单个细胞结构和细胞器官结构的电渗透方法及其应用的制作方法

专利名称：单个细胞结构和细胞器官结构的电渗透方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及渗透(permeabilisation)细胞结构、细胞器官结构和细胞状结构，以便把化合物输入或输出这些结构的高度立体清晰的方法。本发明还涉及该方法的应用。
在过去的二十年内，可以供单细胞的生物化学和生物物理研究之用的实验方法得到了极大的发展。这些方法包括补片夹记录方法(patchclamp recording)，它可用于测量通过单离子通道的跨膜电流(O．P．Hamill，A．Marty，E．Neher，B．Sakman，F.J．Sigworth，PfleugersArch．391，85-100(1981))；可用于测定单细胞和单细胞器官中的生物活性成分位置的激光共焦显微成象技术(S．Maiti，J．B．Shear，R．M．Williams，W.R Zipfel，W．W．Webb，Science，275，530-532(1997))；用于细胞内部pH值测量的近场光学探头的应用；及用于测量含儿茶酚和吲哚-胺的单囊泡的释放的超微电极的应用(R．H．Chow，L．Von Ruden，E．Neher，Nature，356，60-63(1992)和R．M．Wightman，J．A．Jankowski，R．T．Kennedy，K．T．Kawagoe，T．J．Scroeder，D．J．Leszczyszyn，J．A．Near，E．J．Diliberto Jr．，O．H．Viveros，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A，88，10754-10758(1991))。
虽然存在对单细胞和亚细胞细胞器官的内容进行检测、成象和分析的多种高分辨率技术，但是几乎不存在控制并操纵这些隔室的生物化学性质的方法。包括在细胞中的生物及医学应用的大多数化合物是极性的。极性溶质不能透过细胞，并且不能通过生物膜，除非存在特定的输送物。通常在实验生物学及在生物化学和临床工作中，必须把极性溶质引入细胞的细胞质中，或者引入细胞器官的内部。这种极性溶质的例子是纳米粒子，染料，药物，DNA，RNA，蛋白质，肽及氨基酸。目前，例如用染料标记细胞培养中的细胞，或者用基因转染(transfect)该细胞，而不标记或转染其相邻细胞是非常困难的。更为困难的是把极性分子引入细胞器官中，因为它们的尺寸往往小于光学显微镜的分辨率极限，或者直径上至少小于几个微米。
另外还提出了用于单个细胞和单个细胞核的微观注射技术(例如参见M．R．Capecchi，Cell，22，479-488(1980))，但是随着细胞或细胞器官尺寸的减小，这些技术变得越来越难以实现。对于直径只有几微米或更小的细胞和细胞器官测量来说，微观注射技术实际上不可能得到应用。
早已认识到脉冲电场可透过细胞膜(例如参见Zimmermann，U．Biochim．Biophys Acta，694，227-277(1982)；Tsong，T．Y． Biophys．J．，60，297-306(1991)；Weaver，J．C．J．Cell．Biochem．，51，426-435(1993))。该技术被称为电造孔(electroporation)。可根据下式计算持续时间t内，暴露在均匀电场中的磷脂双层球体上不同位置处的膜电压VmVm=1．5rcEcosα[1-exp (-τ／t)] ( 1 )其中E是电场强度，rc是细胞半径，α是相对于电场方向的角度，τ是阻容时间常数。小孔的形成将导致暴露于最大电位偏移的球坐标系，最大电位偏移位于面对电极的两极(α=0，则cosα=1；α=π，则cosα=-1)。通常，持续时间几微秒至几毫秒，数量级为1-1．5kV／cm的电场强度足以在外径10微米的球形细胞中引起瞬态透过。最近的研究表明独立的线粒体，由于其相应更小的尺寸，需要7-10倍更高的电场强度，以便注入7．2-千基(kilobase)质粒DNA(J-M．Collombet，V．C．Wheeler，F.Vogel，＆C．Coutelle J．Biol．Chem．，272，5342-5347(1997))。还观察到在约2．5kV／cm的较低电场强度下的线粒体外膜融合。
通常，以分批方式实现电造孔，便于把极性溶质同时引入几百万个细胞中。产生这种电场的电极可为几个平方厘米，并且电极之间的距离为几个厘米，从而为了获得引起生物膜的电诱发渗透的所需电场强度，需要高电压电源。
