专利名称：从人分离的编码C6β－趋化因子Lkn－1的cDNA的制作方法
背景技术：
趋化因子具有生物活性如HIV-1的抑制作用，免疫调节作用，白细胞迁移，和抗造血干细胞分裂的抑制作用(参见，Cocchi，F.等人，科学，2701811(1995)；Wolpe，S.D.等人，实验医学杂志，167570(1988)；Graham，G.J.等人，自然，344442(1990)；Broxmeyer，H.E.等人，血液，761110(1990)；Youn，B.-S.等人，免疫学杂志，1552661-2667(1995))。
趋化因子还与偶联跨膜区G蛋白质的受体结合以活化白细胞，并且一些受体也可以在HIV-1感染过程中用作协同受体(参见Oh，K.-O.等人，免疫学杂志，1472978(1991)；Alkabatih，G.等人，科学，2721955(1996))。例如，在β-趋化因子(CC趋化因子)受体的8个亚型，即CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8中有4个亚型CCR4、CCR6、CCR7、CCR8显示对一种物质有高亲和力，而CCR1、CCR2、CCR3、和CCR5具有结合各种趋化因子的亲和力。
迄今，本领域已知属于β-趋化因子亚家族的9个趋化因子(参见，Wilson，S.D.等人，实验医学杂志，1711301(1990)；Modi，W.S.等人，人类遗传学，84185(1990))。在它们中间，小鼠MRP-1(“mMRP-1”，MIP(巨噬细胞炎症蛋白质)-相关蛋白质-1或C10)(参见，Orlofsky，A.等人，细胞调节，2403(1991))和小鼠MRP-2(“mMRP-2”)(参见Youn，B.-S.等人，免疫学杂志，1552661(1995))与其它β-趋化因子的区别在于它们具有两个额外的半胱氨酸残基，从而形成第三个二硫键，并且它们的N末端区非常长。根据以前的发现，将它们划分为C6β-趋化因子。
在上述情况下，有重要的原因需开发和研制人的新MRP，因为人的MRP可以用作治疗HIV-1感染或在化学治疗或放射性治疗过程中保护骨髓干细胞的潜在药物。
所以，本发明的第一个目的是提供编码C6β-趋化因子(Lkn-1)的新cDNA和由此推断的氨基酸序列。
本发明的第二个目的是提供含有所述的Lkn-1 cDNA的表达载体和利用该载体转化的重组微生物。
本发明的第三个目的是提供从所述的微生物制备重组Lkn-1的方法。
本发明的第四个目的是提供利用重组的Lkn-1保护骨髓细胞不受细胞毒性抗癌药物或不受辐射毒害的方法。
图1(B)显示了Lkn-1的氨基酸序列(SEQ ID NO2)和mMRP-2的第87到第110位氨基酸序列(SEQ ID NO3)的比较。
图2是显示从各种人细胞系分离的总RNA的RT-PCR(逆转录酶-聚合酶链式反应)的结果的图。
图3显示了Lkn-1cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO4)和由此推断出的氨基酸序列(SEQ ID NO5)。
图4显示了成熟的Lkn-1的氨基酸序列(SEQ ID NO7)与mMRP-1(SEQ ID NO8)，mMRP-2(SEQ ID NO9)，hMIP-1α(SEQ ID NO10)，mMIP-1α(SEQ ID NO11)和hMIPβ(SEQ ID NO12)的那些序列的比较。
图5(A)是显示Lkn-1对骨髓中的骨髓细胞的集落形成的影响的图。
图5(B)是显示Lkn-1对脾中髓样细胞的集落形成的影响的图。
图5(C)是显示Lkn-1对骨髓中骨髓细胞的增殖速度的影响的图。
图5(D)是显示Lkn-1对在脾中的髓样细胞的增殖速度的影响的图。
图6(A)是显示Lkn-1对骨髓中骨髓细胞的增殖速度的依赖剂量的抑制效果的图。
图6(B)是显示Lkn-1对脾中髓样细胞的增殖速度的依赖剂量的抑制效果的图。
图7(A)是显示Lkn-1对骨髓中CFU-GM的增殖速度的依赖时间的抑制效果的图。
图7(B)是显示Lkn-1对骨髓中BFU-E的增殖速度的依赖时间的抑制效果的图。
图7(C)是显示Lkn-1对骨髓中CFU-GEMM的增殖速度的依赖时间的抑制效果的图。
图7(D)是显示Lkn-1对脾中CFU-GM的增殖速度的依赖时间的抑制效果的图。
图7(E)是显示Lkn-1对脾中BFU-E的增殖速度的依赖时间的抑制效果的图。
图7(F)是显示Lkn-1对脾中CFU-GEMM的增殖速度的依赖时间的抑制效果的图。
图8(A)是显示重组的Lkn-1和RANTES(受活化调节，正常T细胞表达和分泌)吸引淋巴细胞的趋化性的图。
图8(B)是显示重组的Lkn-1和hMIP-1α吸引单核细胞的趋化性的图。
图8(C)是显示重组的Lkn-1和IL-8吸引嗜中性粒细胞的趋化性的图。
图9(A)显示受加入一系列RANTES和重组Lkn-1刺激的淋巴细胞中测量的相对荧光。
图9(B)显示受加入一系列重组Lkn-1和RANTES刺激的淋巴细胞中测量的相对荧光。
图9(C)是显示受加入一系列hMIP-1α和重组Lkn-1刺激的单核细胞中测量的相对荧光。
图9(D)显示受加入一系列重组Lkn-1和hMIP-1α刺激的单核细胞中测量的相对荧光。
图9(E)显示受加入一系列IL-8和重组Lkn-1刺激的嗜中性粒细胞中测量的相对荧光的图。
图9(F)是显示受加入一系列重组Lkn-1和IL-8刺激的嗜中性粒细胞中测量的相对荧光。
图10(A)显示受加入一系列各种试剂刺激的表达CCR1的HOS细胞系中测量的相对荧光。
图10(B)显示受加入一系列各种试剂刺激的表达CCR3的HOS细胞系中测量的相对荧光。
图10(C)是显示依赖于Lkn-1和hMIP-1α浓度的钙应答的峰幅的图。
图10(D)是显示依赖于Lkn-1、eotaxin和RANTES的浓度的钙应答的峰幅的图。
本发明的详细描述为了从人细胞系分离Lkn-1基因，本发明人首先克隆了可以用于制备探针的Lkn-1基因的外显子。即，利用HindIII消化人基因组DNA，在琼脂糖凝胶上分离，以32P-标记的mMRP-2 cDNA(参见Youn，B.S.等人，免疫学杂志，1552661(1995))作为探针，利用Southern印迹分析获得可以与mMRP-2杂交的7.0kb的DNA片段。然后，为了从7.0kb的HindIII消化的DNA片段分离出Lkn-1 cDNA的外显子序列，利用HindIII完全消化人基因组DNA，并且在琼脂糖凝胶上分离，以获得7.0kb的DNA片段。将这样获得的片段插入载体，并将这样获得的载体导入宿主。在转化后，选择显示与所述的mMRP-2 cDNA探针杂交的集落。在从该集落分离出7.0kb的DNA片段和利用A1uI消化后，克隆出了可以与mMRP-2 cDNA杂交的202bp的DNA片段。然后，确定该片段的核苷酸序列，该序列区分出来自所述DNA片段的部分内含子和外显子。
