结果表明ETHs2,-s4和-s6的放射自显影信号相同,而得自粘粒ETHs1和-s3的信号不同。从粘粒ETHs2 KspI中分离出长度为940bp和6.2kb的亚克隆，相当于Southern印迹上杂交KspI片断的估计长度。结合两个亚克隆的序列结果，产生1501 bp序列，这与基因组PCR产物直接测序结果一致。1501bp序列含有1098bp的开放阅读框(ORF)，相当于人FUT1 ORF，与其具有82.3％的核苷酸和80.8％的氨基酸同一性。ORF编码多肽。
实施例5鉴定猪FUT2和假基因FUTPETHs1具有1个与FUT1序列杂交的DNA片断(2.7kb)，而ETHs3具有两个上述片断(2.7kb和8.2kb)。对ETHs1和-s3的2.7kb EcoRI片断进行亚克隆和部分测序，证实了这两个片断是相同的。此序列与人FUT2非常相似，但在NH2和-COOH末端区域显示出几个变化。这些变化导致与保守ORF不相容的移码，因此，假定得自2.7kb片断的序列表示假基因(FUT2P)。亚克隆ETHs3 BamHI消化物之后，鉴定8.2kb EcoRI片断中所含的杂交序列。所得亚克隆序列表示1023bp ORF，它与人FUT2序列在核苷酸水平上85％相同，氨基酸水平上83％相同。在猪FUT2序列和衍生自2.7kb片断的FUT2P序列之间观察到NH2和-COOH末端区域的很多差异。推测的氨基酸序列相当于猪Secretor酶部分测定的氨基酸序列(Thurin和Blaszcyk-Thurin,1995)。将所得猪FUT1,FUT2和FUTP序列登记于GenBank，登记号分别为U70883,U70881和U70882。FUT1和FUT2基因具有高度同源性序列。在例如引物开发中已考虑到这一点。另外，在进一步的研究中需要区分FUT1和FUT2酶活性。
实施例6鉴定M307和M857突变和表征M307根据标准方法从猪成核细胞中分离DNA，对不同ECF18R基因型(Bb,bb)的动物的猪FUT1和FUT2序列及其侧翼区直接测序，结果鉴定出FUT1ORF的第307和857位(分别称之为M307和M857)有两个G→A的转换。M307转换消除了CfoI限制性位点，根据标准方法，用引物P6和P11扩增分离自猪成核细胞的DNA(95℃3分钟，然后是95℃,30秒；56℃，30秒；72℃,30秒共30轮循环，接着是72℃最后延伸7分钟)，接着进行CfoI消化，在3％琼脂糖凝胶上分离，产生限制性片断长度多态性(RFLP)。纯合M307AA动物显示出2条带(93-和328-bp片断)，纯合M307GG动物显示出93-,241-和87bp的片断，杂合动物显示出所有4个片断。
实施例7鉴定突变M857M857突变是消除AciⅠ位点的转换。设计引物PBEST以错配第866和872位两个多余的AciⅠ位点。用引物P7和PBEST进行PCR(95℃3分钟，然后是95℃,30秒；56℃,30秒；72℃,30秒共30轮循环，接着是72℃最后延伸7分钟)，接着进行AciⅠ消化，在3％琼脂糖凝胶上进行PCR-RFLP分析。纯合M857AA动物显示出174bp的片断，而M857GG动物的扩增产物显示出136-和38-bp片断。
实施例8绘制FUT1基因的遗传图谱在Landrace猪家族中，M307和HAL连锁群(S,ECF18R,RYR1,GPI,PGD)基因座之间的重组事件揭示出重组分数θ＜0.04(表2)。全部重组分数的优势对数评分Z为24.5至50.6之间，这可以充分证明这些基因座之间的连锁。这些数据可将FUT1基因作图于HAL连锁群中与皆受FUT1影响的S和ECR18R紧邻的位置。在实验性Landrace猪家族中，发现了ECF18R和RYR1之间的等位基因联合。在水肿病和断奶后腹泻的抗性猪(基因型ECF18Rb/b(表3))中观察到RYR1第1843位有过量的基因型RYR1TT(卤烷易感基因型)。这种等位基因联合是连锁不平衡的结果，即在独立分类等位基因时，所观察到的单元型频率与预期的单元型频率有偏差的结果。因此，连锁不平衡设计了属于相连基因座的等位基因的非随机联合。然而由于低重组率的缘故，无法确定某种基因座顺序显著优于另一种基因座顺序。
