专利名称：April－具有生长效应的新的蛋白质的制作方法
背景技术：
本发明涉及是肿瘤坏死因子家族的成员的新的配体和多肽。新的配体命名为“增殖诱导配体”即April。这些蛋白或它们的受体可具有抗癌和/或免疫调节应用。而且，用这些新配体的基因转染的细胞可用于基因治疗来治疗肿瘤、自身免疫和炎症疾病或遗传病并且阻断这些蛋白的抗体可具有免疫调节应用。发明背景肿瘤坏死因子(TNF)相关的细胞因子是宿主防御和免疫调节的介质。此家族的成员以锚立在膜上的形式存在，通过细胞间接触局部发挥作用或者作为能扩散到更远的目标的分泌蛋白存在。受体的平行家族标志着导致靶组织中细胞死亡或细胞的增殖和分化的这些分子的存在。目前，配体和受体的TNF家族至少有13个可识别的受体-配体对，包括TNFTNF-R；LT-αTNF-R；LT-α/βLT-β-R；FasLFas；CD40LCD40；CD30LCD30；CD27LCD27；OX40LOX40和4-1BBL4-1BB；trance/rankLLight and Tweak。即使在最相关的实例中，尽管氨基酸的相关性约是50％，编码这些配体的DNA序列仅有约25-30％的相同。
此细胞因子受体家族的明确的特征是通过两个不同的TNF受体的分子克隆首次揭示出的在富含半胱氨酸的细胞外结构域中发现的i。此基因家族编码带有细胞外配体结合结构域、单个跨膜区和参与激活细胞的功能的胞质区的糖蛋白特征的I型跨膜蛋白。富含半胱氨酸的配体结合结构域展示出依赖特殊的家族成员多次重复的紧密结合的二硫键连接的核心结构域。大多数受体有4个结构域，尽管可以少到3个或者多到6个。
配体TNF家族中的蛋白的特征是通常含有几个认为是作为终止转移序列的赖氨酸或精氨酸残基的一般较短的亲水氨基酸的短的N-端序列。下面跟着一个跨膜区和不同长度的将C-端受体接合结构域从膜分开的细胞外结构域。此结构域有时被称为“柄”(特征性高级结构)。C-端结合结构域包含蛋白的主体并且经常但不总是含有糖基化位点。这些基因缺少经典的信号序列，其特征在于位于细胞外的带有C端结构域的I型膜蛋白、II型膜蛋白以及位于胞质内的短的N-末端。在某些情况下，如TNF和LT-α，在特征性高级结构内的裂解在蛋白加工过程中可提早发生并且随后发现配体主要是分泌形式。然而，大部分配体以膜的形式存在，介异定位信号。
这些配体的结构已经由TNF、LT-α和CD40L的晶体学分析而充分确定。TNF和淋巴毒素-α(LT-α)都是在带有“jelly roll”或“Greek key拓朴结构”的两个反平行β-折叠的三明治结构中。Cα和β残基之间的均方根偏差是0.61C，这提示它们在分子拓扑图上的高度相似性。由CD40L、TNF和LT-α的分子研究呈现出的结构特点是倾向于聚合成寡聚复合物。寡聚结构的本质是在相邻亚基的汇合处形成受体结合位点以产生多价配体。通过TNF、CD40L和LT-α的晶体结构分析表明它们的四级结构是以三聚体的形式存在。在不同的配体之间保守的许多氨基酸位于支架结构β-折叠的序列中。由于这些支架结构的部分在多种家族成员中是保守的，因此在所有这些分子中保留这种基本的三文治结构是可能的。由于亚基构象可能保持相似，四级结构也可维持。
TNF家族成员最好可描述成控制细胞存活和分化的免疫系统中的总开关。与TNF家族的其它主要的锚定在膜上的成员相反，目前只有TNF和LTα被认为是分泌型细胞因子。尽管TNF的膜形式已被鉴定出并且可能具有独特的生物学功能，分泌型TNF作为一般警报信号从触发事件的部位向更远的细胞发挥作用。因此，TNF分泌可扩大事件导致脉管系统内壁已充分描述的改变以及细胞的炎症状态。相反的是，该家族的膜结合成员通过TNF型受体仅仅向直接接触的细胞发送信号。例如T细胞只向那些通过同源的TCR相互作用导致直接接触的B细胞提供CD40介导的“帮助”。能够诱导细胞死亡的相似的细胞与细胞接触的限制可应用于充分研究的Fas系统。
看来可根据TNF诱导细胞死亡的能力(表III)，可将TNF配体分为三组。首先，TNF、Fas配体和TRAIL可有效地诱导许多细胞系的细胞死亡而且它们的受体大部分可能具有好的典型的死亡结构域。DR-3(TRAMP/WSL-1)的配体也可能属于此类型。其次是那些仅在少数细胞类型中触发更弱的死亡信号的配体并且TWEAK、CD30配体和LTα1β2是这一类型的实例。这组配体如何在缺乏典型的死亡结构域的情况下触发细胞死亡是个令人感兴趣的问题并且这提示有独立的更弱的死亡信号机制存在。最后是那些不能有效地传递死亡信号的成员。可能所有组配体都对某些细胞类型具有抗增殖效应并随后诱导细胞分化如CD40(Funakoshi等，1994)。
近年来TNF家族迅速扩充，包括参与免疫系统调节的至少11种不同的信号通路。TWEAK和TRAIL的广泛的表达模式提示此家族中仍有更多的功能变化应揭示。最近这一点在影响劳斯肉瘤病毒和单纯疱疹病毒的复制能力的两个受体的发现中以及TNF具有抗病毒能力和痘病毒编码引诱物TNF受体的以往的观察中已特别地强调(Brojatsh等，1996；Montgomery等，1996；Smith，1994；Vassalli，1992)。TNF是败血症休克和恶病质的介质iii，并且参与造血细胞发育的调节iv。作为炎症和抵抗细菌、病毒和寄生虫感染的介质v，TNF发挥主要作用并且具有抗肿瘤活性vi。TNF还与多种自身免疫疾病有关vii。TNF可由几种细胞产生，包括巨噬细胞、成纤维细胞、T细胞和自然杀伤细胞viii。TNF与两种不同的受体结合，每种都通过特异的细胞内信号分子起作用，因此形成TNF的不同效应ix。TNF可以膜结合形式存在，也可作为可溶的分泌型细胞因子存在x。
LT-α具有多种与TNF相同的活性，即与TNF受体结合xi，但是不象TNF，LT-α表现为主要由激活的T细胞和一些β-类淋巴细胞肿瘤分泌xii。LT-α和LT-β的异数复合物是与LT-β受体结合的膜结合复合物xiii。由于LT-β的遗传破坏导致脾脏中T和B细胞的结构破坏及淋巴结的缺失，LT系统(LTs和LT-R)表现为参与周围淋巴器官的发育xiv。LT-β系统也参与某些腺癌细胞系的细胞死亡xv。
TNF家族的另一个成员Fas-L主要在活化的T细胞上表达xvi。它通过所知的程序性细胞死亡或凋亡的机制诱导具有其受体的细胞包括肿瘤细胞和HIV-感染的细胞死亡xvii。而且，Fas或Fas-L缺陷可引起淋巴增殖紊乱，这证实了Fas系统在免疫应答调节中的作用xviii。Fas系统还参与慢性肝炎感染引起的肝脏损伤xix和HIV感染的病人的自身免疫xx。Fas系统还参与HIV病人的T细胞破坏xxi。此家族中的另一成员TRAIL也参与不同来源的多种转化细胞系的死亡。
TNF家族的另一成员CD40-L在T细胞上表达并诱导调节具有CD40的B细胞xxiii。而且，CD40-L基因的改变引起已知的疾病X-连锁的高IgM综合症xxiv。CD40系统也参与多种自身免疫性疾病xxv并且已知CD40-L具有抗病毒性质xxvi。尽管CD40系统参与拯救凋亡的B细胞xxvii，在非免疫细胞中它诱导凋亡xxviii。许多其它的TNF家族的淋巴细胞成员也参与共同刺激xxix。