和微观注射技术相比，电造孔的一个优点是电造孔可以非常快，并可被精确计时(例如参见K．Kinosita，K．，Jr．，I．Ashikawa，N．Saita，H．Yoshimura，H．Itoh，K．Nagayama，＆A．IkegamiJ．Biophys．，53，1015-1019(1988)；M．Hibino，M．Shigemori，H．Itoh，K．Nagayama，＆K．Ki-nosita，K．，Jr．，Biophys．J．，59，209-220(1991))，这在研究快速反应现象方面非常重要。
K．Kinosita，Jr．，＆T．Y．Tsong，T．Biochim．Biophys．Acta，554，479-497(1979)；D．C Chang，J．Biophys．，56，641-652(1989)；P．E．Marszalek，B．Farrel，P.Verdugo，＆J．M．Fernandez，Biophys．J．，73，1160-1168(1997)中说明了可用于悬浮液中的少量细胞的电造孔的仪器，Q．A．Zheng，＆D．C．Chang，Biochim．Biophys．Acta，1088，104-110(1991)；M．N．Teruel，＆T．Meyer Biophys．J．，73，1785-1796(1997)中说明了可用于在培养基上生长的少量粘附细胞的电造孔的仪器。由Marszalek等构造的电造孔装置的设计基于以100微米的固定距离并行粘结在单个玻璃微量吸移管上的直径80微米，长6毫米的铂丝。Kinosita和Tsong的设计使用间隔2毫米的间隙距离的固定黄铜电极，Teruel和Meyer的微造孔器(microporator)设计取决于间隔约5毫米的间隙距离的两个铂电极，Chang设计的电造孔室使用间距0．4毫米的约1毫米长的铂丝。显然，这些电造孔装置产生比单个细胞的尺寸大几个数量级的电场，单个细胞的直径一般为10微米，从而这些电场不能用于单个细胞或单个细胞器官的专用电造孔，或者用于在单个细胞内的电造孔。另外还设计了用于临床应用的电造孔装置。例子包括通过电造孔向肿瘤输送药物和基因的装置(WO96／39226)，和通过电造孔向血细胞输送药物和基因的装置(US专利5501662)。同样，这些装置不能用于产生用于单个细胞，单个细胞器官，或者细胞内的细胞器官群的电造孔的高度定域电场。
已知技术的一个主要缺点是它们不适用于单个细胞或者单个细胞内器官的穿透。
本发明提供一种基于凭借脉冲电场的磷脂双层膜的穿透，即所谓的电造孔，改变单个细胞和细胞器官的生物化学内容的高度立体清晰的技术。
和已知的电造孔方法相比，根据本发明的方法的一个优点是根据本发明的方法的特征在于由高度集中的穿透电场确定的极高的空间分辨率。通过利用外径在几纳米到几微米范围内的一对电造孔电极，获得这种高度集中的电场。这使单个细胞，甚至细胞内结构的电造孔成为可能。利用高分度的微定位器独立控制电极，从而使电极能够相对于要穿透的结构准确对准。在有效的小孔打开时间内，加入细胞外或细胞器官外的媒介物中的不可透过细胞(cell-impermeant)的溶质可通过扩散进入细胞或细胞器官内部。
和已知的单个细胞和单个细胞核的微注射技术相反，本发明可应用于亚飞升(＜10-151)体积或直径小于几微米的生物容器，这是本发明的另一重要优点。
此外，本发明和现有技术的区别在于通过借助电极间距离极短的纳米或微米直径的电极，施加电场，实现单个细胞或亚细胞空间分辨率的电造孔。电极由高分度的显微操作器单独控制，使得能够精确地聚集电极之间的电场。从而可实现单个细胞或单个细胞器官的电造孔。利用本发明，可以这样的方式进行电造孔，即只穿透目标细胞，而不会穿透其相邻细胞。另外，可对单个的细胞过程电造孔。借助本发明，甚至可在定域电场下保持具有目标类别的细胞器官的空间分明的细胞内区域，从而能够把极性溶质传入细胞器官中。细胞器官电造孔的应用包括线粒体染色体组改变。众所周知线粒体染色体组中的突变可导致众多的疾病，并且基因治疗具有潜在的极大重要性。但是，到现在为止，在把新的基片染片引入线粒体之前，必须从细胞中分离出线粒体。随后，必须重新把线粒体嵌入细胞中。根据本发明的技术使得可以在线粒体包含在细胞内时，直接把基因引入线粒体中。这是和常规的线粒体转染方案相比的一个显著进步。
除了通过利用纳米和微米电极获得的高空间分辨率外，根据本发明的技术还避免了昂贵的高电压脉冲发生器的使用，以及复杂的微室安装。原则上，根据本发明的方法可用电池作电源，因为电极之间的间距较小，通常为20微米或更小，这导致小幅度电压脉冲下可得到高的电场强度。该技术是利用单个细胞和亚细胞尺寸的高度集中的电场，选择性地把溶质转移到生物结构中的第一实证。