然后，为了从人细胞系克隆出新的Lkn-1 cDNA，制备了如上证实的允许从Lkn-1外显子序列扩增100bp DNA片段的Lkn-1 PCR引物，并且分别利用从各种人细胞系分离的总RNA作为模板进行RT-PCR，从而筛选出具有Lkn-1 mRNA的细胞系。选用如此选出的一个细胞系，白细胞介素-4(IL-4)活化的人单核细胞THP-1细胞系，并制备它的cDNA文库。在另一方面，用所述THP-1细胞系的总RNA作为模板并用所述的Lkn-1PCR引物进行RT-PCR，制备Lkn-1外显子的100bp-DNA片段。将如上构建的THP-1细胞系的cDNA文库与Lkn-1外显子的100bp-DNA片段的探针杂交。结果，获得了显示阳性反应的Lkn-1cDNA。
所述的Lkn-1 cDNA的核苷酸序列的确定和推断的氨基酸序列表明Lkn-1 cDNA是一个新的DNA，Lkn-1 cDNA的开放读码框架编码含有21个氨基酸的信号肽的113个氨基酸，并且推断出含有92个氨基酸的成熟Lkn-1蛋白质的分子量是10162道尔顿。发现Lkn-1没有潜在的N-糖基化位点，并且属于具有除了β-趋化因子家族通常出现的四个半胱氨酸残基外还具有如在mMRP-1和mMRP-2中的两个半胱氨酸的C6β-趋化因子家族。
在表达载体中插入如上克隆的新的Lkn-1 cDNA，并且将其导入宿主细胞如大肠杆菌或昆虫细胞以表达重组的Lkn-1。
另一方面，研究了重组Lkn-1对骨髓干细胞和起源于人骨髓和脾的祖细胞的骨髓抑制活性，证明重组Lkn-1在体内和体外都以依赖浓度和时间的方式抑制集落的形成和髓样细胞的增殖。另外，观察到重组的Lkn-1强烈地吸引人外周血中嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞而引起趋化性，和在所述的细胞中诱导钙流。特别是发现重组的Lkn-1与RANTES和hMIP-1α的受体结合，并且不与IL-8的受体结合(虽然它强烈吸引嗜中性粒细胞而引起趋化性，象IL-8一样)。此外，发现重组的Lkn-1的受体是CC趋化因子受体1(CCR1)和CCR3。重组的Lkn-1是比hMIP-1α或RANTES更强的CCR1拮抗剂(已知hMIP-1α和RANTES能与CCR1结合)，并且它是比RANTES更强的CCR3拮抗剂，虽然它是比eotaxin弱的受体拮抗剂。
显示上面提到的特征的本发明的重组Lkn-1可以用于抗体生产，HIV-1感染的治疗，在化学治疗或放射性治疗过程中骨髓干细胞的保护，和白血病的抑制等等。
在下面的实施例中进一步说明了本发明，但不能将这些实施例看成对本发明范围的限制。实施例1Lkn-1基因组DNA的外显子的克隆为了克隆与来自人的mMRP-2同源的基因组DNA，利用BamHI、EcoRI、HindIII、PstI、XbaI和XhoI消化总人基因组DNA，在1.0％琼脂糖凝胶上分级分离，并以32p-标记的mMRP-2 cDNA作为探针，利用Southern印迹分析来获得7.0kb的显示阳性信号的HindIII片段。
为了制备所述HindIII片段的亚文库，利用HindIII完全消化100Fg的人基因组DNA，在20V，在1％的琼脂糖凝胶上分级分离16小时。然后，利用Gene-clean试剂盒(Bio101，美国)分离出接近7.0kb的DNA片段并且将其插入经HindIII消化的去磷酸化pBluescript SK+载体(Stratagene，美国)。利用这样制备的重组载体，辅助以电穿孔来转化Electro-max(Gibco-BRL，美国)感受态细胞，并且在固体培养基上培养。利用mMRP-2探针与形成的约2×105个集落杂交。作为结果，发现只有一个集落显示杂交的阳性信号，并且含有插入的7.0kb的DNA。
为了分离来自所述的7.0kb的DNA片段的外显子序列，从所述显示了杂交的阳性信号的集落分离出含有插入了7.0kb的DNA的pBluescript SK+载体，利用AluI消化，在1.5％琼脂糖凝胶上分级分离，通过Southern印迹分析来克隆出与mMRP-2 cDNA杂交的202bp的DNA片段。
确定所述的202bp的DNA片段的核苷酸序列(SEQ ID NO1)，找到内含子和翻译成氨基酸的一部分外显子(参见，图1(A))。结果，发现一部分外显子的氨基酸序列(SEQ ID NO2)显示与mMRP-2的第87到第110个氨基酸有50％的同源性，并在Lkn-1中，mMRP-1和mMRP-2中常见的两个另外的半胱氨酸中的第二个半胱氨酸(表示为“*”)是保守的(参见图1(B))。在图1(B)中，框线显示在Lkn-1和mMRP-2中保守的氨基酸。实施例2Lkn-1 cDNA的克隆为了克隆来自人细胞系的Lkn-1 cDNA，根据图1(B)公开的氨基酸序列(SEQ ID NO2)首先制备允许扩增100bp的Lkn-1外显子的PCR引物，即正向引物5’-TTCCTCACCAAGAAGGGG-3’(SEQ IDNO13)和反向引物5’-CTTTTTCATGCAATCCTG-3’(SEQ ID NO14)。然后，分别利用实施例1中制备的202bp-DNA片段，以100Fg/毫升的由IL-4活化24小时的人单核THP-1细胞系(ATCC TIB202)的总RNA、巨噬细胞系U937(ATCC CTL1593)的总RNA和HL-60细胞系(ATCC CCL240)的总RNA作为模板进行PCR(参见图2)。
在图2中，泳道1到4分别显示了利用202bp-DNA片段作为阳性对照，THP-1细胞系的总RNA，U937细胞系的总RNA和HL-60细胞系的总RNA进行的PCR的结果，泳道M显示了作为DNA大小标记的100bp序列梯。正如图2中所示，由IL-4活化的THP-1细胞系产生了Lkn-1 mRNA。
为了制备THP-1 cDNA文库，从由IL-4活化的THP-1细胞系分离人mRNA，利用Time Saver cDNA试剂盒(Pharmacia Biotech，美国)进行逆转录，得到双链cDNA，并且与BstXI衔接头(Invitrogen，美国)连接。然后，进行琼脂糖凝胶上的分级分离以便分离出0.5kb或更大的cDNA，将分离的cDNA插入进利用BstXI消化的PRc/CMV载体(Invitrogen，美国)以制备cDNA文库。将该cDNA文库与作为探针的上面PCR扩增的Lkn-1外显子的100bp-DNA片段杂交。作为结果，分离到了显示阳性信号的一个cDNA克隆。实施例3Lkn-1 cDNA的核苷酸序列图3显示了实施例2中获得的cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ IDNO4)，和由此推断的氨基酸序列(SEQ ID NO5)。在图3中，下面划线的是信号肽，在框线中的序列是图1(B)显示的Lkn-1的氨基酸序列(SEQ ID NO2)，它可以在THP-1 cDNA文库的筛选中用作探针，并且(***)表示为翻译终止密码。
正如图3所示，Lkn-1 cDNA(SEQ ID NO6)的开放读码框架编码含有形成信号肽的21个氨基酸和形成分子量被推断为10162道尔顿的成熟蛋白质的92个氨基酸的113个氨基酸。另外，在Lkn-1的推断出的氨基酸序列(SEQ ID NO5)中没有发现N-糖基化位点。