一般地，TNF家族的成员在控制免疫系统和活化急性宿主防御系统中具有重要调节作用。考虑到目前在操作TNF家族的成员用于治疗中获得了进展，此家族的成员可提供控制疾病的独特的方法是可能的。该家族的某些配体可直接诱导许多转化的细胞如LT、TNF、Fas配体和TRAIL(Nagata，1997)的凋亡。Fas和可能的TNF及CD30受体的激活能发挥免疫调节功能诱导非转化淋巴细胞死亡(Amakawa等，1996；Nagata，1997；Sytwu等，1996；Zheng等1995)。一般而言，死亡是在位于TNF受体胞质一侧的死亡结构域聚集之后触发的。死亡结构域组织引起Caspase级联激活的多个信号转导成分集合起来(Nagata，1997)。一些受体缺少典型的死亡结构域，如LTb受体和CD30(Browning等，1996；Lee等，1996)尽管作用更微弱，但还能诱导细胞死亡。尽管如在CD30裸鼠上的研究表明胸腺负选择中起死亡作用一样这种情况不清楚，这些受体的主要功能是诱导细胞分化而且在某些转化的细胞系中死亡是反常的后果是可能的(Amakawa等，1996)。相反地，需要通过其它通路如CD40的信号来维持细胞存活。因此，需要识别和鉴定TNF家族成员的其它分子从而提供控制疾病和调控免疫系统的其它方法。
已表明TNF家族的某些成员可提供治疗的抗肿瘤利益，例如与IL-2结合。(见，例如U.S5,425,940)然而，尚不知道用于癌症的完全满意的疗法。组合化疗普遍应用于临床和研究中，如应用抗代谢物、烷化剂、抗生素、一般毒物等。单独或联合施用这些药物以获得对癌症的细胞毒效应、和/或减少或消除抗药细胞的出现，以及降低副作用。发明概述因此，本发明涉及显著地避免了相关领域的局限和缺点引起的一个或多个问题的、被称为APRIL的新的多肽。发明者已发现了细胞因子TNF家族的新成员并且明确了这种蛋白的人和鼠的氨基酸序列以及编码这些蛋白的DNA序列。申请的发明可用来确立用于如下面更为详细讨论的许多疾病和病症的新的疹断和治疗以及获得关于免疫系统及其过程的信息并操纵之。另外，本发明还参与癌中细胞死亡的诱导。
本发明的其它特点和优点将在后面的描述中论及，其中部分从描述中可以看出是明显的或者可通过本发明的实践而了解到。通过所写的描述及其权利要求以及附图中特别指出的组合物和方法可认识和获得本发明的目标和其它优点。
因此，为获取这些或其它优点并与本发明的目的一致，如此处收录并广泛描述的，本发明包括编码APRIL的DNA序列。具体地，本发明涉及编码人APRIL的DNA序列(SEQ.ID.NO.1)。另外，申请专利的发明涉及这种新的配体的氨基酸序列。人的APRIL氨基酸序列见SEQ.ID.NO.2中所示。另外，发明者在此处显示了鼠APRIL的DNA和氨基酸序列，分别见SEQ.ID.NOS.3和4中所示。在其它实施方案中，本发明涉及当与申请专利保护的DNA序列或其片段杂交时，与编码此配体的C端受体结合结构域的DNA序列具有至少50％同源性的序列和编码带有SEQ.ID.NO.1中确定的序列的APRIL或具有相似的生物学活性的蛋白的序列。
本发明的某些实施方案进一步涉及编码其序列与表达控制序列可操作连接的APRIL的DNA序列。任何合适的表达控制序列可用于申请专利的本发明并且易于由本领域技术人员进行选择。
本发明还包括含有编码APRIL或其片段的序列的重组DNAs以及将稳定整合的APRIL序列导入其基因组或具有游离基因元件的宿主。任何合适的宿主可用于本发明并且易于由本领域技术人员进行选择而无需过多试验。
在其它的实施方案中，本发明涉及包括有培养转化的宿主的步骤的产生基本上纯APRIL的方法。又一些其它实施方案中，本发明涉及基本上不含正常有关的动物蛋白的APRIL。
本发明包括具有SEQ.ID.NO.2中确定的氨基酸序列的APRIL配体和其片段或同系物。在不同的实施方案中，氨基酸和/或DNA序列可含有如下面进一步明确的保守插入、缺失和替换或者含有所述序列的片段。
其它实施方案中本发明涉及含有APRIL、可用于直接触发APRIL介导的药理学事件的可溶的构建体。这些事件在刺激生长、治疗癌症、肿瘤或者用于治疗免疫性疾病的免疫系统调节中具有有用的治疗学优点。申请专利的配体的可溶形式可再进行遗传工程操作与容易识别的标记结合，从而有利于鉴定这些配体的受体。
另外，某些实施方案涉及抗APRIL的抗体以及它们治疗癌症、肿瘤或调节免疫系统以治疗免疫性疾病的用途。
本发明的其它实施方案涉及如此处公开并申请专利保护的应用APRIL基因的基因治疗方法。
本发明的药物制剂可选择地包括药学上可接受的载体、佐剂、填充剂或其它药物组合物而且可以本领域中已知的多种形式或途径中的任一种给药。
可理解的是前面的一般描述和后面的详细描述都是示范性和说明性质的并且如申请专利保护的，打算提供本发明的进一步说明。
为更进一步理解本发明，详细说明中包括并引用了附图并且成为其中一部分用来图解说明本发明的几个实施方案，并且与描述一起用来解释本发明的原理。附图简述图的说明
图1.(A)预测的人APRIL氨基酸序列。表示了预测的重组的可溶性APRIL(sAPRIL)的跨膜区(TM，框起来的)，潜在的N-连接的糖基化位点(星号)和N末端。(B)APRIL的细胞外蛋白序列和TNF配体家族的某些成员的比较。黑框和阴影框内分别表示了相同的和同源的残基。TNFα，肿瘤坏死因子α，LTα，淋巴毒素α，FasL，Fas(CD95)配体，TRANCE，RNAK配体。图2.APRIL的表达(A)用APRIL cDNA作为探针的不同的人组织的Northern印迹杂交(每泳道2μg polyA+RNA)。(B)不同肿瘤细胞系中的APRIL mRNA表达早幼粒细胞白血病HL60；Hela细胞S3；慢性骨髓性白血病K562；成淋巴细胞白血病Molt-4；伯基特淋巴瘤Raji；结肠直肠腺癌A459；黑色素瘤G361。(C)四种不同的人肿瘤(T)和正常组织(N)中的APRIL mRNA表达。18S rRNA带表示加样相等。(D)原发性结肠癌中的APRIL mRNA表达。原位杂交显示与正常结肠组织相比，人结肠癌中APRIL信息丰富。结肠肿瘤组织切片和相邻的正常结肠组织与反义APRIL35S-标记的cRNA杂交，而且结肠肿瘤组织还与正义APRIL35S cRNA杂交作为对照(负对照)。上面的图是暗视野的显微照片，下面的图是相对的亮视野的显微照片。图3.APRIL刺激细胞生长。(A)如加入可溶的APRIL24小时后测定的Jurkat(人白血病T细胞)增殖的剂量依赖增长。对照组是Fas配体(FasL)、TWEAK及无配体(空白对照)(左图，细胞生存力；右图，3H-胸腺嘧啶核苷掺入)。(B)FLAG-标记的APRIL对肿瘤细胞生长的免疫耗竭的影响。FLAG-标记的APRIL的增殖效应被抗-FLAG的抗体中和，但不被抗-myc的抗体中和。(C)APRIL对Raji(人伯基特淋巴瘤B细胞)，A20细胞(小鼠B淋巴瘤)，BJAB(人B淋巴瘤)，COS(犬上皮细胞)，MCF-7(人乳腺腺癌)，HeLa(人上皮样癌)和ME260(人黑色素瘤)增殖速度的影响。(D)胎牛血清浓度对APRIL诱导的Jurkat细胞增殖的影响。图4.APRIL加速肿瘤生长。(A)APRIL转染的NIH-3T3克隆的鉴定。应用抗-FLAG抗体通过Western印迹杂交分析不同克隆的FLAG-APRIL水平。非特异检测高分子量蛋白，箭头所指的是APRIL蛋白。