实施例9:M307A与ECF18b和M307G与ECF18RB的联合在Landrace(SL)猪和亲代Large White(LW)猪中，ECF18Rb(水肿病和断奶后腹泻抗性等位基因)与M307A100％联合，而ECF18RB(水肿病和断奶后腹泻易感等位基因)与M307G100％联合(其中A=腺嘌呤；G=鸟嘌呤)。在SL猪中，88％(30/34)的Ss分别是ECF18Rb和M307A单元型。在Large White猪中，Ss-ECF18Rb和Ss-M307A单元型的相应值为82％(9/11)。在实验性SL家族中，FUT1基因座的M857A等位基因的发生率低，在LW猪中甚至为零。因此，未观察到M857等位基因和侧翼基因的等位基因之间的显著配子联合。在Duroc,Hampshire和Pietrain猪中发现FUT1307和FUT1857位的G→A转换具有可变的频率，使其它猪群中也出现这种转换成为可能。
实施例10:FUT1基因型的分布表4显示出ECF18R型中的FUT1基因型分布于核苷酸第307位，这与这两者为独立的假说中预期的比例显著不同。在119头水肿病和断奶后腹泻的抗性ECF18Rbb动物中，在基于DNA的试验中测定其中的118头具有基因型M307AA,1头抗性动物的基因型为M307A/G。在131头易感猪中，130头为M307A/G或M307G/G。通过DNA试验显示出1头对大肠杆菌粘附易感的动物为纯合的M307A/A。本实施例和实施例2的数据与过去的研究结果一起表明FUT1基因是存在于猪S基因座和ECF18基因座上的基因。尽管本实施例和实施例2中有4头动物同此假说相矛盾，但这可能是因为这些动物在疾病抗性/易感性方面被错误地划定表型的缘故。
实施例11:α(1,2)岩藻糖基转移酶中的氨基酸交换α(1,2)岩藻糖基转移酶1中bp+307和bp+857处的G→变化导致推测的氨基酸取代，即苏氨酸(中性-极性)取代丙氨酸(中性-非极性)和谷氨酰胺(中性-极性)取代精氨酸(碱性)，其分别对编码产物产生功能上的影响。bp229处的C→T变化导致的氨基酸取代为亮氨酸(中性-非极性)取代苯并氨酸(中性-非极性)。
表1正向(F)和反向(R)引物的序列及其相对于猪FUT1和FUT2起始密码子2的位置引物名称引物序列 位置FUT1 P6 (R) 5＇-CTTCAGCCAGGGCTCCTTTAAG-3＇ +489FUT1 P7 (F) 5＇-TTACCTCCAGCAGGCTATGGAC-3＇ +720FUT1 P10 (R) 5＇-TCCAGAGTGGAGACAAGTCTGC-3＇ +1082FUT1 P11 (F) 5＇-CTGCCTGAACGTCTATCAAGATC-3＇ +69FUT1 P16 (F) 5＇-AGAGTTTCCTCATGCCCACAGG-3＇ -90FUT1 P18 (R) 5＇-CTGCTACAGGACCACCAGCATC-3＇ +1203FUT1 PBEST (R) 5＇-ACCAGCAGCGCAAAGTCCCTGACGGGCACGGCCTC-3＇+893FUT2 P16 (R) 5＇-CTCCCTGTGCCTTGGA AGTGAT-3＇ +1094FUT2 P17 (F) 5＇-AACTGCACTGCCAGCTTCATGC-3＇ -832引物FUT1 P10和FUT1 P11衍生自FUT1基因表2在Landrace实验群体中，M307和HAL连锁群基因座的全部重组分数(θ)，优势对数评分(Z)和提供数据的动物数(N)基因座对 NθzS-ECF18R183 0.01 50.6M307-S 183 0.01 50.6M307-ECF18R 216 0.01 57.1M307-RYRl 198 0.02 47.2M307-GPI147 0.03 34.2M307-PGD147 0.04 24.5
表3在Landrace(SL)实验群体和随机选择的Large White(LW)猪中，4个基因座[S-FUT1(M307,M857)-ECF18R-RYR1]处的单元型频率品系 S,FUT1(M307,M857)，频率4(数目)ECF18R,RYR1处的单元型3SL sAGbT 70(28)sAGbC 5(2)sGGBC 15(6)sGABC 10(4)LW sAGbC 56(9)sGGBC 31(5)sGGBC 13(2)3S:A和O血型抑制基因(S和s)的基因座。