图4显示了成熟Lkn-1(SEQ ID NO7)的氨基酸序列与mMRP-1(SEQ ID NO8)、mMRP-2(SEQ ID NO9)、hMIP-1α(SEQ ID NO10)(参见Youn，B.S.等人，免疫学杂志，1552661(1995))、mMIP-1α(SEQ IDNO11)(参见Kown，B.S.和Weissman，S.M.，美国科学院年报，861963(1989))和hMIP-1β(SEQ ID NO12)(参见Sherry，B.等人，实验医学杂志，1682251(1988))中的那些的比较。在图4中，框线和(·)分别表示四个保守的半胱氨酸残基和另外的两个半胱氨酸残基。正如图4所示，表明(1)在β-趋化因子家族中常见的四个半胱氨酸残基的头两个半胱氨酸残基之前，Lkn-1具有长的N末端区；(2)Lkn-2属于正如在mMRP-1和mMRP-2中，除了具有β-趋化因子家族常见的四个半胱氨酸残基外还具有另两个半胱氨酸残基的C6β-趋化因子家族。另外，发现成熟的Lkn-1的氨基酸序列(SEQ ID NO7)显示与mMRP-1(SEQ ID NO8)或mMRP-2(SEQ ID NO9)只有43％的同源性，与hMIP-1α(SEQ ID NO10)只有40％的同源性，虽然Lkn-1是作为人的mMRP-2对应物而分离的。实施例4重组Lkn-1的表达实施例4-1在大肠杆菌中重组Lkn-1的表达为了只表达作为重组蛋白质的没有推断的信号肽的成熟的Lkn-1蛋白质，利用实施例2中克隆的Lkn-1 cDNA作为模板，用下面的PCR引物和Pfu聚合酶(Stratagene，美国)进行成熟的Lkn-1的开放读码框架的PCR扩增正向引物5’-CGAATTCCATATGCAGTTCACAAATGATGCAGAG-3’(SEQ ID NO15)反向引物5’-CGCCGCTCGAGTTGAGTAGGGCTTCAGC-3’(SEQ ID NO16)利用NdeI/XhoI消化如此扩增出的DNA片段，并且克隆进入质粒pET21a(Novagen，美国)。将这样构建的重组质粒命名为pET21a-Lkn-1并且导入大肠杆菌XL-1Blue。该重组质粒pET21a-Lkn-1允许在成熟的Lkn-1的N末端具有另外一个甲硫氨酸残基和在C末端具有另外6个组氨酸的重组Lkn-1的表达。
将这样制备的转化体命名为‘大肠杆菌(XL-1 Blue)hMRP-2’，并且在1996年9月10日以保藏号ATCC98166保藏于国际保藏授权单位，美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD20852，美国)。
培养所述的转化体以表达Lkn-1并且获得内含体，将内含体溶解于20毫升变性缓冲液(6摩尔/升盐酸胍，20毫摩尔/升Tris-HCl，pH7.9，500毫摩尔/升NaCl，4毫摩尔/升正-辛基吡喃葡糖苷)并且离心获得上清液。然后，利用活化的Ni-柱(Novagen，美国)和肝素琼脂糖柱(Pharmacia精细化学品公司，美国)进行层析纯化His-标记的重组Lkn-1。电泳表明该重组Lkn-1的分子量约为12千道尔顿。实施例4-2在昆虫细胞中重组Lkn-1的表达为了表达含有信号肽的重组Lkn-1，将含有信号肽序列的Lkn-1cDNA插入在N末端的PstI限制位点和在C末端的XbaI限制位点，并且通过PCR扩增。然后，分离这样扩增的PCR产物，并将其插入用PstI/XbaI消化的PVL1392载体(Invitrogen，美国)中以构建重组质粒PVL1392-Lkn-1。然后，利用所述的重组质粒和AcNPV(Autographacalifornia核多角体杆状病毒)转染Sf-21昆虫细胞以便将所述的重组质粒中的Lkn-1 cDNA转移到AcNPV中。根据病毒粒子是阴性闭塞的特征分离AcNPV-Lkn-1病毒噬菌斑，并让之在无血清Ex-细胞400培养基(JRH生物科学，美国)中的Sf-21昆虫细胞中生长以用于以后使用。
在Ex-细胞400培养基中培养的高5细胞系(Invitrogen，美国)表达重组的Lkn-1，并且利用HiTrap-肝素柱(药学生物技术公司，美国)和HiTrap-SP柱(药学生物技术公司，美国)纯化该表达出的Lkn-1。Western印迹分析表明在纯化后立即得到分析的重组的Lkn-1的分子量约为12千道尔顿。实施例5重组Lkn-1的骨髓抑制活性实施例5-1重组Lkn-1在体外抑制骨髓细胞的集落形成因为一些β-趋化因子在体外具有骨髓抑制活性，所以我们研究了在实施例4-1中纯化得到的重组Lkn-1对人骨髓中存在的骨髓祖细胞形成集落的影响。即，为了由CFU-GM(集落形成单位-粒细胞-巨噬细胞)形成骨髓细胞的集落，在含有10％FBS的0.3％琼脂培养基上以5×104细胞/毫升涂布利用Ficoll-Hypaque梯度(1.070gm/厘米3，西格玛化学公司，美国)离心获得的低密度人骨髓细胞，并且利用rhGM-CSF(重组人粒细胞-巨噬细胞-集落形成因子，100U/毫升，Immunex公司，美国)+rhSLF(重组人青灰因子，50纳克/毫升，Immunex公司，美国)来刺激上述人骨髓细胞。在另一方面，为了由CFU-GM、BFU-E(爆发集落形成单位-红细胞)和CFU-GEMM(集落形成单位-粒细胞-红细胞-巨噬细胞-巨核细胞)形成骨髓细胞的集落，在含有30％FBS的1％甲基纤维素培养基上以5×104细胞/毫升涂布所述的骨髓细胞，并且利用rhEPO(重组人红细胞生成素，1单位/毫升，Amgen公司，美国)、rhIL-3(重组人白细胞介素-3，100单位/毫升，Immunex公司，美国)或rhSLF进行刺激。
在刺激后，在5％CO2和5％O2的环境下在BNP-210温育器(TabaiESPEC公司，美国)中培养细胞，在14天后计数集落的数目(参见表1)。在这一实验中，重组Lkn-1以3-50纳克/毫升的浓度加入平板。
表1.重组Lkn-1对低密度的人骨髓细胞的集落形成的影响
a.在反应溶液中没有加入重组Lkn-1的实验组b用于刺激集落形成的生长因子。
c与对照比较的变化的水平(％)d与对照比较，变化的水平是显著的(p＜0.001)。
从上面表1可见，重组的Lkn-1以依赖浓度的方式明显地抑制CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM形成集落。与对照比较，集落形成的抑制水平是22-63％。在另一方面，发现重组的Lkn-1不能抑制由GM-CSF单独刺激的CFU-GM或由EPO单独刺激的BFU-E形成集落，这证明重组的Lkn-1对可由各种生长因子刺激的不成熟的祖细胞具有抑制效果。实施例5-2重组Lkn-1体内抑制骨髓细胞的增殖在体内评估Lkn-1的生物活性。即，给C3H/HeJ小鼠静脉内注射纯化的Lkn-1并且分别测定粒细胞巨噬细胞(CFU-GM)、红细胞系(BFU-E)和多潜能祖细胞(CFU-GEMM)的绝对数目和在骨髓和脾中它们的增殖速度利用0.1毫升无菌无致热原盐水或在无菌的无致热源的盐水中稀释的8微克纯化的Lkn-1经尾静脉给C3H/HeJ小鼠注射。在注射后24小时，类似于在实施例5-1中，在股骨的骨髓和在小鼠的脾中制备低密度的骨髓细胞。然后，在0.3％琼脂培养基上涂布CFU-GM，并且利用10％PWM小鼠脾细胞条件培养基刺激。同样，在0.9％甲基纤维素培养基上分别涂布BFU-E和CFU-GEMM，并且利用1单位的rhEPO、0.1毫摩尔/升氯高铁原卟啉和1％ PWM小鼠脾细胞条件培养基刺激。在这一实验中，分别以7.5×104和1.0×106细胞/毫升的浓度涂布骨髓和脾细胞。在刺激后，在实施例5-1中所述的相同条件下培养细胞，在温育5到7天后计数集落的数目(参见图5(A)和5(B))。在另一方面，借助于比活性为20居里/毫摩尔的氚标记的胸腺嘧啶(50微居里/毫升)杀死技术，测量DNA合成期(即，细胞周期的S期)期祖细胞的比例，以细胞周期中的S期细胞的百分数确定CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM的循环速度，(参见图5(C)和5(D))，所述杀死技术基于在细胞与氚标记的热胸腺嘧啶脉冲接触20分钟后形成的集落数目比与相当量的冷胸腺嘧啶接触时形成的集落数目在体外计算的减少。图5(A)到5(D)表明Lkn-1快速降低了骨髓干/祖细胞形成的集落的数目和在骨髓和脾中的它们的增殖速度(即，细胞循环速度)。在另一方面，评估了骨髓、脾和血液中带核的细胞率，发现与对照比较没有受到明显的影响。