(B)表达APRIL的NIH-3T3克隆比模拟转染的克隆生长快。(C)表达APRIL的NIH-3T3克隆的肿瘤生长增加。给裸鼠皮下注射NIH-3T3细胞(1×105个细胞)和APRIL(NIH-AP，2个不同的克隆)转染子(1×106个细胞)并监测肿瘤生长。图5.排列人和小鼠APRIL氨基酸序列表明两种蛋白之间广泛的一致性。相同的残基用上面的点标记。下划线的残基代表潜在的N-连接的糖基化位点。开始的蛋氨酸被认为是可能的起始位点，然而，更上游的阅读框内蛋氨酸可能是实际起始位点，例如在人的序列中。详细描述现在详细介绍本发明的优选的实施方案。本发明涉及编码人或小鼠APRIL的DNA序列、片段及其同系物以及用它们转化的宿主中那些DNA序列的表达。本发明涉及这些DNA序列和他们编码的多肽的应用。另外，本发明包括APRIL或其片段人和小鼠的氨基酸序列以及含有它们或从它们衍生的药物组合物。本发明涉及用APRIL刺激细胞生长的方法，或者，选择性地，应用直接抗APRIL抗体或APRIL受体抑制肿瘤发生的方法。A.定义此处所用的“同源的”指的是相比较的分子序列之间的序列相似性。当相比较的两个序列中的某一位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，如两个DNA分子中的某一位置都被腺嘌呤占据，那么在那一位置分子是同源的。两序列之间同源性的百分比的函数是两序列共有的匹配或同源位置数目除以相比较的位置数目再乘以100。例如，如果两序列中6/10的位置是匹配的或同源的，那么两序列是60％同源。例如，DNA序列ATTGCC和TATGGC是50％同源。一般地，在两序列进行序列排列对比给出最大同源性时进行比较。
如此处所用的，术语“癌症”指任何肿瘤疾病，包括如细胞疾病，例如肾细胞癌、卡波西肉瘤、慢性白血病、乳腺癌、肉瘤、卵巢癌、直肠癌、咽喉癌、黑色素瘤、结肠癌、膀胱癌、肥大细胞瘤、肺癌、乳房腺癌、咽鳞状细胞癌和胃肠或胃癌。优选地，癌症为白血病、肥大细胞瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、乳房腺癌和咽鳞状细胞癌。
如此处所用的多肽的“纯化制剂”或“基本上纯化的制剂”指的是从它自然产生时带有的其它蛋白质、脂类和核酸分离出的多肽。优选地，多肽也可从用于纯化它的其它物质如抗体、基质等分离。
此处所用的“转化的宿主”指的是包括带有导入其基因组的稳定整合的序列即编码APRIL序列的任意宿主。
如此处所用的“治疗”包括任意治疗学上的治疗，如施用治疗剂或物质，如药物。
“基本上纯的核酸”，如基本上纯的DNA是满足下面一点或两点的核酸(1)不与一个或两个序列如在核酸来源的有机体的自然出现的基因组中直接邻接的编码序列直接邻接的(即一个在5’端一个在3’端)；或者(2)基本上没有在核酸来源的有机体中出现的核酸序列。此术语包括，例如整合入载体如自我复制质粒或病毒或者原核细胞或真核细胞的基因组DNA的或者以不依赖于其它DNA序列的独立的分子(如PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)存在的重组DNA。基本上纯的DNA还包括是编码APRIL的杂合基因的部分的重组DNA。
在此，术语“肽”、“蛋白质”和“多肽”可互换使用。
此处所用的“生物学活性”指可直接或直接表现出的体内或体外活性。APRIL的生物学活性片段可具有，例如与APRIL活性位点70％的氨基酸同源性，更优选地至少80％以及最优选地至少90％的同源性。与APRIL的一致性或同源性在此定义为候选序列中与SEQ.ID.NOS.2或4中的APRIL残基一致的氨基酸残基的百分比。
此处所用的“配体”一般指APRIL。除非另有指出，本发明的实践采用本领域技术中细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术的描述见文献。引言在此详细描述了TNF家族的新成员APRIL。发明者发现，尽管正常组织中APRIL的转录物是低量的，但在几种肿瘤细胞系中以及结肠癌、转移性淋巴瘤和甲状腺肿瘤中检测到高水平的mRNA。在体外，加入重组APRIL刺激了不同细胞系的增殖。而且，相比于模拟转染子，将APRIL转染入NIH-3T3细胞显著加速了裸鼠的肿瘤生长。APRIL在体外和体内的表达和对肿瘤细胞的生长刺激效应表明APRIL与肿瘤发生有关联。
由于APRIL在肿瘤细胞中大量表达并且刺激许多不同肿瘤细胞系的生长，因此看来它在TNF家族成员中是独特的。考虑到APRIL的明显作用是肿瘤发生，APRIL的拮抗性抗体或APRIL受体将提供癌症治疗的新方法。
B.本发明的DNA序列如此处所描述的，本发明的一方面特征是包括编码APRIL的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1中描述的DNA和/或这些核酸的等价物的基本上纯的(重组的)核酸。此处所用的术语核酸可包括片段和等价物，例如编码功能上等价的肽的序列。等价核苷酸序列可包括由于一个或多个核苷酸替换、添加或缺失如等位基因变异体、突变等而不同的序列以及由于遗传密码简并而与SEQ.ID.NO1中所示的编码APRIL的核苷酸不同的序列。
尽管本领域技术人员会理解到小鼠的或来自其它物种的编码的APRIL与人的具有高度同源性的序列也包含在这里，但对本发明进行的一般性描述参考的是人的序列。人的蛋白表现出具有TNF家族的所有特征，即，II型膜蛋白的有机构成和将蛋白折叠成TNF反平行β-折叠结构的序列基序的保守性。
本发明的序列可用于制备一系列DNA探针，用于筛选多种天然和合成的DNA集合中那些与APRIL或其片段或其衍生物密切相关的DNA序列的存在。本领域技术人员将认识到此处所介绍的APRIL也指的是其生物学活性衍生物、片段或同系物。
本发明的APRIL编码DNA序列可用于产生在用它们转化的不同的原核和真核宿主中表达的申请专利的肽。这些肽可用于抗癌和免疫调节应用。一般而言，这包括培养用含有编码APRIL的DNA分子转化宿主的步骤、该分子与表达控制序列可操作连接。
本发明的DNA序列和重组DNA分子可用多种宿主/载体组合来表达。例如，有用的载体可包括染色体、非染色体或合成DNA序列的区段。本发明的表达载体的特征在于为了控制和调节DNA序列的表达，用至少一种可与插入载体的APRIL DNA序列可操作连接的表达控制序列。
而且，在每一个表达载体内，可选择不同的位点插入本发明的序列。这些位点通常由切割它们的限制性内切酶命名，而且本领域技术人员已充分认识了这些位点和内切酶。当然可理解的是，本发明中有用的表达载体不需具有用于插入所需DNA片段的限制性内切酶位点。而是采用其它方法将片段克隆入载体。表达载体，特别是其位点是选择用于插入选择的DNA片段以及与表达控制序列与它可操作连接，是由多种因素来决定的。这些因素包括但不限于，表达蛋白的大小、目的蛋白对宿主细胞酶的蛋白水解降解的易感性、易受特定的内切酶作用的位点数目、被纯化过程中证实难以去除的宿主蛋白污染或与表达的蛋白结合。其它可被考虑的因素包括表达特征如起始和终止密码子相对于载体的位置和其它为本领域技术人员所认识的因素。关于申请专利保护的DNA序列的载体和插入位点的选择根据权衡这些因素而确定，不是所有选择对目的应用同等有效。然而，对于本领域技术人员分析这些参数并选择出根据特殊的应用而定的合适系统是常规工作。