FUT1(M307):α(1,2)岩藻糖基转移酶(FUT1)基因中核苷酸307处的腺嘌呤(A)改变为鸟嘌呤(G)。FUT1(M857):FUT1基因中核苷酸857处的腺嘌呤(A)改变为鸟嘌呤(G)。ECF18R大肠杆菌F18受体。B表示显性易感等位基因，b表示抗性等位基因。RYR1骨骼肌ryanodine受体。C(胞嘧啶)是恶性过热的显性抗性等位基因而T(胸腺嘧啶)是易感等位基因。
4单元型频率以％表示，括号中为单元型的绝对数目。
表4:Landrace(SL)实验群体和随机选择的Large White(LW)猪中相关多态性的FUT1(M307)和ECF18R基因座的基因型分布，tetrachoric相关性(R)和联合的显著性(X2和w×X2)5FUTI/M307品系基因座 基因型A/GA/ArX2X2xw5SL ECF18R6b/b 1 113 0.98 213.1 42.6***B/b 106 1基因型 A/G,G/G A/ALW ECF18R6b/b 0 51.00 29.0 11.6***B/b,B/B 24 05根据Cotterman(1947)，将重量因子w=0.2(SL)和0.4(LW)用于校正因数据中包括相关动物而失去的精确性，***p＜0.001。
6ECF18R基因座处的基因型为b/b的动物对F18ab大肠杆菌细菌的粘附具有抗性，而基因型为B/b和B/B的动物对上述粘附是易感的。
方法1．引物使用衍生自人FUT1基因的引物从基因组DNA中扩增其猪对应物。由所得猪序列设计特异性引物，将该引物用于进一步的扩增和测序反应中(表1)。
2．筛选猪基因组文库用引物P7和P10得到猪FUT1探针，用该探针或猪FUT1 cDNA筛选猪基因组文库。用引物P7和P10从猪基因组DNA中得到FUT1探针，用经α32P dATP标记的(Prime ItⅡ,Stratagene)该探针筛选构建于SuperCos 1(Stragene,La Jolla,Ca,USA)中的猪基因组文库。于42℃将复本滤膜杂交15小时(50％甲酰胺，6×SSC,5×Denhardt’s,0.5％SDS,0.1mg/ml鲑精DNA),65℃洗涤两次达30分钟(1×SSC,0.1％SDS)之后，暴露于(15h,-80℃)X射线胶片后鉴定阳性菌落。
3．猪中期染色体原位杂交对粘粒克隆ETHs1,ETHs2,ETHs3,ETHs4和ETHs6进行荧光原位杂交(FISH)(Solinas Toldo等，1993)或对猪中期染色体进行直接原位染色体PCT(DISC PCR)。杂交前对中期染色体进行Q-显带和照相。使用生物素-16-dUTP通过随机引物法标记探针。使用亲和素-FITC和生物素化的抗亲和素进行信号检测和扩增。用4,6-diamidino-2-phenylindole负染染色体，按Solinas Toldo,1993所述测定粘粒的相对位置。
4．亚克隆在琼脂糖凝胶上分离探针阳性基因组菌落的酶消化物，转移至尼龙膜上，将探针阳性带亚克隆至质粒中以进行FUT1测序。由此方法得到的FUT1序列示于图1。
在0.8％琼脂糖凝胶上分离所有粘粒的KspI-,EcoRI-和KspI/EcoRI消化物，转移至Hybond N尼龙膜上(Meijerink等，1997)。将此印迹与经α32P dATP标记的猪FUT1 PCR产物(引物P6-P11和P7-P10)杂交。根据放射自显影信号，将ETHs1,-s2和-s3进一步亚克隆至pBluescriptSK-(Stratagene)，由亚克隆测定FUT序列。通过直接测序PCR产物，比较ECF18R阳性(BB/Bb)和阴性(bb)动物得自粘粒ETHs2和-s3的两个FUT-样开放阅读框(ORF)(FUT1和FUT2)的序列。
5．聚合酶链反应和直接测序使用Perkin Elmer Ready Reaction Dye Terminator试剂盒(PerkinElmer Cetus,Norwalk,CT,USA)和10pmol引物，用由95℃起始变性5分钟，接着95℃30秒，50℃15秒和60℃4分钟进行25轮循环组成的热程序进行循环测序。用于猪α(1,2)岩藻糖基转移酶基因扩增和测序的引物示于表1。考虑到因FUT1,FUT2和FUT2假基因的高度相似性所致的引物交叉退火的可能性，设计了其它的引物。在373A ABI测序仪(Applied Biosystems公司)上分析样品，用GCG程序包(Devereux,1984)进行序列分析。