为了研究Lkn-1的这些抑制效果的剂量依赖性，除了Lkn-1的浓度从0.1变化到20微克外，如上所述类似地确定CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM的循环速度(参见图6(A)和6(B))。正如图6(A)和6(B)可见，证明在骨髓和脾中，来自接受了3到10微克Lkn-1的小鼠的CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM处于非循环或慢循环状态，而来自接受了0.1到1微克Lkn-1的小鼠的细胞的循环速度没有变化，而只有脾的CFU-GEMM的循环速度有变化。Lkn-1降低整个细胞的循环速度达80到90％，并且BFU-E和CFU-GEMM似乎是对Lkn-1比对CFU-GM更敏感。
另外，为了研究Lkn-1的这些抑制效果的时间依赖性，将8微克Lkn-1注射给C3H/HeJ小鼠，分别在不同的时间点检测来自骨髓和脾的CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM的细胞循环状态(参见图7(A)到7(F))。正如图7(A)到7(F)所示，Lkn-1的抑制效果是依赖于时间的并且在骨髓和脾中是可逆的。即，在12小时中，Lkn-1使CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM处于以非循环或慢循环状态，并且在72小时后将它们恢复到对照水平。
Lkn-1对体内骨髓细胞增殖的剂量和时间依赖性和可逆的抑制效果强烈表明Lkn-1在保护正常的造血细胞不受细胞毒性抗癌药物的毒害或放射性的辐射中具有潜在的临床用途。实施例6研究作为趋化因子的重组Lkn-1为了研究重组的Lkn-1是否可能引起趋化性，利用Ficoll-Hypaque梯度(1.077gm/厘米3)离心获得了健康男人的外周血单核细胞(PBMC)。然后，基于它们附着于塑料表面的活性，从如此获得的PBMC中分离单核细胞，重复所述的分离步骤2次。在这一实验中，单核细胞分离步骤后残留的细胞作为淋巴细胞获得。通过Diff-Quick(Baxter科学公司，美国)染色的cytospin的显微镜检测确定这样获得的单核细胞和淋巴细胞的纯度。结果，发现单核细胞和淋巴细胞的纯度分别为90％和88％。
同样，利用3％的葡聚糖T500(药学精细化学公司，美国)进行沉淀并且利用Ficoll-Hypaque梯度离心获得红血细胞。在低渗溶液中溶解如此获得的红血细胞以获得人嗜中性粒细胞。通过形态学确定这样获得的嗜中性粒细胞的纯度。结果，发现纯度是95％。
在含有0.5％低内毒素BSA(西格玛化学公司，美国)和20毫摩尔Hepes的RPMI 1640(Gibco，美国)中分别以2×106细胞/毫升和8×106细胞/毫升悬浮上面分离的单核细胞和淋巴细胞。在HBSS中以1×106细胞/毫升悬浮嗜中性粒细胞。
然后，如下确定在48孔微室(Neuroprobe，美国)中细胞迁移的水平。只用缓冲溶液(对照)或含有重组Lkn-1、hMIP-1α(PeproTech，美国)、RANTES(PeproTech，美国)、IL-8(PeProTech，美国)或eotaxin(PeproTech，美国)的缓冲液填充微室的下面的孔，用50F1所述的细胞悬浮液填充上面的孔。通过适当的没有聚乙烯吡咯烷酮的过滤器分配孔成下层的孔和上层的孔。当利用嗜中性粒细胞和淋巴细胞时，过滤器的孔的直径是3Fm。当利用单核细胞时，它是5Fm。在37℃温育所述的微室1小时(嗜中性粒细胞)，2小时(单核细胞)或4小时(淋巴细胞)。从室中取出过滤器并且洗涤。固定在过滤器上的细胞，并且利用Diff-Quick染色。然后，计数细胞的数目(参见图8(A)到8(C))。
在图8(A)到8(C)中，将在趋化因子处理的实验组中迁移细胞的数目除以对照中的迁移细胞的数目获得的值表示为趋化指数。图8(A)是显示重组Lkn-1和RANTES吸引淋巴细胞的趋化性的图。图8(B)是重组Lkn-1和hMIP-1α吸引单核细胞的趋化性的图。图8(C)是显示重组Lkn-1和IL-8吸引嗜中性粒细胞的趋化性的图。
正如图8(A)到8(C)中所示，表明重组Lkn-1是吸引人外周血嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的强趋化因子。而且，重组Lkn-1显示能以相似于IL-8的方式吸引嗜中性粒细胞的趋化性(参见图8(C))，和以相似于hMIP-1α的方式吸引单核细胞的趋化性(参见图8(B))；并且它显示了以浓度依赖方式(浓度可高达10Fg/毫升的Lkn-1)吸引淋巴细胞的提高的趋化性，虽然显示出它的趋化性比RANTES的趋化性水平低(参见图8(A))。实施例7重组Lkn-1对钙流影响的分析实施例7-1在淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞中钙流的分析研究了重组Lkn-1是否可以结合受体以活化淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞而诱导钙流出。还检测了与其它抗受体的拮抗剂的竞争性关系。利用MSIII荧光计(Photon技术国际公司，美国)测量分离的外周血白细胞的亚群(淋巴细胞，单核细胞，和嗜中性粒细胞)中钙离子的变化，从而确定受体的活化。即，在37℃将细胞与2FM fura-2AM(西格玛化学公司，美国)反应45分钟，洗涤两次，在含有0.05％BSA的HBSS(pH7.4)中以1×107细胞/毫升的浓度再悬浮。在受搅拌的、套水小杯中加入2毫升细胞悬浮液，在37℃，在340纳米和380纳米连续使之活化。在加入25纳摩尔/升拮抗剂(重组Lkn-1，hMIP-1α，RANTES，IL-8或eotaxin)之前或之后，在510纳米测量所发出的荧光(参见图9(A)到9(F))。