另外，根据本发明的方法可用于生物传感器应用，其中细胞或细胞状结构被放置在穿透直流或交流电场中，同时被补充药物或感兴趣的其它化合物。一种特殊的应用是电造孔和微型化学分离的结合，其中使用由熔融二氧化硅或类似物质制成的中空液体电极。
借助根据本发明使用的由高分度微操作器控制的超微电极，例如碳纤维电极，易于把电场集中到界限非常分明的区域。
这样，本发明涉及一种用于穿透包括单个细胞或细胞状结构，细胞内结构或细胞器官的细胞结构的方法，其特征在于包括下述步骤(a)提供微电极；(b)把微电极和电源相连；(c)利用高分度微操作器，在适当的电极间距离的情况下，把由高分度微操作器单独控制的电极放置在细胞或细胞器官结构的附近，或者放入单个细胞内；(e)在电极之间施加强度足以实现电造孔的高度集中的电场。
细胞结构可以是任意类型的细胞或细胞状结构，例如原生细胞结构中的细胞，组织切片或组织中的细胞，体内细胞，脂质体，或者诸如细胞器官之类的细胞内细胞结构。
根据本发明的方法可用于把溶质从细胞外媒介质中转移到穿透后的细胞结构中，或者用于把细胞结构中捕获的溶质向外转移到细胞外媒介质中。根据本发明的方法还可用于即使当细胞器官位于细胞内部时，把物质输入或输出该细胞器官。
该方法特别适于细胞迁移，增殖，生长和变异，以及众多的生物化学和生物物理活动的研究。该方法还发展了在单个细胞内，或者在分离的和原位的细胞器官中的高度空间清晰地分布纳米微粒，药物，基因和诸如染料之类的不同生物化学标记的可能性。该方法还可在临床应用中用在把药物和基因引入患者体内的传递手段。
本发明还可用于生物传感器应用中。具体地说，可把单个细胞放置在穿透交流或直流电场中，从而使影响细胞内化学性质，包括存在各种细胞器官的表面上的受体的活化作用的不可透过细胞的分子能够被激活。这样，可对于生物活性筛选作用于细胞内化学性质的化合物库。随后可利用灌注系统或注射器把感兴趣的化合物加入细胞液中。在一种特殊情况下，可利用内部尺寸较小的熔融二氧化硅电泳毛细管输送感兴趣的化合物。由于电泳毛细管和电压源相连，因此可把电泳毛细管看作充满液体的电极。如果电泳毛细管的输出端被放置在距离细胞膜足够近的地方，并且施加足以使绝缘细胞膜击穿的电场强度，则注入毛细管的化合物将穿过细胞膜障碍，并进入它们可作用于细胞内受体和细胞内化学性质的细胞内部区域。由于电泳是一种化学分离技术，因此电泳可被用作生物上重要的化合物的分离和筛选方法。
根据下面的说明和附加的权利要求，本发明的区别技术特征将是显而易见的。
在下面的说明和例子中，参考了附图，其中

图1表示了用于执行根据本发明的方法的设备的最佳实施例。
图2A-C示意地表示了电极的定位和用于单个细胞的电造孔的电场。图2A图解说明了当所有溶质存在于细胞外空间中时，电造孔之前的情形。图2B图解说明了当在细胞上产生导致溶质穿透并扩散进入细胞中的高度集中的电场时，电压脉冲施加过程中的情形。图2C图解说明了当细胞膜孔被关闭，并且溶质被捕获到细胞内时，电造孔之后的情形。利用该方案，在高的电场强度下对细胞内器官电造孔也是可行的。这将在细胞膜和细胞器官结构中导致形成小孔。
图3表示了可用于细胞内器官的电造孔的配置。图3A表示了插入细胞中的一对电极。电极尖端被布置成使要穿透的细胞器官位于电极尖端之间。图3B表示了强度足以导致在细胞器官中形成小孔的电场的施加。从而注入细胞中的细胞器官穿透分子可扩散进入细胞器官中。图3C中，电极对被抽出，从细胞质中除去多余的分子，分子只位于穿透的细胞器官群内。
图4A和B表示了利用充满电解液的电极的细胞电造孔。图4A表示了充满液体的熔融二氧化硅电极，其输出端被放置在单个细胞的膜的附近。毛细管电极内的电解液含有不可透过细胞的分子。图4A图解说明了当施加穿透电场，并且电解液中所含的分子通过电渗和电泳迁移到毛细管电极的输出端时的情形。
图5图解说明了根据本发明的方法的临床应用的一个例子。两个电极被放置在人脑的细胞结构中。可利用图中由笛卡尔坐标系统表示的立体(stereotactic)图谱(atlas)，和立体微操作器实现电极的定位。一个电极是中空的，用于灌注，例如药物或基因。这里如图所示，可利用注射器或借助其它一些手段，包括电泳实现灌注。
图6A和B表示了通过显微镜获得的证明先驱细胞的电造孔引入荧光素的视频图象。图6A是两个先驱细胞的亮场图象。在存在荧光素的情况下，上部的细胞被电造孔。图6B是证明荧光唯一地局限于上面的细胞，同时荧光素实质上不溢出到相邻的细胞的荧光图象。