6．产生可提供资料的后代在由4头公猪和16头母猪产生的221头Landrace猪和由不相关的猪之间9次交配产生的29头Large White猪中分析单个核苷酸的多态性。为了产生大量可提供资料的后代以检查编码ECF18受体的猪基因和选定多态性基因座之间的连锁，仅进行了B/b×b/b型可提供资料的Landrace交配。
7．定居试验在Bertschinger等，1993的研究中，也在定居试验中检测了上述Landrace猪的ECF18易感性。为此，断奶后立即用血清型为0139:K12(B):H1:F18的大肠杆菌菌株124/76接种猪(Rippinger等，1995)。每天监测猪粪便中排出的细菌。将定居的程度计算为两个最高粪便评分的平均值。平均粪便评分为3.5，相当于菌落形成单位(CFU)/g的对数为6.7或更高被认为是对定居敏感。此界限的根据是低于此值即无死亡率和得自完全抗性小猪的评分。
8．核苷酸多态性的连锁分析将单个核苷酸多态性的结果与Vgeli等(1996)所述的体外粘附试验中鉴定的ECF18R定型数据和Vogeli等(1996)所述的GPI-,PGD-,α-1-B-糖蛋白-(AIBG),ryanodine受体(RYR1),EAH-和S-基因座的定型数据比较。使用CRI-MAP 2.4版本的程序(Green等，1990)进行成对连锁分析并计算重组分数。通过将上述基因座依次插入图谱中以进行多点连锁分析。计算Landrace家族的亲代动物和8头亲代Large White猪的单元型频率，所述动物的ECF18R单元型是由得自后代的资料确定的。计算所有Landrace和Large White猪后代的ECF18R和FUT1(FUT1/M307)中的突变(多态性)的四氯相关性。
9．Southern印迹分析用KspI(1,4,7),EcoRI(2,5,8)和KspI/EcoRI(3,6,9)消化并在0.8％的琼脂糖凝胶上分离之后，对粘粒ETHs1(1-3),ETHs2(4-6)和ETHs3(7-9)进行Southern印迹分析。与经α32P dATP标记的5’FUT1片断(引物P6-P11)的杂交导致KspI消化物(泳道4)和KspI/EcoRI消化物(泳道6)中有相同的940bp杂交带。然而，与3’FUT1片断(引物P7-P10)(表1)的杂交在泳道4显示出6.2kb KspI片断和在泳道6显示出1.1kb KspI/EcoRI带。5’和3’FUT1片断都与泳道5中相同的4.6kb EcoRI片断杂交。这表明粘粒ETHs2中含有的FUT1基因中存在KspⅠ位点。3’FUT1片断的交叉杂交检测到2.7kb(泳道2,3,8和9)和8.2kb(泳道8和9)的带，分别鉴定出FUT2假基因(不完全的ORF)和FUT2基因序列。
10．限制性片断的多态性使用多种限制性酶通过限制性长度多态性分析检测到猪FUT1基因中的(A)M307 G至A和(B)M857 G至A的突变。用CfoI(A)和AciI(B)消化扩增的FUT1片断导致限制性片断的多态性。第一泳道是100bp的标记物，片断长度以碱基对表示。(A)M307A/A基因型(泳道2)产生了328和93bp的限制性片断，而M307G/G基因型(泳道4)产生了93,241和87bp的片断，杂合的M307A/G基因型(泳道3)显示出所有4个片断。
(B)M857A/A基因型(泳道2)的消化产生了174bp的片断，而M857G/G基因型(泳道4)产生了136和38bp的片断，M857A/G基因型(泳道3)产生了所有3个片断。
11．猪的来源Swiss Landrace实验群体的数据得自两个种，这两个种是苏黎世大学兽医细菌学研究所建立的。Large White,Swiss Landrace,Duroc,Hampshire和Pietrain猪群的其它猪得自瑞士的不同猪群。其它猪随机得自美国中西部的农场。