在图9(A)到9(F)中，相对荧光表示为在340纳米和380纳米活化的荧光的相对比例。图9(A)显示了受加入一系列RANTES和重组的Lkn-1刺激的淋巴细胞中测量的相对荧光；图9(B)显示了受加入一系列重组的Lkn-1和RANTES刺激的淋巴细胞中测量的相对荧光；图9(C)显示了受加入一系列hMIP-1α和重组的Lkn-1刺激的单核细胞中测量的相对荧光；图9(D)显示了受加入一系列重组的Lkn-1和hMIP-1α刺激的单核细胞中测量的相对荧光；图9(E)显示了受加入一系列IL-8和重组的Lkn-1刺激的嗜中性粒细胞中测量的相对荧光；图9(F)显示了受加入一系列重组的Lkn-1和IL-8刺激的嗜中性粒细胞测量的相对荧光。如图9(A)-9(F)所示，发现在淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞中重组的Lkn-1诱导钙流入。
另一方面，在偶联G蛋白质的受体连续地与具有与受体信号相同的结合位点的配体接触短时间时，所述的受体脱敏感。当表达受体的所述细胞受到重组Lkn-1的刺激时，这样的现象就发生。
正如图9(A)到9(F)中所示，发现当受到RANTES和接着hMIP-1α刺激时，重组Lkn-1使淋巴细胞和单核细胞完全脱敏感(参见图9(B)和9(D))。但是，当受到重组的Lkn-1刺激时，RANTES或hMIP-1α不完全使淋巴细胞和单核细胞脱敏感(参见图9(A)和9(C))，这证明重组Lkn-1与RANTES和hMIP-1α共享受体，比RANTES和hMIP-1α诱导了更多的钙流。另外，在IL-8的进一步刺激过程中重组的Lkn-1没有使嗜中性粒细胞脱敏感，虽然重组的Lkn-1诱导了嗜中性粒细胞中的钙流(参见图9(F))。另外，在重组Lkn-1的进一步刺激过程中IL-8也没有使嗜中性粒细胞脱敏感(参见图9(E))。所以，清楚地证明了重组的Lkn-1不与IL-8共享受体虽然它是在嗜中性粒细胞中如IL-8一样诱导钙流的强因子。实施例7-2在表达CC趋化因子受体的细胞系中分析钙流研究了重组Lkn-1是否可以活化表达CC或CXC趋化因子的受体的细胞系，因为在实施例7-1中分析发现重组Lkn-1活化了可以被RANTES和hMIP-1α活化的受体。除了使用表达重组CCR1、CCR2B、CCR3、CCR4、CCR5或CXCR4的HOS细胞系(参见AIDS研究和NIH的参考反应试剂程序，美国)而代替使用分离的白细胞亚群外，以相似于实施例7-1的方式进行分析。已知hMIP-1α与CCR1和CCR5结合，而RANTES与CCR1、CCR3和CCR5结合。
图10(A)显示了受加入一系列各种试剂刺激的表达CCR1的HOS细胞系中测量的相对荧光，图10(B)显示受加入一系列各种试剂刺激的表达CCR3的HOS细胞系中测量的相对荧光。
正如图10(A)和10(B)中所示，表明在表达CCR1或CCR3的HOS细胞系中重组的Lkn-1强烈诱导钙流。但是，在表达其它受体的HOS细胞系中没有观察到重组Lkn-1诱导的钙流。
同样，正如图10(A)中所示，在受重组Lkn-1刺激后，CCR1-HOS细胞不再受hMIP-1α或RANTES的另外刺激，而在hMIP-1α或RANTES刺激后重组Lkn-1对CCR1-HOS细胞的进一步刺激却不受影响。
图10(A)表明重组Lkn-1是比hMIP-1α或RANTES更强烈的抗CCR1拮抗剂，这可以得到正如图10(C)所示的依赖于重组Lkn-1和hMIP-1α的浓度的钙应答清楚地证明。
另外，正如图10(B)所示，在eotaxin刺激CCR3-HOS细胞后，在eotaxin或重组Lkn-1进一步刺激的过程中CCR3-HOS细胞差不多完全脱敏感；在以重组Lkn-1刺激后而又以RANTES进一步刺激的过程中，CCR3-HOS细胞差不多完全脱敏感；但是，在以重组Lkn-1或RANTES刺激细胞后，eotaxin对CCR3-HOS细胞的进一步刺激却没有受影响。另外，钙应答依赖于eotaxin、重组的Lkn-1和RANTES的浓度；这一点显示，重组Lkn-1是比RANTES更强的抗CCR3拮抗剂，虽然它不是比eotaxin更强的一个(参见图10(D))。
正如上面所清楚说明和证明的，本发明提供编码属于C6β-趋化因子的新Lkn-1蛋白质的cDNA和由此推断的氨基酸序列。Lkn-1 cDNA的开放读码框架编码113个氨基酸，其中含有21个氨基酸的信号肽和含有92个氨基酸的分子量推断为10162道尔顿的成熟蛋白质。利用所述的Lkn-1 cDNA在大肠杆菌或昆虫细胞中表达重组的Lkn-1，并将之纯化，它明显抑制集落形成和细胞增殖，吸引嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞而引起趋化性，和能与CCR1和CCR3受体结合。因此，确定可以利用重组Lkn-1蛋白质作为在抗体生产、HIV-1感染过程中的治疗、在化学治疗或放射性治疗过程中保护骨髓干细胞和抑制白血病等等的潜在的药物。
序列表(1)总的信息(i)申请人(A)名称株式会社绿十字；等人(B)街道227，Gugal-Ri，Kiheung-Eup(C)城市Yongin，Kyonggi-Do(D)州无(E)国家韩国(F)邮编(ZIP)449-900(G)电话02-584-0131(H)电传02-582-6331(ii)发明题目从人分离的编码C6β-趋化因子Lkn-1的cDNA(iii)序列数目16(iv)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，#1.30版(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度202个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)几何结构线性(ii)分子类型DNA(iv)反义没有(vi)原始来源(A)生物体人(vii)即时来源
(A)文库来自人的基因组DNA文库(xi)SEQ ID NO1的序列描述CTGCCATCAG CAGAGAAAGG AAAAAACAGG CTGTGTTGAC TGGGAAATCT50GAGGAGCAGG GAGGATGGGG CCCCCTGTCT CCATCTGCCC ACACCTCAGT 100TTGTAATCTT TCTCTCCCTT GTTCCCCAGA TTCCTCACCA AGAAGGGGCG 150GCAAGTCTGT GCCAAACCCA GTGGTCCGGG AGTTCAGGAT TGCATGAAAA 200AG 202(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度24个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ii)分子类型蛋白质(vi)原始来源(A)生物体；人(xi)SEQ ID NO2的序列描述Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gln Val Cys Ala Lys Pro Ser15 10Gly Pro Gly Val Gln Asp Cys Met Lys Lys15 20(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列描述(A)长度24个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ii)分子类型蛋白质(vi)原始来源(A)生物体小鼠