图7表示了证明由于分别在高的电场强度和低的电场强度下，通过电造孔把荧光引入单个先驱细胞中引起的不同荧光着色的显微照片。图7A表示了在约2伏的原生质膜超阀电位(0．5Hz重复频率下的10个脉冲)下被电造孔的两个细胞，由于染料被引入细胞器官中，两上细胞都表现出加强(punctuate)细胞质荧光图案。图7B表示了在约1伏的原生质膜阀电位(0．5Hz重复频率下的10个脉冲)下被电造孔后的三个细胞的图象，这里，荧光被散射，并均匀地分布在整个细胞上，证明荧光素通过电造孔进入细胞的细胞质中。
借助根据本发明的方法，能够穿透细胞结构或细胞状结构，从而可向细胞状结构内输入或向细胞状结构外输出极性、不可透过的溶质，例如纳米粒子，药物，染料，RNA，DNA，蛋白质及肽。该技术基于高度集中电场的应用，借助放置在细胞结构旁的微电极和电压源，该高度集中电场被施加在整个细胞结构上。微电极由显微操作器，最好由高分度显微操作器控制，并可在三维空间中以几十到几百纳米的增量平移。最好使用两个微电极，电极可由碳纤维、金属或其它导电材料制成。电极可以是中空的，以便通过内通道引入，例如药物，基因或染料。细胞结构的电造孔所需的电流也可由内通道中所含的电解液输送。这种中空的毛细管电极可由熔融的二氧化硅或类似材料制成，从而能够通过电泳或电渗向细胞或细胞器官输送药物，基因或染料。电极的直径最好仅为几个纳米到几个微米。在中空电极的情况下，内通道直径可为几个纳米到几十个微米，而外径可为几个微米到几百个微米。最好使用两个微电极。但是，用于电造孔的单个电极可和保持在接地电位或负电位下的中型或较大的电极一同使用。对于细胞膜和该细胞内所含的细胞器官的电造孔来说，电极可被放置在细胞附近，对于细胞内所含的细胞器官的专用电造孔来说，电极可被放置在细胞内。
电压源产生波形可为方波，指数波，或者任意其它波形的电压脉冲。另外还可使用DC电流和AC电流。
根据处理的细胞结构的类型和大小，引起电造孔所需的电场变化极大。本领域中的技术人员可利用在本申请书的背景技术部分中给出的等式1计算适当的电场强度。电场强度由电压和电极间距离调节。适当的电场强度可为0．01kV／cm-100kV／cm。适当的电极间距离小于10毫米，最好小于100微米。如果要处理单个哺乳类细胞，最好使用0．1-30微米的电极间距离，100mV-100V的电压。
电压脉冲的持续时间可从几微秒到几分钟不等，同样取决于处理的细胞结构的类型和大小。电压脉冲的长度最好为1微秒-500毫秒。
在电压脉冲的施加过程中，通过形成小孔，细胞结构被穿透，允许用其它方法不能通过生物双层膜的极性溶质通过扩散进入或离开细胞结构的内部。根据本发明的方法的空间分辨率由电极大小和电极间的间隙距离决定，电极大小在直径上可仅为几个纳米，电极间的间隙距离可为几个纳米到几个微米，从而即使对于最小的细胞内器官和例如纳米级细菌，也可实现电造孔。
当根据本发明的方法用于把生物标记，纳米粒子，染料和其它粒子输入细胞结构中时，一些应用是细胞迁移，繁殖，生长，以及其它生物化学和生物物理事件的研究。该方法可证明在临床应用中可用作把药物和基因引入患者中的载体。中空的电极构形特别适合于临床应用，其中通过电极中的小通道，引入要电穿孔(electroporate)进入细胞中的化合物。
当在玻璃试管内执行根据本发明的方法，以便把溶质输入细胞结构，例如组织切片，初生培养物，细胞线(cell line)，或者细胞器官的制备样品时，恰当的设备可能是图1中图解说明的最佳实施例，它包括外径在纳米～微米尺寸范围内，与电压发生器3相连的两个碳纤维微电极1，2。电极最好通过管形瓶(vial)4，5和银线6，7与电压发生器相连，管形瓶4，5含有，例如3M KCl，水银或银胶。通常用加有将被引入该细胞中的化合物的某些类型生理缓冲剂把细胞结构8保存在，例如培养皿9中。为了便于观察，从而便于电极相对于细胞结构的定位，可使用显微镜。在图1中所示的最佳实施例中，培养皿位于反转的显微镜载片台上，并通过显微镜物镜11观察。借助三维微定位器12，13，最好是高分度类型微定位器把电极1，2放置在细胞结构的每一侧，最好呈直线相对布置，以便电极和中央的细胞结构相互面对。这是以这样的方式实现的，即使在电极之间产生的电场高度集中在要电穿孔的结构上。
由于电极顶端之间的距离非常短，只有几微米，因此通常只需要低电压发生器，即可产生生物膜的电造孔所需的电场。最好，把矩形DC电压脉冲施加在细胞上，并在细胞膜上形成小孔，通过该小孔，溶质沿其深度梯度降低的方向扩散进入细胞内部。
随着缓冲剂成分的不同，电极上的条件被改变。电极上的电化学反应，例如水的还原及氯化物的氧化，将导致部分电压损失，应对给定的每组电极材料和缓冲剂系统计算有效电压。