本领域技术人员可方便地对表达控制序列进行适当的修饰以获得高水平的蛋白表达，即通过替换密码子或选择那些被特定的有机体优选利用的特殊氨基酸的密码子以便使蛋白水解降到最低或者改变糖基化组成。同样，可将半胱氨酸换成其它氨基酸以使产生、重折叠或稳定问题简单化。
因此，不是所有宿主/表达载体组合在表达本发明的DNA序列中等效发挥作用。然而，本领域技术人员可对宿主/表达载体组合进行具体选择。可考虑的因素包括，例如宿主与载体的相容性，对DNA序列编码的蛋白对宿主的毒性、回收目的蛋白的容易程度、DNA序列和与其可操作连接的表达控制序列的表达特征、目的蛋白的生物安全性、耗费和折叠、形式或其它必需的表达后修饰。
由用本发明的序列转化的宿主产生的APRIL以及根据本发明的处理纯化的天然APRIL或者从申请专利保护的氨基酸序列产生的APRIL可用于抗癌、抗肿瘤和免疫调节的多种组合物和方法中。它们也可用于在其它疾病的治疗和方法中。
本发明还涉及在此公开的DNA序列用于在异常条件下，即基因治疗情况下表达APRIL的用途。另外，在对于某些应用合适的启动子的引导下，APRIL也可在肿瘤细胞中表达。这种表达可增强抗肿瘤免疫应答或直接影响肿瘤的存活。通过改变局部免疫应答，APRIL还可能影响移植器官的存活。这种情况下，移植物本身或周围的细胞可被编码APRIL的工程基因修饰。
本发明的另一方面涉及“抗原”疗法中编码任何APRIL的分离的核酸的用途。如此处所用的，“反义”治疗是指给予或原位产生在细胞环境下，与细胞mRNA和/或编码目标APRIL序列的DNA特异性杂交的寡核苷酸或其衍生物，以便抑制编码的蛋白的表达，即通过抑制转录和/或翻译。可通过经典的碱基对互补性结合或者例如，就与DNA双螺旋结合而言是通过与双螺旋大沟间的特异的相互作用。一般地，“反义”疗法指本领域普遍采用的一系列技术并包括依赖于与寡核苷酸序列特异结合的任何疗法。
本发明的反义构建体可作为如表达质粒运送，当其移入细胞时，产生与编码APRIL的细胞mRNA的至少一部分互补的RNA。选择性地，反义构建体可以是在体内产生的寡核苷酸探针。这些寡核苷酸探针是优选修饰的对内源核酸酶有抗性的寡核苷酸，因此在体内是稳定的。用作反义寡核苷酸的代表性核酸分子是DNA的磷酰胺化合物磷酰胺化合物、磷硫醇盐和甲基磷酸酯类似物(见如5,176,996；5,264,564；和5,256,775)。另外，反义疗法中有用的寡聚体的一般方法已有评论，具体地在此引用作为参考的有Van Der Krol等，(1988)生物技术6958-976；和Stein等(1988)癌症研究482659-2668。
C.APRIL和其氨基酸序列如上面讨论的APRIL是TNF家族的成员。APRIL蛋白、片段或其同系物可能具有广泛的如下文中更详细讨论的治疗和诊断应用。
尽管APRIL精确的三维结构不清楚，预测其作为TNF家族的成员，可能具有本家族的其他成员共有的某些结构特征。
申请专利保护的APRIL序列与人TNF家族的其它成员的对比揭示了大量的结构相似性。在细胞外结构域，所有蛋白都具有几个序列保守区。APRIL的细胞外结构域的整个序列的同源性表现出与FasL的同源性最高(21％氨基酸一致)、与TNFα(20％)、与LT-β(18％)、然后是TRAIL、TWEAK和TRANCE(15％)。图2。
本发明的新的多肽与一种尚未被鉴定的受体发生特异性相互作用。然而，在此公开的肽和方法使与APRIL或其片段特异地相互作用的受体的鉴定成为可能。
某些实施方案中申请专利的发明包括来源于能与其受体结合的APRIL。可以几种方法产生APRIL片段如重组、PCR、蛋白水解消化或化学合成方法。可通过从编码多肽的核酸分子的一端或两端去除一个或多个核苷酸产生多肽的内部或末端片段。表达诱变处理的DNA产生多肽片段。
也可采用本领域已知的技术如传统的Merrifield固相f-moc或t-boc化学合成法合成多肽片段。例如，可将本发明的肽和DNA序列任意分为没有片段重叠的所需长度的片段或者分为所需长度的重叠片段。下文中更详细地描述了这些方法。
D.产生APRIL的可溶形式APRIL的可溶形式通常能有效地发出信号并因此可作为目前模拟天然膜形式的药物应用。可能此处申请专利保护的APRIL天然就是作为可溶的细胞因子分泌的，然而，如果不是这样，可对基因再操作基因来迫使分泌。为产生APRIL的可溶的分泌形式，可以在DNA水平去除N-末端跨膜区和特征性高级结构区的某部分并且将它们换成允许在选择的表达系统中有效地蛋白水解切割的I型或II型前导序列。技术人员可改变分泌表达构建体中保留的特征性高级结构的数量以优化受体结合性质和分泌效率。例如，可制备含有所有可能的特征性高级结构长度的构建体即N-端截体以便产生从氨基酸81到139的蛋白质。由这种类型分析可产生最理想长度的特征性高级结构序列。
E.与APRIL反应的抗体的产生发明还包括与APRIL或其受体特异性反应的抗体。可采用常规方案制备抗蛋白/抗肽的抗血清或单克隆抗体(见例如，抗体实验室手册，Harlow和Lane编辑(冷泉港出版社1988)。可用肽的免疫原性形式免疫哺乳动物如小鼠、仓鼠或家兔。将免疫原性赋予蛋白或肽的技术包括与载体结合或本领域熟知的其它技术。
可在存在佐剂的情况下施用APRIL的免疫原性部分或其受体。可通过检测血浆或血清中的抗体效价来监测免疫进程。将免疫原作为抗原利用常规的ELLSA或其它免疫分析方法来评估抗体的水平。
优选的实施方案中，本主题抗体对APRIL的抗原决定簇或其受体，如SEO.ID.NO.2的多肽抗原决定簇或者密切相关的人或非人哺乳动物同系物(如70，80或90％同源的，更优选地至少95％同源的)具有免疫特异反应性。本发明的又一更优选的实施方案中，抗APRIL或抗APRIL受体抗体与蛋白如与SEQ.ID.NO.2的同源性小于80％；优选地小于90％并且最优选地小于95％的蛋白没有明显的交叉反应(即特异地反应)。“无明显交叉反应”意味着抗体与非同源蛋白的结合亲和性小于与SEQ.ID.NO.2蛋白的结合亲和性的10％，更优选地小于5％以及甚至更优选地小于1％。
此处所用的术语抗体用来包括也与APRIL或其受体发生特异反应的抗体片段。可采用传统的技术使抗体片段化并且按上面所描述的与用于完整抗体相同的方式筛选片段进行应用。例如，可通过用胃蛋白酶处理抗体来产生F(ab’)2片段。可处理得到的F(ab’)2片段还原二硫键产生Fab’片段。本发明的抗体还包括具有抗APRIL或抗APRIL受体活性的生物特异性和嵌合分子。因此，APRIL和其受体的单克隆和多克隆抗体(Ab)以及抗体片段如Fab’和F(ab’)2可用来阻断APRIL和其各自的受体的作用。
也可利用常规的重组DNA技术制备多种形式的抗体(具体地在此引用作为参考，Winter和Milstein，自然349293-299(1991))。例如，可将来自动物抗体的抗原结合区与人的恒定区连接来构建嵌合抗体(如Cabilly等，美国4,816,567，在此引用作为参考)。当用于人的临床治疗时，嵌合抗体可降低由动物抗体引发的所观察到的免疫原性反应。