(xi)SEQ ID NO3的序列描述Phe Ile Ser Lys Arg Gly Phe Gln Val Cys Ala Asn Pro Ser15 10Asp Arg Arg Val Gln Arg Cys Ile Glu Arg15 20(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度582个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)几何结构线性(ii)DNA(iv)反义无(vi)原始来源(A)生物体人(vii)即时来源(A)文库来自人的DNA文库(xi)SEQ ID NO4的序列描述CGGAGCCAGG AAGCAGTGAG CCCAGGAGTC CTCGGCCAGC CCTGCCTGCC 50CACCAGGAGG ATGAAGGTCT CCGTGGCTGC CCTCTCCTGC CTCATGCTTA 100TTGCTGTCCT TGGATCCCAG GCCCAGTTCA CAAATGATGC AGAGACAGAG 150TTAATGATGT CAAAGCTTCC ACTGGAAAAT CCAGTAGTTC TGAACAGCTT 200TCACTTTGCT GCTGACTGCT GCACCTCCTA CATCTCACAA AGCATCCCGT 250GTTCACTCAT GAAAAGTTAT TTTGAAACGA GCAGCGAGTG CTCCAAGCCA 300GGTGTCATAT TCCTCACCAA GAAGGGGCGG CAAGTCTGTG CCAAACCCAG 350TGGTCCGGGA GTTCAGGATT GCATGAAAAA GCTGAAGCCC TACTCAATAT 400AATAATAAAC AGACAAAAGA GGCCAGCCAC CCACCTCCAA CACCTCCTGT 450GAGTTTCTTG GTCTGAAATA CTTAAAAAAT ATATATATTG TTGTGTCTGG 500TAATGAAAGT AATGCATCTA ATAAAGGTAT TCAATTTTTT AACTTTGCTT 550GAGTTTTAAG AGGAAATAAA CTAATATAAA AC582(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度113个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性
(ii)分子类型蛋白质(vi)原始来源(A)生物体人(xi)SEQ ID NO5的序列描述Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Ile15 10Ala Val Leu Gly Ser Gln Ala Gln Phe Thr Asn Asp Ala Glu15 20 25Thr Glu Leu Met Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val30 35 40Val Leu Asn Ser Phe His Phe Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser45 50 55Tyr Ile Ser Gln Ser Ile Pro Cys Ser Leu Met Lys Ser Tyr60 65 70Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe75 80Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gln Val Cys Ala Lys Pro Ser Gly85 90 95Pro Gly Val Gln Asp Cys Met Lys Lys Leu Lys Pro Tyr Ser100 105 110Ile(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度342个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)几何结构线性(ii)分子类型DNA(iv)反义没有(vi)原始来源(A)生物体人(vii)即时来源(A)文库来自人的DNA文库
(xi)SEQ ID NO6的序列描述ATGAAGGTCT CCGTGGCTGC CCTCTCCTGC CTCATGCTTA TTGCTGTCCT 50TGGATCCCAG GCCCAGTTCA CAAATGATGC AGAGACAGAG TTAATGATGT 100CAAAGCTTCC ACTGGAAAAT CCAGTAGTTC TGAACAGCTT TCACTTTGCT 150GCTGACTGCT GCACCTCCTA CATCTCACAA AGCATCCCGT GTTCACTCAT 200GAAAAGTTAT TTTGAAACGA GCAGCGAGTG CTCCAAGCCA GGTGTCATAT 250TCCTCACCAA GAAGGGGCGG CAAGTCTGTG CCAAACCCAG TGGTCCGGGA 300GTTCAGGATT GCATGAAAAA GCTGAAGCCC TACTCAATAT AA 342(2)SEQ IDNO7的信息(i)序列特征(A)长度92个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ii)分子类型蛋白质(vi)原始来源(A)生物体人(xi)SEQ ID NO7的序列描述Gln Phe Thr Asn Asp Ala Glu Thr Glu Leu Met Met Ser Lys15 10Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val Val Leu Asn Ser Phe His Phe15 20 25Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser Tyr Ile Ser Gln Ser Ile Pro30 35 40Cys Ser Leu Met Lys Ser Tyr Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys45 50 55Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gln60 65 70Val Cys Ala Lys Pro Ser Gly Pro Gly Val Gln Asp Cys Met75 80Lys Lys Leu Lys Pro Tyr Ser Ile85 90(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征