图2A-C是关于单细胞的电造孔的电极定位和电场的示意图。图2A图解说明了电造孔之前，当所有溶质存在于细胞外时的情形。图2B图解说明了电压脉冲施加过程中，当在细胞上产生高度集中的电场，导致溶质透过并扩散进入细胞时的情形。图2C图解说明了电造孔之后，当关闭膜孔，溶质被捕获到细胞内时的情形。利用该方案，在高电场强度下，对细胞内器官进行电造孔也是可行的。这将在细胞膜和细胞器官结构两方面导致小孔形成。
在细胞结构的电造孔之后，如果需要的话，可清洗细胞培养皿，以便除去多余的溶质。随后用缺乏溶质的缓冲剂或培养基替换该缓冲剂。
借助本发明，还可排它地对细胞器官电造孔。细胞器官可包含在单个细胞内，或者可与单个细胞或细胞群分离。如上所述，脉冲强度取决于要电造孔的结构，及电极之间的距离。小的细胞器官结构，象内质网状结构(endoplasmic reticuli)和线粒体，为了在膜中产生小孔需要较高的电压。脉冲持续时间也可在几微秒到几分钟的范围内变化，取决于膜结构，还取决于要引入的化合物的结构。扩散速率低的大分子移入细胞中需要较长的时间。对于细胞内的细胞器官的电造孔来说，最好使用细胞内电造孔电极。这些电极可具有电绝缘的柄部，以便与细胞膜接触的电极部分不会引起电诱发成孔。电极的顶端可由导电材料，例如沉积金属，或者碳纤维制成。或者，对此目的来说，也可使用充填电解液的中空纤维电极。就直径而论，用于细胞器官的电造孔的细胞内电极的物理尺寸可在几纳米到几微米之间变化。
图3中表示了用于细胞内器官的电造孔的最佳实施例。本配置中使用的电极1，2具有由导电材料制成的尖端14，15和电绝缘的柄部。这种电极的顶端直径介于几纳米到几微米之间。图3A表示了插入细胞膜16围绕着的细胞中的一对电极1，2。利用高分度的微操作器(图中未表示)实现电极的插入和定位。电极尖端14，15放置在感兴趣的细胞内区域中。电极被布置成使要透过的细胞器官17位于电极尖端之间。图3B中，施加了强度足以在细胞器官17中导致成孔的电场。从而，利用微注射器，或者借助其它一些手段注入细胞中的不可透过细胞器官分子18可扩散进入穿透的细胞器官17中。重复该过程，直到要求数目的细胞器官已被穿透为止。图3C中，电极被收回，利用降解路径，或者借助其它一些手段，从细胞质中除去多余的分子，并使分子排他地位于穿透的细胞器官群内。
本发明的另一应用是供生物传感器技术使用。具体地说，通过在单个细胞上施加穿透电场，细胞内化学性质和细胞器官可用于生物传感用途。例如，为了利用这种方案，可化验激活内质网状结构上的受体的肌醇三磷酸盐(inositoltriphosphate)。该化合物被简单地加入围绕着穿透细胞的缓冲剂中，将扩散进入细胞内部，并结合内质网状结构上的受体。当肌醇三磷酸盐与受体结合时，内质网状结构将释放钙离子。如果随后该细胞被补加荧光钙(fluorogenic calcium)螯合染料，例如fluo-3，则随着荧光的增大，可测量受体活性。
当使用中空的纤维电极时，根据本发明，利用灌注系统，例如微注射泵或者蠕动泵，可把加入电极内溶液中的不可透过细胞的分子引入细胞中。根据另一方案，充填电解液的内径狭窄的熔融二氧化硅毛细管被用作电造孔电极。如图4中所示，借助这些电极，可利用电泳或电渗把电解液溶液中所含的不可透过细胞的分子输入细胞中。如前所述，施加的电场导致在细胞中成孔。由于电极电解液内的成分将基于它们的电荷-分数阻力比被分离，该方法可用于，例如生物传感器应用。对于细胞的电造孔，可利用具有用于施加引起成孔必需电场的导电尖端的电极，或者利用充填有输送引起成孔所需电流的电解液的电极。就具有导电尖端的电极来说，利用灌注系统，例如微注射泵或蠕动泵，可把补加到中空电极中所含液体中的不可透过细胞的分子引入细胞中。在利用其中穿透电流由电解液输送的中空电极的情况下，可通过电泳或电渗，把中空电极的电解液中所含的分子输入细胞结构中。当利用电泳或电渗时，中空电极中的成分可基于它们的电荷-分数阻力比被分离。这为实行基于细胞器官传感器的电泳分离物质的检测提供了可能性。
图4A和B中图解说明了利用具有锥形尖端的充填液体的熔融二氧化硅电极。可通过在火焰中拉拔熔融二氧化硅毛细管，在氢氟酸中蚀刻，或者通过研磨来形成这种锥形尖端。
图4A表示了充填电解液的熔融二氧化硅电极1，其锥形出口放置在单个细胞的细胞膜16的旁边。毛细管内的电解液含有通过流体动力方法，或者借助其它一些手段注入毛细管中的不可透过细胞的分子19。这种情况下，补充的不可透过细胞的分子19激活细胞器官17上的受体20。当通过向毛细管电极的入口端施加正电压，施加渗透场时，电解液中所含的分子将借助电泳和电渗移向毛细管电极的出口端。由于选择的电场强度强到足以穿透细胞膜，补充到电极中所含电解液中的不可透过细胞的分子将通过在细胞膜中形成的小孔21，并可，例如激活细胞器官上的受体，如图4B中所示。由于选择的电场强度强到足以穿透细胞膜，补充到电极中所含电解液中的不可透过细胞的分子将通过在细胞膜中形成的小孔，并可，例如激活细胞器官上的受体。类似种类的，但是尺寸较小的电极可用于细胞器官的电造孔。