另外，可合成识别APRIL或其受体的重组的“人源化抗体”。人源化抗体是含有大部分人IgG序列的插入了负责特异抗原结合结构域的嵌合体。用目的抗原免疫动物、分离相应的抗体并且去除负责特异抗原结合的可变区序列。将动物来源的抗原结合结构域克隆入抗原结合结构域已被缺失的人抗体基因的合适位置。人源化抗体最大限度地减少了人抗体中异源的(即种间)序列的应用，并且，因此引发受试患者免疫应答的可能性小。
也可通过制备含有从不同类型的免疫球蛋白分离的可变区和人恒定区(CH1，CH2，CH3)的嵌合或人源化抗体来实现不同类型的重组抗体的构建。例如，可通过将抗原结合位点克隆入携带人的链恒定区的载体中重组产生具有增加的抗原结合位点效价的抗体(Arulanandam等，J.Exp.Med.1771439-1450(1993)，在此引用作为参考)。
另外，可通过改变抗原结合位点附近的氨基酸残基采用常规的重组DNA技术改变重组抗体与其抗原的结合亲和性。可通过以分子模拟为基础的诱变来增加人源化抗体的抗原结合亲和性(Queen等，美国国家科学院院报8610029-33(1989)，在此引用作为参考)。
F.类似物的产生改变的DNA和肽序列的产生APRIL类似物与天然存在的配体在氨基酸序列上有所不同，或者不涉及序列的其它方面有所不同，或者两者都不相同。非序列修饰包括APRIL在体内或体外的化学衍生作用。非序列修饰包括但不局限于乙酰化、甲基化、磷酸化、羧基化或糖基化改变。
优选的类似物包括APRIL或其生物学活性片段，它的序列通过一个或多个保守的氨基酸替换或者不消除APRIL生物学活性的一个或多个非保守氨基酸替换、缺失或插入而与SEQ.ID.NO.2所给的序列不同。保守替换典型地包括一个氨基酸被另一个有相似特征的氨基酸替换，如下面各组替换缬氨酸，甘氨酸；甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。
表1保守性氨基酸置换
用于诱变的有用的方法包括下文详细描述的PCR诱变和饱和诱变。也可通过合成一组简并寡核苷酸序列产生随机的氨基酸序列变异体文库。
-PCR诱变PCR诱变中，降低Taq聚合酶保真性可用来将随机突变导入DNA克隆的片段(Leung等，1989，技术111-15)。这是导入随机突变的很有效且相对迅速的方法。在降低用Taq DNA聚合酶合成DNA的保真性的条件下，如采用比率为5的dGTP/dATP并向PCR反应中加入Mn2+，用聚合酶链式反应(PCR)可扩增要诱变的DNA结构域。可将扩增的DNA片段集合插入合适的克隆载体以提供随机突变体文库。
-饱和诱变饱和诱变可使大量单个碱基替换快速导入克隆的DNA片段(Mayers等，1985，科学229242)。此技术包括产生突变如通过对单链DNA进行化学处理或照射射线，并合成互补DNA链。可通过调节处理的程度来调节突变频率而且可获得基本上所有可能的碱基替换。由于此方法不涉及对突变体片段的遗传选择，可获得中性替换以及通过DNA随机诱变制备的改变蛋白功能的替换。点突变的分布不偏向保守序列元件。
-简并寡核苷酸也可从一组简并寡核苷酸序列产生同系物文库。在DNA自动合成仪中进行简并序列的化学合成并且随后将合成的基因与合适的表达载体连接。本领域已知简并寡核苷酸的合成xxx。这些技术已用于其它蛋白的定向进化xxxi。
非随机或定向诱变技术可用来提供特异结构域中的特异序列或者突变。采用这些技术产生的变异体包括如蛋白的已知氨基酸序列残基的缺失、插入或替换。可对突变位点进行个别或一系列的修饰，如通过(1)首先用保守氨基酸替换然后根据取得的结果用更基本的选择替换，2)缺失靶残基，或者3)邻近所处位点插入相同或不同类型的残基，或者联合1-3项。
-丙氨酸扫描诱变丙氨酸扫描诱变是用来鉴定目的蛋白的某些残基或结构域是诱变的优选位置或区域的有用的方法，Cunningham和Wells(科学2441081-1085，1989)，具体地在此引用作为参考。丙氨酸扫描中，用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)识别并替换残基或目标残基的基团(如带电荷的残基如Arg、Asp、His、Lys和Glu)。氨基酸替换可影响氨基酸与细胞内或细胞外的周围的水环境的相互作用。然后通过在或者为替换位点导入更多的或其它变异体来精选那些表现出对替换功能性敏感的结构域。因此，尽管导入氨基酸序列变异的位点是预定的，但是突变性质本身不需预定。例如，为优化在所给位点突变的表现，可在目标密码子或结构域进行丙氨酸扫描或随机诱变并且筛选表达的目的蛋白亚基变异体以得到所需活性的最理想的组合。
-寡核苷酸介导的诱变寡核苷酸介导的诱变是制备DNA替换、缺失和插入变异体的有用的方法，见如Adelman等，(DNA 2183，1983)在此引用作为参考。简而言之，可通过将编码突变的寡核苷酸与含有目的蛋白的未改变或天然DNA序列的质粒或噬菌体的单链形式的DNA模板杂交改变目标DNA。杂交之后，用DNA聚合酶合成与寡核苷酸引物结合的模板的完整的第二条互补链，并在目的蛋白的DNA中编码所选择的改变。一般地，应用了长度至少为25个核苷酸的寡核苷酸。最理想的寡核苷酸含有12-15个在编码突变的核苷酸两侧与模板完全互补的核苷酸。这保证了寡核苷酸将与单链DNA模板分子适当地杂交。采用本领域所知的技术如此处引用作为参考的、Crea等描述的(美国国家科学院院报755765)可方便地合成寡核苷酸。
-盒式诱变制备变异体的另外一种方法，盒式诱变，是根据此处引用作为参考的Wells等(基因，34315)描述的技术。起始物质可以是包含要突变的蛋白亚基DNA的质粒(或其它载体)。鉴定要突变的蛋白亚基DNA中的密码子。在鉴定的突变位点两侧必须有特殊的限制性内切酶位点。如果不存在这种限制性位点，采用上面描述的寡核苷酸介导的诱变方法在目的蛋白亚基DNA的合适位置将其导入来产生限制性位点。在限制性位点已导入质粒之后，在这些位点切割质粒并使之线性化。采用常规方法合成编码位于限制性位点之间的DNA序列同时含有所需突变的双链寡核苷酸。分别合成两条链然后用常规技术使它们杂交。此双链寡核苷酸被称为盒。设计盒具有与线性化质粒的末端类似的3’端和5’端，以便盒能与质粒直接连接。现在该质粒含有突变的目的蛋白亚基DNA序列。
-组合诱变也可用组合诱变产生突变体。如，优选地为促使最高同源性可能，对比了一组同系物或其它相关蛋白的氨基酸序列。可选择所有在对比序列的指定位置出现的氨基酸产生一组简并组合序列。变异体的多样化文库是在核酸水平通过组合诱变产生的，而且由多样化基因文库编码。例如，可将合成的寡核苷酸混合物酶促连接到基因序列中以便这组潜在的简并序列表达为各个肽或者选择性地、含有这组简并序列的一组更大的融合蛋白。
本领域已知用于筛选产生的突变基因产物的多种技术。用于筛选大的基因文库的技术通常包括将基因文库克隆入可复制的表达载体，用得到的载体文库转化合适的细胞，在目的活性如，此实例中是与APRIL或其受体结合检测促使编码其产物被检测的基因的载体相对容易分离。下文描述的每一种技术都可接受用于筛选产生的大量序列的高生产率分析，如随机诱变技术。