(A)长度95个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ii)分子类型蛋白质(vi)原始来源(A)生物体小鼠(xi)SEQ ID NO8的序列描述Gly Leu Ile Gln Ile Met Glu Lys Glu Asp Arg Arg Tyr Asn15 10Pro Pro Ile Ile His Gln Gly Phe Gln Asp Thr Ser Ser Asp15 20 25Cys Cys Phe Ser Tyr Ala Thr Gln Ile Pro Cys Lys Arg Phe30 35 40Ile Tyr Tyr Phe Pro Thr Ser Gly Gly Cys Ile Lys Pro Gly45 50 55Ile Ile Phe Ile Ser Arg Arg Gly Thr Gln Val Cys Ala Asp60 65 70Pro Ser Asp Arg Arg Val Gln Arg Cys Leu Ser Thr Leu Lys75 80Gln Gly Pro Arg Ser Gly Asn Lys Val Ile Ala85 90 95(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度101个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ii)分子类型蛋白质(vi)原始来源(A)生物体小鼠(xi)SEQ ID NO9的序列描述Gln Ile Thr His Ala Thr Glu Thr Lys Glu Val Gln Ser Ser15 10Leu Lys Ala Gln Gln Gly Leu Glu Ile Glu Met Phe His Met15 20 25Gly Phe Gln Asp Ser Ser Asp Cys Cys Leu Ser Tyr Asn Ser30 35 40Arg Ile Gln Cys Ser Arg Phe Ile Gly Tyr Phe Pro Thr Ser45 50 55Gly Gly Cys Thr Arg Pro Gly Ile Ile Phe Ile Ser Lys Arg60 65 70Gly Phe Gln Val Cys Ala Asn Pro Ser Asp Arg Arg Val Gln75 80Arg Cys Ile Glu Arg Leu Glu Gln Asn Ser Gln Pro Arg Thr85 90 95Tyr Tyr Lys100(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)长度67个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ii)分子类型蛋白质(vi)原始来源(A)生物体人(xi)SEQ ID NO10的序列描述Ala Ser Leu Ala Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser15 10Tyr Thr Ser Arg Gln Ile Pro Gln Asn Phe Ile Ala Asp Tyr15 20 25Phe Glu Thr Ser Ser Gln Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe30 35 40Leu Thr Lys Arg Ser Arg Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu45 50 55Glu Trp Val Gln Lys Tyr Val Ser Asp Leu Glu60 65(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)长度66个氨基酸
(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ii)分子类型蛋白质(vi)原始来源(A)生物体小鼠(xi)SEQ ID NO11的序列描述Ala Pro Tyr Gly Ala Asp Thr Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser15 10Tyr Ser Arg Lys Ile Pro Arg Gln Phe Ile Val Glu Val Phe15 20 25Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Gly Val Ile Phe Leu30 35 40Thr Lys Arg Asn Arg Gln Ile Cys Ala Asp Ser Lys Glu Thr45 50 55Trp Val Gln Glu Tyr Ile Thr Asp Leu Glu60 65(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)长度67个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ii)分子类型蛋白质(vi)原始来源(A)生物体人(xi)SEQ ID NO12的序列描述Ala Pro Met Gly Ser Asp Pro Pro Thr Ala Cys Cys Phe Ser15 10Tyr Thr Ala Arg Lys Leu Pro Arg Asn Phe Val Val Asp Tyr15 20 25Tyr Glu Thr Ser Ser Leu Cys Ser Gln Pro Ala Val Val Phe30 35 40Gln Thr Lys Arg Ser Lys Gln Val Cys Ala Asp Pro Ser Glu45 50 55Ser Trp Val Gln Glu Val Tyr Tyr Asp Leu Glu60 65(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)几何结构线性(ii)分子类型DNA(vii)即时来源(B)克隆引物(xi)SEQ ID NO13的序列描述TTCCTCACCA AGAAGGGG(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)几何结构线性(ii)分子类型DNA(vii)即时来源(B)克隆引物(xi)SEQ ID NO14的序列描述CTTTTTCATG CAATCCTG(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)长度34个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链
(D)几何结构线性(ii)分子类型DNA(vii)即时来源(B)克隆引物(xi)SEQ ID NO15的序列描述CGAATTCCAT ATGCAGTTCA CAAATGATGC AGAG(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)几何结构线性(ii)分子类型DNA(vii)即时来源(B)克隆引物(xi)SEQ ID NO16的序列描述CGCCGCTCGA GTTGAGTAGG GCTTCAGC