如果在体内执行根据本发明的方法，可利用外科显微镜，以便观察细胞结构。此外，还可利用定向装置(stereotactic device)对电极定位。当在体内执行本发明的方法时，当然不可能把细胞结构放置在具有缓冲剂的某些类型的容器中。相反，独立地通过导管，或者直接通过中空纤维电极，把要引入细胞结构中的化合物引入生理缓冲剂中。当使用中空纤维电极时，通过与注射器耦合的电极中的小通道把化合物引入细胞结构中，注射器由测微螺旋或微注入泵控制，以便能够引入精确体积的化合物。在电造孔发生的同时，或者稍后加入化合物的可能性使本技术非常有用。在选定细胞局部获得很高的浓度，并且由于较高的浓度梯度，化合物扩散进入细胞的速度将更快。其它一些优点是化合物的消耗较低，并使由清洗过程引起的问题降至最低。大多数时候，可预料到病灶(focal)给药，即药物或基因被直接引入致病细胞群中的给药远远优于腹腔给药，口服给药，静脉给药(intraventricular)，或者通常采用的任意其它类型的给药技术。利用根据本发明的方法，可实现体内细胞内药物-基因引入。由于电极的尺寸极小，同时施加的电压较低，因此预计组织损伤非常小。此外，电极的定位，以及随后的基因或药物输送非常精确。已表明约比根据本发明的方法中使用的电极大100倍的微渗析探头导致非常小的组织损伤和局部新陈代谢破坏。
借助根据本发明的方法，配合基因疗法使用，有可能“改编”基因；以使机能失调基因按正确方式起作用，或者赋予细胞新的功能。
这样，在用于由单个细胞或较小的细胞群的机能失调导致的不同疾病和病症，例如帕金森氏症和脑瘤的疗法和治疗中，可能使用根据本发明的方法，下面将进一步举例说明。
许多疾病将导致新陈代谢破坏，它们可能是通过遗传获得的，也可能不是通过遗传获得。例如，由Nigro纹状路径中的神经细胞的变性而引起的帕金森氏症导致在隔离的细胞群中产生多巴胺的生物化学机构机能失调。这本身又将导致动力行为(motorbehavioral)缺乏。帕金森氏症的标准治疗是口服多巴胺先驱体L-DOPA。或者，把具有产生多巴胺的神经细胞的移植组织移植到患者的头脑中。可利用和上面两个例子中说明的电造孔方法类似的电造孔方法，实现体内对适当脑部结构的细胞内药物或基因引入，并且这种细胞内药物或基因引入可用作治疗策略。
在相关的实验治疗的成功报告的同时，利用用于基因传递的遗传设计的病毒的脑瘤的实验治疗已被应用。使用病毒作为输送系统的局限性在于如果病毒变异，可能引起潜在的危险。把电造孔方法用于基因传递，例如和下面例子中描述的那些相类似的用于细胞素脱氨酶或腺嘧啶脱氧核苷激酶的“自毁基因”，消除了癌症治疗中对使用病毒输送系统的要求。
图5示意地表示了借助根据本发明的方法对脑瘤的治疗。把两个电极(最好至少一个电极是用于灌注，例如药物或基因的中空纤维电极)放置在人脑中的细胞结构中。可利用图中由笛卡尔坐标系统表示的立体(stereotactic)图谱，及定向微定位器实现电极的定位。借助注射器或者借助其它一些适当的装置，可如图所示实现灌注。可改变电极和施加电场的定位，以便对要求数目的细胞进行电造孔。
随后利用借助注射泵，或蠕动泵，或者包括电泳的其它任意类型的溶液泵送系统施加的流动，通过一个电极或两个电极中心中的狭窄通道，简单地把要电造孔进入细胞中的溶质引入细胞中。
一个特别感兴趣的可能性是使用用生物相容材料制成的使用电池供电的灌注／电造孔移植物，以便连续地把溶质引入细胞中。由于要求这样低的电位，因此可使用提供几伏到约20伏电压的电池。这些电池供电的电造孔器可做成很小，可包含在仅为几个平方毫米的芯片中。这样的系统可包括含有溶质的溶液贮存器，进行电造孔的两个电极，对输送计时并控制电造孔参数，即脉冲轮廓，脉冲持续时间，重复和幅度的电子电路，电池源，和贮存器再充填入口。
按照本发明使用的电极可具有任意适当形状和构形。它们可以是图1中图解说明的那种电极。它们还可以是，例如穿透要电造孔的结构的全长的一对或几对棒形电极。当电场被施加在这些棒形电极上时，受到电场作用的所有细胞将被电造孔。这为更高的周转率和更快速的治疗创造了条件。
当根据本发明的方法被用于把俘获的溶质输出细胞结构，即所谓的反向电造孔时，一些应用是对于单个细胞或较小的细胞群的药物输送。这样应用的目的是穿透细胞和细胞状结构，例如脂质体，以便从细胞和细胞状结构内向细胞外媒介物输送不可透过细胞的溶质。于是，溶质的浓度梯度具有相反的方向，即细胞结构内的溶质浓度高，细胞结构外的溶质浓度低。特别地，仅仅通过以前述相同方式放置的碳纤维微电极，在脂质体膜上施加DC电压脉冲，即可以受控方式排空具有俘获的溶质的脂质体，使之接近目标细胞。由电造孔引起的这种基于脂质体的药物输送可用于基础研究以及用于医药工业，例如，用于缓释成分。