本发明还提供申请专利保护的多肽或它们的受体的蛋白结合结构域的还原作用，来产生模拟的如肽或非肽试剂。这些肽模拟物能破坏APRIL与其各自的受体结合。可鉴定参与受体多肽或下游胞内蛋白的分子识别的APRIL关键残基并用来产生竞争性或非竞争性抑制APRIL与受体结合的APRIL或其受体来源的肽模拟物。(见，例如“人乳头瘤病毒蛋白与成视网膜细胞瘤基因蛋白结合的肽抑制剂”欧洲专利申请EP-412,762A和EP-B31,080A)，具体地在此引用作为参考。
通过制备可获得的纯化和重组APRIL，本发明提供用来筛选是正常细胞功能，此实例中是APRIL或其受体的激动剂或是拮抗剂的候选药物的分析法。在一个实施方案中，该分析评价了化合物调节APRIL与受体之间的结合的能力。多种分析形式可满足需要并且，根据本发明，可被本领域技术人员理解。
在许多检验化合物和天然提取物文库的药物筛选程序中，为在给定的时间期限内鉴定的化合物最多需用高生产率分析法。在无细胞系统如用纯化或半纯化蛋白衍生的，进行的分析常被称为“初级”筛选，这是因为它们的产生使得分子目标中由试验化合物介导的变化迅速发展和相对容易的检测成为可能。而且，在体外系统中，一般可忽略试验化合物的细胞毒性和/或生物可获得性，而将分析法主要集中在作为在与其它蛋白的结合亲和性的改变中显著的药物对分子目标的作用或者分子目标的酶促性质的变化上。分离与APRIL结合的受体TNF家族的配体可用于鉴定和克隆受体。用所描述的APRIL序列，可将组成受体结合序列的细胞外结构域的5’端与标记序列融合然后加上能使APRIL在许多表达系统的任一种中都可分泌的前导序列。Browning等(1996)(JBC271，8618-8626)描述了这种技术的一个例子，其中的LT-β配体是以这种形式分泌的。VCAM前导序列与带有LT-β细胞外结构域的短myc肽标记结合。VCAM序列被用来迫使正常地与膜结合的LT-β分子分泌。分泌的蛋白在N-末端保留了myc标记这不影响它与受体结合的能力。这样的分泌蛋白可在瞬时转染的Cos细胞或者相似的系统如EBNA来源的载体、昆虫细胞/杆状病毒、picchia等中表达。未纯化的细胞上清液可用作已标记配体的来源。
可将表达受体的细胞暴露于已标记配体中来进行鉴定。在用抗-myc肽抗体(9E10)标记myc标记随后用藻红蛋白标记(或类似的标记)抗-小鼠免疫球蛋白的FACS实验中鉴定具有结合的配体的细胞。可方便地鉴定出FACS阳性细胞并将其作为编码受体的RNA来源。然后通过常规技术从此RNA制备表达文库并分成集合。将克隆集合转染入合适的宿主细胞并且在给酶标抗小鼠Ig试剂如半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或萤光素酶标记的抗体标记上结合的myc肽标签之后通过显微镜检查鉴定已标记的配体与受体阳性转染细胞的结合。一旦有阳性集合鉴定出，降低集合的大小直到鉴定出编码cDNA的受体。可用小鼠或人APRIL实施此方法，因为可能更方便地产生受体。
G.治疗方法和药物组合物。
本发明用于治疗癌症的方法包括给予患病者优选哺乳动物宿主如狗、猫或人含有能干扰APRIL与其受体相结合的阻滞剂的有效量的申请专利保护的组合物。这些阻滞剂包括但不限于可溶的APRIL、抗APRIL抗体、抗APRIL受体抗体或其生物活性片段。另外，可通过使APRIL突变同时维持其阻滞APRIL与其受体结合的能力来制备APRIL的抑制形式。阻滞剂可优选含有可按照本领域已知的方法构建的受体IG融合蛋白。
本发明的方法可用于治疗所有癌症，包括但不限于细胞疾病如，例如肾细胞癌、卡波西肉瘤、慢性白血病、乳癌、肉瘤、孵巢癌、直肠癌、咽喉癌、黑色素瘤、结肠癌、膀胱癌、胞大细胞瘤、肺癌、乳房腺癌、咽鳞状细胞癌和胃肠或胃癌。另外，这些阻滞剂可用于治疗那些不被认为是肿瘤的增殖性疾病即细胞过度增殖(增殖)如，例如硬皮病、类风湿关节炎的血管翳形成、外科手术后瘢痕和肺、肝脏和子宫纤维化。
本发明的药物组合物可包含治疗有效量的APRIL或其受体、或其片段、或其模拟物并且可选择性地包含药学上可接受的载体。因此，通过施用本发明药学上有效量的化合物或其药学上可接受的盐或衍生物，本发明提供治疗癌症的方法以及刺激、或某些情况下抑制免疫系统或其部分的方法。当然应理解的是本发明的组合物和方法可与其它多种疗法联合应用。
可将组合物制成制剂，用于多种给药途径，包括全身、体表或局部给药。对于全身给药，注射给药是优选的，包括肌肉内、静脉内、腹膜内和皮下注射，本发明的组合物可制成液体溶液，优选地配制在生理相容性缓冲液如Hank’s液或Ringer’s液。另外，组合物也可制成固体形式并且，选择性地在使用之前立即再溶解或悬浮。本发明中也包括冻干形式。
组合物可口服或经粘膜或皮肤方式给药。用经粘膜或经皮肤给药时，制剂中应用了适合于要透过的屏障的渗透剂。本领域所知的这些渗透剂包括，例如用于经粘膜给药的有胆盐、梭链孢酸衍生物和去污剂。经粘膜给药可通过鼻腔喷雾剂或应用栓剂。用于口服给药，可将组合物制成传统的口服给药形式如胶囊、片剂和补药。用于体表给药，如本领域已知的，可将本发明的组合物制成软膏、油膏、凝胶或乳剂。
给药剂量和服药规则由癌症类型、患者和患者的病史而定。剂量必须对癌症的治疗、抑制或改变癌症进程有效。给药可以单次给药或多次给药。如果采用多次给药，按优选的，给药的频率取决于，例如宿主和癌症的类型、所给剂量等。对于某些类型的癌症或癌症谱系，每日给药是有效的，而对于其它的，每隔一天或每隔两天给药是有效的。一次或整个治疗过程所给的活性化合物的量取决于许多因素。例如，受治对象的年龄和大小、所治疾病的严重度和病程、给药方式和剂型以及治疗医生的判断。然而，有效剂量可以为约0.005-约5mg/kg/天，优选约0.05-约0.5mg/kg/天。最有效的剂量是引起无肿瘤外观或者肿瘤完全退化并且对患者无毒的。本领域技术人员将认识到同样有用的更低和更高的剂量。
根据本发明的基因构建体也可用作基因治疗方案的一部分来运送编码APRIL的对抗或拮抗形式的核酸。
APRIL的表达构建体可在任何生物学上有效的载体如能够在体内有效地运送APRIL基因给细胞的任何制剂或组合物中给药。方法包括将基因插入能直接转染细胞的病毒载体、或者借助于如脂质体或胞内载体运送质粒DNA、以及直接注射基因构建体。优选病毒载体转化方法。
基因治疗构建体的药物制剂可主要含有可接受的稀释剂中的基因运送系统或者可含有基因运送载体包埋在其中的缓释基质。选择性地，在完整的基因运送系统可从重组的细胞完整地产生的地方如逆转录病毒载体，药物制剂可含有产生基因运送系统的一个或多个细胞。
除了用于治疗，本发明的寡聚体可用作诊断试剂来检测与它们特异性结合的目标DNA、RNA或氨基酸序列的存在与否。在其它方面，申请专利的本发明可用来评价化学个体与APRIL或其片段相互作用如结合或物理联合的能力。方法包括使化学个体与APRIL相互接触并且评价化学个体与APRIL相互作用的能力。另外，APRIL可用在评价天然产生的APRIL或APRIL受体以及评价与APRIL受体联合或结合的化学个体的方法中。理想的是，利用标记的APRIL版本来方便与其受体结合的APRIL或受体阳性细胞的检测，如，例如筛选能阻断APRIL配体-APRIL受体相互作用的试剂的目的。另外，可利用具有增高的生长速度的APRIL转染的细胞系作用根据用来筛选阻断APRIL活性的分子的验定法。