参考文献Bertschinger等(1993)，兽医微生物学35:79-89Cohney等(1996)免疫遗传学44:76-79Devereux等(1984)核酸研究1:387-395Fujii等(1991)科学253:448-451Green等(1990)CRI-MAP,2.4版本的文献，St.Louis:华盛顿大学医学院Kelly等(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5843-5847Meijerink等(1997)动物遗传学第25次国际研讨会P44Rippinger(1995)兽医微生物学，45:281-295Solinas Toldo等(1993)Mamm.Genome 4:720-727Thurin和Blaszczyk-Thurin(1995)生物化学杂志270(44):26577-26580Vogeli等(1996)动物遗传学27:321-328Vogeli等(1997)Schweiz Arch.Tierheilk 139:479-484美国专利5,358,648,Maclennon等美国专利5,552,144,Valery等WO 8604604 987P，发明人PetersonWO 9628967，发明人Koike,CWO 9413811，发明人Imberechts和LintermansTW 266264，发明人Jeng和Liou
权利要求
1．鉴定大肠杆菌肠定居的抗性猪的方法，所述方法包括a．测定猪生物样品中是否存在与定居抗性相关的遗传多态性；和b．如果猪的多态性是纯合的，则可推断猪是抗性的。
2．鉴定大肠杆菌相关肠紊乱的抗性猪的方法，所述方法包括a．测定猪生物样品中猪α(1,2)岩藻糖基转移酶基因1第307位的含氮碱基是否仅是腺嘌呤；和b．如果第307位的含氮碱基仅是腺嘌呤，即可将猪鉴定为抗性。
3．繁殖对大肠杆菌相关疾病具有抗性的猪的方法，所述方法包括a．选择α(1,2)岩藻糖基转移酶1基因中具有遗传多态性因而将其鉴定为对大肠杆菌相关肠疾病具有抗性的猪的繁殖猪；和b．繁殖所选择的猪。
4．权利要求1,2或3的方法，其中大肠杆菌是菌株F18。
5．分离的DNA分子，其中猪α(1,2)岩藻糖基转移酶1基因具有多态性。
6．分离的DNA分子，其具有根据图1的核苷酸序列。
7．权利要求6的分离的DNA分子，其中第307位的鸟嘌呤被腺嘌呤取代。
8．分离的DNA分子，其与权利要求6的核苷酸序列互补。
9．权利要求6的分离的DNA分子，其中第857位的鸟嘌呤被腺嘌呤取代。
10．权利要求6的分离的DNA分子，其第229位的核苷酸为苏氨酸。
11．由权利要求5或6的DNA分子编码的多肽，所述分子具有α(1,2)岩藻糖基转移酶活性。
12．权利要求5或6的分离的DNA分子的部分，所述部分包括将大肠杆菌定居抗性猪和敏感猪区分开的核苷酸序列。
13．检测大肠杆菌F18受体的分子测定法，所述测定法包括从猪成核细胞中分离DNA；使用与猪α(1,2)岩藻糖基转移酶基因1的DNA序列互补的寡核苷酸作为引物，在聚合酶链反应中扩增所述DNA；用至少一种限制性酶进行限制性酶消化；通过凝胶电泳分离所得片断；测定各片断的数目和长度；和由片断的数目和长度确定存在哪一种受体。
14．权利要求14的分子测定法，其中限制性酶是CfoI。
15．检测大肠杆菌F18受体的试剂盒，所述试剂盒在独立的容器中含有与猪α(1,2)岩藻糖基转移酶基因1的多态性DNA序列互补的寡核苷酸。
16．猪多肽，其具有α(1,2)岩藻糖基转移酶活性和第103位的氨基酸取代。
17．权利要求17的多肽，其进一步的特征在于第286位具有氨基酸取代。
18．猪α(1,2)岩藻糖基转移酶的多态性在开发治疗患有大肠杆菌相关疾病的猪的药物中的用途。
全文摘要
本发明提供了以高水平的敏感性和特异性将在基因上对F18大肠杆菌感染的相关疾病敏感的猪与抗性猪区分开来的非侵害性方法和组合物。使用α(1,2)岩藻糖基转移酶(FUT1)基因的DNA多态性区分抗性猪和易感猪。本发明包括由核苷酸多态性编码的具有氨基酸取代的多肽,区分大肠杆菌F18－粘附抗性,杂合(载体)和纯合易感猪的分子诊断试验和试剂盒。分子试验以高敏感性和特异性鉴定猪对水肿病和断奶后腹泻的易感性,因此猪饲养者可利用该试验提高猪的抗性。本发明多态性的有关资料可以让人们深入了解大肠杆菌相关肠紊乱的病因和治疗方法。
文档编号A61P1/00GK1314953SQ98807387
公开日2001年9月26日 申请日期1998年5月20日 优先权日1997年5月20日
发明者B·T·波斯沃斯, P·沃格利 申请人:生物技术研究及发展公司, 美国农业部, 苏黎世瑞士联邦技术协会