另外，通过如前面关于利用电造孔向细胞内输入溶质所描述的那样施加电场，还可使细胞排出存在于它们的细胞质中的溶质。
在下面的例子中将进一步说明本发明，这些例子不会以任何方式限制本发明的范围。
例1．取自成熟老鼠大脑的先驱(progenitor)细胞的电造孔，以便加入荧光标记。
按照标准程序(T．D．Palmer，J．Ray，F．H．Gage，Mol．Cell．Neurosci．，6，474-486(1995))培养先驱细胞并将其涂敷到1号1英寸圆形盖片上，该盖片涂有聚D-鸟氨酸和拉迷林(lamilin)。使细胞维持原状过夜，以粘附在玻璃表面上。37℃下，在5％CO2，和95％空气的湿润气氛中培养细胞。为了电造孔，利用安装油脂把细胞皿安装在圆形低缘聚碳酸酯夹持物中。把带有盖片的聚碳酸酯夹持物安装在倒装显微镜(Leica DMIRB)的载物台上。细胞被保存在HEPE缓冲的盐水中，该盐水含有137mM NaCl，0．4mM MgCl2，0．64mMKH2PO4，3．0mM NaHCO3，0．41mM MgSO4，5．4mM KCl，20mMHEPES，1．26mM CaCl2和5．5mM D-葡萄糖(用NaOH把pH值调节到7．4)。该HEPE缓冲剂被补加以荧光素(钠盐，5μM)，一种高度带荧光的物质。
为了对细胞进行电造孔，把借助KCl(3M)的液体连接和细银线与电源相连的两个碳纤维微电极(Pro CFE，Axon Instruments，FosterCity，CA)放入细胞池中，电极尖端之间的距离约为15微米，细胞被放置在两个电极尖端间的中部。图3A中图解说明了这种配置。通过利用低电压脉冲发生器(数字定时刺激器(Digitimer Stimulator)，DS9A，UK)施加1比10(one-to-ten)直流电压脉冲实现细胞膜的电造孔，所述1比10直流电压脉冲在电极尖端上产生持续时间约1毫秒的0．5-1伏的膜电位。应注意如果需要，可采用不同的电压，持续时间，脉冲轮廓，以及交流电流。在电压脉冲的施加过程中，在细胞上产生高度集中的电场。该电场的存在通过小孔的形成导致细胞的穿透，并且溶质分子沿其浓度梯度向下扩散进入细胞中，如图3B中所示。在施加电脉冲之后，细胞膜孔被重新封闭，分析物被捕获在细胞内。最后，用HEPE缓冲溶液冲洗细胞皿。图3C中图解说明了最终的情况。
随后使用氩离子激光器(Spectra Physics model 2025-05，Sunnyvale，CA)，利用488纳米下荧光素的激发，在显微镜中观察细胞。发送该激光，使之通过488线干涉滤光器，干涉滤光器后布置有旋转式圆盘，以便破坏相干性，并散射激光。用透镜收集激光，并使之通过荧光素过滤立方体(Leica I-3)进入物镜，以激发荧光团。由同一物镜收集所得到的荧光，并由3-芯片彩色CCD相机(Panasonic)检测图象，并由超级VHS(Panasonic SVHS AG-5700)以25Hz帧收集速率记录该图象。从磁带把CCD图象数字化，并进行处理，以便显示。图6中表示了所得到的结果。图6A(彼此紧密接触的两个先驱细胞的亮场图象)中，在如上所述存在荧光素的情况下，上部的细胞被电造孔。如图6B中的荧光图象中所示，荧光唯一地局限于上面的细胞，同时荧光素实质上不溢出到相邻的细胞。这样，借助现有的电极和仪器，获得足以对单个细胞进行电造孔的空间分辨率是切实可行的。
例2．利用细胞外电极对来自成年老鼠大脑的先驱细胞中的细胞内器官的电造孔。
重复例1的实验准备，以便对单个先驱细胞中的细胞器官进行原位电造孔。具体地说，借助在细胞膜上导致1．6V±0．07V的电位漂移(范围1．5-2．4V)的10个0．5Hz超阈场施加，把荧光素引入单个细胞中，并与在0．5-1．0V的低膜电位下被电造孔的细胞进行比较。在电造孔之后，用Hank Hepes溶液替换含有染料的细胞外媒介物。图7A中表示了高电压下电造孔的结果，其中在细胞质外核区域观察到加强(punctuate)荧光，而在含有较少数目的细胞器官的核区域中没有观察到加强荧光。总计，以这种规程电造孔的20个细胞中的18个细胞显示出相似的染色图案，利用特定的细胞器官染料，例如标记细胞器官的线粒体部分的若丹明123，观察到这种染色图案。比较而言，在原生质膜阈电位下被电造孔的细胞通常显示来自胞液中捕获的荧光素的漫射荧光，如图7B中所示。低电场强度和高电场强度的荧光素比较施加的这种差异局部化观察结果，和由于细胞内器官的尺寸较小，如背景技术中给出的等式1预测的细胞内器官的更高的击穿电位是一致的。已证明和10毫米直径的细胞相比，孤立线粒体的电造孔和融合需要2．5-10倍更高的电场强度。结果也和遵循轻度、中度和重度电造孔规程在巨大的鱿鱼神经轴突中的形态观察结果一致。