在某些方面，申请专利的发明特点是用于评价化学个体调节APRIL和其相应的受体之间的相互作用的能力的方法。此方法包括，在两者能在其中相互作用的条件下结合APRIL受体和APRIL，加入要评价的化学个体并检测复合物的形成或溶解。可进一步在体外评价这些调节试剂如在无细胞系统中检验其活性并且然后选择性地给细胞或动物应用此化合物并评价其作用。
I.实施例实施例1APRIL的Northern印迹分析显示APRIL表达微弱并且仅在少数组织表达(图2A)。前列腺中发现2.1Kb和2.4Kb的两种转录物，而PBLs显示出1.8Kb的更短的转录物。采用Human Multiple Tissue NorthernBlots I和II(Clontech#7760-1和#7759-1)、Human Cancer CellLine MTN Blot(Clontech #7757-1)和Human Tumor Panel BlotV(Invitrogen D3500-01)进行Northern印迹分析。于62℃在ExpressHyb杂交液(Clontech #8015-1)中温育膜至少1小时。利用APRIL的细胞外结构域的相应cDNA为模板合成随机引物cDNA探针(Boehringer Mannheim)。以1.5×106cpm/ml浓度将热变性的cDNA探针加入新鲜的ExpressHyb中。膜在62℃杂交12-24小时，在含有0.05％SDS的2xSSC中洗三次并且于-70℃曝光。APRIL的Northern印迹分析显示APRIL表达微弱并且仅限于少数组织。在前列腺中发现了2.1Kb和2.4Kb的两种转录物，而PBLs显示出更短的1.8Kb的转录物。
更长的曝光时间显示出2.1kb的APRIL mRNA在结肠、脾脏和胰腺中(未显示资料)。APRIL mRNA的有限分布与目前可获得的EST数据库中的cDNA克隆的来源一致。鉴定的23个克隆中只有两个来源于正常组织(怀孕子宫、胰岛)。值得注意的是，存在于cDNA文库中的ETS-克隆的剩余者(21个克隆，91％)产生于肿瘤或肿瘤来源的细胞系(卵巢肿瘤，11个；前列腺肿瘤3个；Gessler Wilms肿瘤，1个；结肠癌，1个；子宫内膜肿瘤，1个；甲状旁腺肿瘤，1个；胰腺肿瘤，1个；T细胞淋巴瘤，1个；LNCAP腺瘤来源细胞系，1个)。这促使我们检验表达APRILmRNA的转化细胞系(图2B)而且所有细胞系的确强烈表达APRIL的2.1kb转录物。
在结肠直肠腺癌SW480、伯基特淋巴瘤Raji和黑色素瘤G361中检测到最高的APRIL特异信号。为证明此发现，测定了几种肿瘤中APRIL mRNA的表达水平并将其与正常组织相比较。在甲状腺癌和淋巴瘤中检测到大量的APRIL mRNA，而在相应的正常组织中，仅发现微弱的或者无杂交信号(图2C)。在Northern印迹杂交分析的两种其它肿瘤(肾上腺和腮腺肿瘤)中，APRIL mRNA水平未升高。然而，原位杂交展示了与正常结肠组织相比，人结肠腺癌中有大量APRIL信息(图2D)。
为探讨APRIL的可能活性，在293细胞中表达了包含氨基酸110-250的APRIL的可溶细胞外结构域(sAPRIL)的重组形式(9)。应用一侧有EcoRI位点的特异5’正向引物(5’-CCAGCCTCATCTCCTTTCTTGC-3’)和一侧有XbaI位点的特异3’反向引物(5’-TCACAGTTTCACAAACCCCAGG-3’)从EST-克隆扩增全长APRIL基因。用EcoRI/XbaI剪切扩增的片段并将其克隆入pCRIII的修饰版本(Invitrogen)，框内带有N-端Flag肽(15)。用分别含有PstI和XbaI位点的两个引物(5’-AAACAGAAGAAGCAGCACTCTG-3’)和(5’-TCACAGTTTCACAAACCCCAGG-3’)产生APRIL的可溶形式(sAPRIL)并且随后将其克隆入含有用于在真核细胞中进行蛋白分泌的HA信号和N-末端Flag表位的修饰的pCRIII载体(15)。实施例2肿瘤细胞和组织中APRIL的广泛表达提示APRIL可能与肿瘤生长相关，因此将不同的肿瘤细胞系与纯化的重组Flag标记的sAPRIL进行温育(10)。人胚胎293T细胞、人白血病Jurkat T-细胞、人伯基特淋巴瘤B-细胞Raji和黑色素瘤细胞系的生长如前所述(16，17)。本文中提到的其它细胞系保藏于美国典型培养物保藏中心(Rockville，Maryland)并由其描述。所有细胞系在补充有10％胎牛血清的RPMI或DMEM培养基中培养。
最近描述了人FasL细胞外结构域(残基103-281)和TRAIL的细胞外结构域(残基95-281)的Flag-标记的版本(15)。Flag-标记的可溶的人TWEAK(残基141-284)在293细胞中产生(P.S.准备中未印刷的原稿)。从Kodak International Biotechnologies获得抗-Flag抗体M2。当根据加入配体24小时后活细胞数目的增加(近似50％)检测时，观察到在APRIL存在时Jurkat T淋巴瘤细胞增殖的增加呈剂量依赖效应(图3A)。细胞增殖的测定是通过以每孔50,000个细胞在100μl的培养基中与指定浓度的重组APRIL、TWEAK、TRAIL、FasL温育细胞并且在24hr后按照制造商的说明应用Celltiter96AQ增殖测定法(Promega)测定活细胞数目或者用3H-胸腺嘧啶核苷掺入进行测定。应用与琼脂糖偶联的抗-Flag用于免疫耗竭Flag-APRIL。
细胞增殖的增长不依赖于共同刺激信号如抗-CD3抗体或其它细胞因子。如所预期的，向Jurkat细胞中加同样产生的和纯化的FasL减少了活细胞的数目，而TWEAK没有此效应。细胞数目增加与APRIL处理的细胞中3H-胸腺嘧啶核苷掺入的增高(40％)有关(图3A)。用抗-FLAG抗体，而不是抗-myc抗体进行的FLAG-标记的含有APRIL的条件培养基产生的免疫耗竭降低了增殖效应(图3B)，这表明这种增殖效应是特异的并且是由于APRIL。增殖速度的增高也可见于某些B淋巴瘤(人Raji、小鼠A20细胞，但不是人BJAB)和上皮来源的细胞系如COS和HeLa以及黑色素瘤(图3C)。乳腺癌细胞MCF-7没有反应。当胎牛血清由10％降到1％时，对Jurkat细胞的作用更明显(图3D)。
重组sAPRIL的集合物形式可能解释在相当高的浓度才可检测到sAPRIL的增殖效应。因此，用全长人APRIL转染NIH-3T3细胞(12)并获得几个APRIL-表达克隆(图4A)。用磷酸钙转染方法和包含全长FLAG-标记的APRIL的pCRIII表达载体建立了NIH-3T3 APRIL克隆。在还原条件下，有SDS存在时，在12％聚丙烯酰胺凝胶上对每泳道约2×106个细胞的细胞蛋白进行电泳分离并随后将其转移到硝酸纤维素膜上。用5μg/ml的大鼠单克隆抗-Flag抗体M2(KodakInternational Biotechnologies)进行Flag-标记的APRIL的免疫印迹分析。用亲合纯化的抗-过氧化物酶结合的驴抗-小鼠抗体(Dianova，Hamburg，Germany)、随后用ECL系统(Amersham)进行化学发光反应来检测第一抗体。