权利要求
1.人C6β-趋化因子Lkn-1的cDNA，它的核苷酸序列表示如下(SEQ ID NO6)ATG AAG GTC TCC GTG GCT GCC CTC TCC TGC CTC ATG CTT 39ATT GCT GTC CTT GGA TCC CAG GCC CAG TTC ACA AAT GAT 78GCA GAG ACA GAG TTA ATG ATG TCA AAG CTT CCA CTG GAA 117AAT CCA GTA GTT CTG AAC AGC TTT CAC TTT GCT GCT GAC 156TGC TGC ACC TCC TAC ATC TCA CAA AGC ATC CCG TGT TCA 195CTC ATG AAA AGT TAT TTT GAA ACG AGC AGC GAG TGC TCC 234AAG CCA GGT GTC ATA TTC CTC ACC AAG AAG GGG CGG CAA 273GTC TGT GCC AAA CCC AGT GGT CCG GGA GTT CAG GAT TGC 312ATG AAA AAG CTG AAG CCC TAC TCA ATA TAA 342
2.人C6β-趋化因子Lkn-1，它的氨基酸序列表示如下(SEQ IDNO5)Met Lys Val Ser Val Ala Ala Leu Ser Cys Leu Met Leu Ile15 10Ala Val Leu Gly Ser Gln Ala Gln Phe Thr Asn Asp Ala Glu15 20 25Thr Glu Leu Met Met Ser Lys Leu Pro Leu Glu Asn Pro Val30 35 40Val Leu Asn Ser Phe His Phe Ala Ala Asp Cys Cys Thr Ser45 50 55Tyr Ile Ser Gln Ser Ile Pro Cys Ser Leu Met Lys Ser Tyr60 65 70Phe Glu Thr Ser Ser Glu Cys Ser Lys Pro Gly Val Ile Phe75 80Leu Thr Lys Lys Gly Arg Gln Val Cys Ala Lys Pro Ser Gly85 90 95Pro Gly Val Gln Asp Cys Met Lys Lys Leu Lys Pro Tyr Ser100 105 110
3.人C6β-趋化因子Lkn-1的cDNA，其中缺失了第1到第63位核苷酸序列。
4.包括权利要求1的cDNA的表达载体。
5.包括权利要求1的cDNA的表达载体PVL 1392-Lkn-1。
6.制备重组Lkn-1的方法，包括用权利要求4所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，以及从培养物中获得重组的Lkn-1。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌或昆虫细胞。
8.-种重组的Lkn-1，它是由包括如下步骤的方法制备的用权利要求4所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，从培养物中获得重组的Lkn-1。
9.根据权利要求8所述的重组的Lkn-1，它抑制集落形成。
10.根据权利要求8所述的重组的Lkn-1，它强烈吸引人外周血中嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞而引起趋化性。
11.根据权利要求8所述的重组的Lkn-1，它与CCR1和CCR3受体结合。
12.根据权利要求11所述的重组Lkn-1，它与RANTES(受活化调节的正常T细胞表达的序列)和hMIP-1α(人巨噬细胞炎症蛋白质-1α)共享受体，而不与IL-8(白细胞介素-8)共享受体。
13.一种表达载体，它包括权利要求3所述的cDNA。
14.包括权利要求3所述的cDNA的表达载体pET21a-Lkn-1。
15.用权利要求14所述的表达载体转化的大肠杆菌(XL-1 Blue)hMRP-2(ATCC 98166)。
16.制备重组的Lkn-1的方法，该方法包括如下步骤利用权利要求13所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，和从培养物中获得重组的Lkn-1。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌或昆虫细胞。
18.一种重组的Lkn-1，它是由包括如下步骤的方法制备的用权利要求13所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，和从培养物中获得重组的Lkn-1。
19.根据权利要求18所述的重组的Lkn-1，它抑制集落形成。
20.根据权利要求18所述的重组的Lkn-1，它强烈吸引人外周血中嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞而以引起趋化性。
21.权利要求18所述的重组的Lkn-1，它与CCR1和CCR3受体结合。
22.根据权利要求21所述的重组的Lkn-1，它与RANTES(受活化调节的正常T细胞表达的序列)和hMIP-1α(人巨噬细胞炎症蛋白质-1α)共享受体，而不与IL-8(白细胞介素-8)共享受体。
23.保护骨髓细胞不受细胞毒性抗癌药物毒害或辐射的方法，包括以人C6β-趋化因子Lkn-1给需受保护的个体给药。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述人C6β-趋化因子Lkn-1是权利要求8所述的重组的Lkn-1。
25.根据权利要求23所述的方法，其中人C6β-趋化因子Lkn-1是权利要求18所述的重组的Lkn-1。
全文摘要
本发明涉及编码属于C6β－趋化因子并且吸引外周血白细胞的亚群的新蛋白质的cDNA,和利用其表达载体制备所述蛋白质的方法。Lkn－lcDNA的开放读码框架编码含有21个氨基酸的信号肽的113个氨基酸,并且推测其中含有92个氨基酸的成熟蛋白质的分子量是10162道尔顿。利用所述的Lkn－lcDNA在大肠杆菌或昆虫细胞中表达重组的Lkn－1并且纯化,它明显抑制集落的形成和细胞的增殖,吸引嗜中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞而引起趋化性,并且结合CCR1和CCR3受体。因此,重组的Lkn－1蛋白质可以用作生产抗体、治疗HIV－1感染、在化学治疗或放射性治疗过程中保护骨髓干细胞和抑制白血病等等的潜在药物。
文档编号A61P37/00GK1282371SQ98811574
公开日2001年1月31日 申请日期1998年11月27日 优先权日1997年11月27日
发明者拜昂·S·夸恩, 尹秉寿, 郑守一, 朴斗鸿, 白承宰, 李恩京 申请人:株式会社绿十字