权利要求
1．一种用于穿透包括单个细胞，细胞内结构或细胞器官的细胞结构的方法，其特征在于包括下述步骤(a)提供微电极；(b)把微电极和电源相连；(c)以适当的电极间距离，把由高分度微操作器单独控制的电极放置在细胞结构的附近；(d)在电极之间施加强度足以实现电造孔的高度集中的电场。
2．按照权利要求1所述的方法，其中所述细胞结构是细胞内结构或细胞内器官，所述微电极被布置成电极末端被放置在含有该细胞结构的细胞内。
3．按照权利要求1或2所述的方法，其中使用两个电极。
4．按照权利要求1-3任一所述的方法，其中电源在细胞结构的膜处产生10毫伏-100伏的电压。
5．按照权利要求1-4任一所述的方法，其中电极间距离小于10毫米。
6．按照权利要求5所述的方法，其中电极间距离小于100微米。
7．按照权利要求1-6任一所述的方法，其中最接近细胞结构的电极的端部的直径为几纳米到几微米。
8．按照权利要求1-7任一所述的方法，其中借助矩形直流电压脉冲获得步骤(b)中施加的电场。
9．按照权利要求8所述的方法，其中脉冲长度为0．1微秒-几分钟。
10．按照权利要求1-9任一所述的方法，其中利用显微镜，至少一个微定位器，和/或立体(stereotactic)器件定位电极。
11．按照权利要求1-10任一所述的方法，其中通过借助电造孔在细胞结构中形成的小孔，输送不可透过细胞的溶质。
12．按照权利要求11所述的方法，其中在电造孔之前，溶质包含在细胞外媒介质中。
13．按照权利要求11所述的方法，其中在电造孔之前，溶质包含在细胞结构中俘获的媒介质中。
14．按照权利要求13所述的方法，其中俘获的溶质包括药活性化合物。
15．按照权利要求11-14任一所述的方法，其中用于溶解溶质的媒介质是生理缓冲剂。
16．按照权利要求11-15任一所述的方法，其中利用导液管把包含溶质的媒介质输入细胞结构中。
17．按照权利要求1-16任一所述的方法，其中至少一个电极是碳纤维电极。
18．按照权利要求1-16任一所述的方法，其中至少一个电极是中空的电极。
19．按照权利要求18所述的方法，其中电造孔所需的电流由电极内的电解液输送。
20．按照权利要求17或18所述的方法，其中通过中空的纤维电极，把包含溶质的媒介质输入细胞结构中。
21．按照权利要求20所述的方法，其中通过电泳或电渗，把溶质输入细胞结构中。
22．按照权利要求18-21任一所述的方法，其中所述中空电极是熔融的二氧化硅电极。
23．按照权利要求1-22任一所述的方法，其中细胞结构是脂质体。
24．按照权利要求1-23任一所述的方法的引入药物的应用。
25．按照权利要求1-23任一所述的方法的引入基因的应用。
26．按照权利要求1-23任一所述的方法的引入生物化学标记和染料的应用。
27．按照权利要求1-23任一所述的方法的引入纳米微粒的应用。
28．按照权利要求1-23任一所述的方法在生物传感器应用中的应用。
29．按照权利要求28所述的应用，配合化学分离的应用。
30．按照权利要求1-23任一所述的方法在肿瘤治疗中的应用。
31．按照权利要求1-23任一所述的方法在慢性神经生成(neurodegenerative)疾病，例如帕金森症和Alzheimer症治疗方面的应用。
32．按照权利要求1-23任一所述的方法用于研究细胞迁移，增殖，生长，变异生物化学和／或生物物理的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于穿透包括单个细胞,细胞内结构或细胞器官的细胞结构的方法,包括下述步骤:(a)提供微电极,最好是两个碳纤维电极或中空的纤维电极;(b)把微电极和电源相连;(c)在适当的电极间距离的情况下,把由高分度微操作器单独控制的电极放置在细胞结构的附近;(d)在电极之间施加强度足以实现电造孔的高度集中的电场。该方法可用于把不可透过细胞的溶质,例如药物或基因转移到细胞结构中,或者转移到细胞结构外,可用在生物传感器,可用于肿瘤和神经生成疾病的治疗,及生物物理过程的研究。
文档编号A61N1/32GK1280513SQ9881161
公开日2001年1月17日 申请日期1998年11月6日 优先权日1997年11月6日
发明者乌韦·奥尔瓦尔, 安德斯·伦德奎斯特, 比德·埃里克森, 丹尼尔·邱 申请人:A+科学投资股份公司