令人感兴趣的是，APRIL转染子比模拟转染子增殖得快(图4B)。推论APRIL-转染的NIH-3T3细胞也可能具有体内生长优势。当将野生型或模拟转染的NIH-3T3细胞注射给裸鼠时，5-6周后观察到小的可触摸肿瘤(13)。相反，用APRIL稳定转染的两个NIH-3T3细胞克隆都在仅仅3-4周时诱发肿瘤。六周后，由于高度的肿瘤负担不得不处死小鼠(图4C)。将NIH/3T3成纤维细胞(美国典型培养物保藏中心，rockville，Maryland)和不同的转染子(1×105个)细胞悬浮于50μlPBS中并将其皮下注射到BALB/c裸鼠(Harlan，Zeist，Netherland)体侧。每三天测量一次肿瘤大小。小鼠是同龄的(每组3只动物)。实施例3分离与APRIL结合的受体TNF家族的配体可用来鉴定和克隆受体。用所需的APRIL序列，可使组成受体结合序列的APRIL的胞外结构域与标记序列融合，并且加上前导序列使得在任意表达系统中都可分泌APRIL。此技术的一个例子由Browning等描述，(1996)(JBC271，8618-8626)，其中LT-β配体以这种方式分泌。VCAM前导序列与后面带有LT-β的细胞外结构域的短的myc肽标记结合。VCAM序列用于使正常膜结合LT-β分子分泌。分泌的蛋白保留不影响其与受体结合的能力的位于N-末端的myc标记。这样的分泌蛋白可在瞬时转染的Cos细胞或相似系统如EBNA来源的载体、昆虫细胞/杆状病毒、picchia等中表达。未纯化的细胞上清液可用作标记配体的来源。
表达受体的细胞可通过将其暴露于标记配体而得到鉴定。在FACS实验中，用抗-myc肽抗体(9E10)来标记myc标记然后用藻红蛋白(或相似标记)标记的抗小鼠免疫球蛋白鉴定带有结合配体的细胞。FACS阳性细胞可方便地得以鉴定并可作为编码受体的RNA来源。然后通过常规技术从此RNA制备表达文库并分成集合。将克隆的集合转染进入合适的宿主细胞并通过显微镜检查来确定标记配体与受体阳性转染细胞的结合，然后用酶标抗小鼠Ig试剂即半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或荧光素酶标记抗体标记结合的myc肽标记。一旦鉴定出阳性集合，应减少集合大小直到鉴定出编码cDNA的受体。可用小鼠或人APRIL实行此方法，可更方便地得到受体。
对本领域技术人员明显的是在不离开本发明的精神和范围的情况下，本发明的APRIL、组合物和方法可进行多种修饰和改变。因此，如果这些修饰和改变是在所附的权利要求书及它们的等价物范围之内，则本发明将包括它们。
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权利要求
1.编码APRIL或其片段的DNA序列。
2.编码APRIL的DNA序列，该序列主要含有SEQ.ID.NO.2所述序列。
3.主要含有SEQ.ID.NO.1的DNA序列，所述DNA编码多肽，所述多肽主要含有SEQ.ID.NO.2。
4.与至少SEQ.ID.NO.1的片段杂交的DNA序列，所述片段至少包含20个连续碱基，所述DNA序列编码的多肽至少与APRIL的活性位点有30％同源性。
5.根据权利要求2所述的DNA序列，其中所述序列主要包含带有保守替换、改变或缺失的SEQ.ID.NO.1。
6.含有编码APRIL的DNA序列的重组DNA分子，所述序列与表达控制序列可操作连接。
7.权利要求6的分子包含SEQ.ID.NO.1。
8.权利要求6或7的用重组DNA分子转化的单细胞宿主。
9.编码具有SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列的APRIL的DNA序列。
10.用于产生基本上纯的APRIL的方法，包括培养权利要求8的单细胞宿主的步骤。
11.基本上不含正常结合的动物蛋白的APRIL。
12.权利要求11的APRIL主要含有SEQ.ID.NO.2。
13.一种药物组合物，含有治疗有效量的APRIL或其活性片段和药学上可接受的载体。
14.一种用于预防或减轻自身免疫疾病严重性的方法，包括给予治疗有效量的权利要求13所述的药物组合物的步骤。
15.权利要求13的药物组合物，其中所述的APRIL或其活性片段含有SEQ.ID.NO.2或其生物学活性片段。
16.一种用于预防或减轻对移植组织的免疫应答严重性的方法，包括给予治疗有效量的权利要求13所述的药物组合物的步骤。
17.用于刺激免疫系统的方法，包括施用权利要求13所述的组合物。
18.用于抑制免疫系统的方法，包括给予治疗有效量的权利要求13所述的药物组合物的步骤。
19.用于治疗癌症的方法，包括给予治疗有效量的权利要求13所述的药物组合物的步骤。
20.用于鉴定APRIL的受体的方法，包括a.提供APRIL或其片段，b.用可检测的标记标记所述的APRIL或其片段；c.筛选组合物以检测与步骤b可检测标记结合的受体。
21.权利要求11的APRIL可溶的生物学活性片段。
22.含有由选自下列的DNA编码的氨基酸序列的多肽a.含有SEQ.ID.NO.1的DNA序列；b.与a.中定义的DNA和编码表达的与权利要求12的APRIL至少40％同源的多肽的DNA杂交的DNA序列。
23.与APRIL或其受体或其生物学活性片段反应的抗体制剂。
24.权利要求23的抗体制剂，包含单克隆抗体。
25.用于产生与APRIL或其受体反应的抗体制剂的方法，包括用APRIL或其受体或其抗原片段免疫有机体的步骤。
26.抗APRIL的反义核酸，包括与至少SEQ.ID.NO.1的一部分杂交的核酸序列。
27.包含权利要求24所述的抗体制剂的药物组合物。
28.在哺乳动物细胞中表达APRIL的方法，包括a.将编码APRIL的基因导入细胞；b.使所述的细胞在一定条件下存活以使所述基因在所述的哺乳动物中表达。
29.治疗哺乳动物中APRIL相关疾病的方法a.将治疗有效量的含有编码APRIL的基因的载体导入细胞；并且b.在所述的哺乳动物细胞中表达所述基因。
30.权利要求29的方法，其中哺乳动物是人。
31.权利要求29的方法，其中所述载体是病毒。
32.一种诱导细胞死亡的方法，包括施用能够干扰APRIL与受体结合的试剂。
33.权利要求32的方法进一步包括施用γ干扰素。
34.一种涉及APRIL和其受体之间的信号通路的治疗、抑制、激活或改变免疫应答的方法，该方法包括给予有效量的能干扰APRIL和其受体结合的阻断剂的步骤。
35.权利要求34的方法，其中所述的免疫应答涉及人癌细胞。
36.治疗、抑制或改变癌症进程的方法，包括给病人施用有效量的能够干扰APRIL和受体结合的阻断剂。
37.权利要求36的方法，其中阻断剂是APRIL或抗-APRIL抗体或其生物学活性片段的修饰的抑制形式。
38.权利要求37的方法，其中阻断剂是抗-APRIL受体的抗体。
39.权利要求36的方法，其中阻断剂与至少一种化疗剂联合施用于病人。
40.权利要求39的方法进一步包括给予所述病人放射治疗的步骤。
全文摘要
APRIL,肿瘤坏死因子(TNF)家族的新成员,修饰的APRILs以及包含它们的药物组合物。
文档编号A61K48/00GK1270632SQ98809038
公开日2000年10月18日 申请日期1998年9月11日 优先权日1997年9月12日
发明者J·茨乔普 申请人:阿普泰克R&D公司