专利名称：p53+肿瘤细胞的选择性杀伤和诊断的制作方法
技术领域：
本发明属于癌症领域，描述了表现p53肿瘤抑制活性但缺乏错配修复酶活性的肿瘤细胞的病毒治疗和诊断。
背景技术：
据信由生长限制性肿瘤抑制基因平衡的生长促进性原癌基因调节正常细胞的增殖。增强原癌基因活性的突变产生使肿瘤细胞生长的致癌基因。相反地，使肿瘤抑制基因失活的基因损伤，通常经过导致形成与失活的肿瘤抑制等位基因的纯合的细胞的突变，能够使细胞从这些基因设置的正常复制限制中释放出来。通常，失活的肿瘤抑制基因(例如，p53、RB、DCC、NF-1)结合活化的致癌基因(即，含有活化结构或调控突变的原癌基因)的形成能够产生一种能够基本上不受限制生长的肿瘤细胞(即转化细胞)。
细胞的致癌基因转化导致细胞代谢、生理、和形态学的一些改变。致癌基因转化细胞的一个特征性改变是失去对细胞生长调节基因的适当表达形成的细胞正常增殖和分化的限制的响应性。
虽然不同类型的遗传学改变都可能导致细胞生长调节基因表达或功能的改变，并导致异常生长，通常认为需要一种以上的条件才能导致从正常细胞到恶性细胞的肿瘤转化(Land等，1983，自然，304596；WeinbergRA，1989，癌症研究(Cancer Res．)493713)。对于大多数细胞类型，导致恶性转化的准确分子途径和二级改变还不清楚。曾报道很多情况下，具有推定的细胞循环控制功能和／或涉及功能性转录复合物形成(如p53和RB)的一些蛋白质表达或活性的改变可以导致细胞中增殖控制的丧失(Ullrich等，1992，生物化学杂志，26715259；Hollstein等，1991，科学，25349；Sager R，1992，当前细胞生物学观点(Curr．Opin．Cell．Biol．)4155；Levine等，1991，自然，351453)。
已经发现在某些癌症的重要部分中，一些致癌基因具有特征性活化突变。例如，rasH和rasK编码区中的特定突变(例如，密码子12、密码子61；Parada等，1984，自然，312649)与培养细胞的致癌基因转化有关，并存在于惊人百分率的特定人癌中(例如，结肠腺癌、膀胱癌、肺癌和腺癌、肝癌)。这些发现导致特异性识别这些致癌基因活性形式的诊断和治疗试剂(例如，多核苷酸探针和抗体)的发展(美国专利4798787和美国专利4762706)。
其它致癌基因，例如myc，erbB-2和pim-1的过量或不适当表达看起来能够加强致癌基因转化，而不必须需要编码区出现活化突变。通常在乳房、胃、和卵巢腺癌中发现erbB-2的过度表达，这些细胞类型中erbB-2的水平可以作为肿瘤形成的诊断标记，和／或可能与特定肿瘤表型相关(例如，对特定药物的抗性、生长速率、分化状况)。
已经报道带有各种致癌基因(美国专利4736866和美国专利5087571)或功能性破坏的肿瘤抑制基因(Donehower等，1992，自然，356215)的转基因动物用于致癌物质的筛选分析，以及其它潜在应用。
尽管在形成较为明确的转化表型和肿瘤形成的分子机制模型方面取得了进展，但很少得到超过传统化疗的用于治疗癌症的有效的治疗方法。一些传统化疗药物的治疗指数较低，治疗剂量水平为或接近产生毒性的剂量水平。大多数传统化疗药物的毒性副作用不令人满意，并导致威胁生命的骨髓抑制以及其它副作用。
最近尝试进行校正或补充导致先天性疾病(例如囊性纤维化)的缺陷性等位基因的基因治疗研究，并报道取得有限的初步成功。一些基因治疗研究涉及利用复制-缺陷重组腺病毒将一种能够表达缺陷等位基因功能性拷贝的多核苷酸序列在体内转导到细胞中(Rosenfeld等，1992，细胞，68143)。这些基因治疗方法中的一些能够有效地将多核苷酸转导到从患者体内移植出来的分离细胞中，但没有显示在体内高度有效。依赖用编码肿瘤坏死因子(TNF)和白介素-2(IL-2)的多核苷酸转染移出的肿瘤细胞的癌症治疗研究也有报道(Pardoll D，1992，当前肿瘤学观点(Curr．Opin．Oncol．)41124)。
虽然某一天可能证明基因治疗方法适合于在体内纠正转化细胞中致癌基因或肿瘤抑制基因的缺陷性等位基因，目前的基因治疗方法还没有报道肿瘤的实践性原位基因治疗能够有效地转导或正确靶向(例如通过同源重组)足够百分率的肿瘤细胞。
癌症生物学的性质要求，有效治疗效果为消除肿瘤细胞的实质部分，优选转化细胞的所有克隆后代。而且，目前的基因治疗方法非常昂贵，需要离体培养移出的细胞，然后再导入患者。该方法即使有效，但其广泛应用的限制将是费用昂贵。
因此，本领域需要诊断和治疗肿瘤疾病的方法和组合物，尤其是选择性消除肿瘤细胞而无传统抗肿瘤化疗典型的不期望的非肿瘤细胞杀伤作用。
在这点上，发明人最近报道的突变腺病毒对缺乏肿瘤抑制基因p53的肿瘤细胞的选择性杀伤作用尤其值得注意。参见，美国专利5677178和Bischoff，J．R．等，科学，274卷，373-376页(1996)。通过利用突变腺病毒的分化能力在肿瘤细胞中而不是非肿瘤细胞复制和溶解肿瘤细胞，实现选择性杀伤。更具体地说，已显示某些复制-缺陷重组腺病毒，尤其是E1b功能(E1b-)缺陷的腺病毒能够在缺乏p53肿瘤抑制功能的肿瘤细胞中表现复制表型，并能够有效地杀死这些细胞。还显示含有正常p53功能的非肿瘤细胞相对地对复制缺陷重组腺病毒的杀伤作用具有抗性。
目前已经报道，存在一种群表现p53的肿瘤细胞，它们也可以被突变E1b-腺病毒杀死。Heise，C．等，天然药物(Nature Medicine)3卷，639-645页(1997)。在这些肿瘤细胞中促进E1b-杀伤的遗传诱因还不清楚。因此使一个将要处方治疗癌症患者的医生拥有一种判定患者的肿瘤是否由易于被突变E1b-腺病毒杀伤的p53+细胞组成的方法特别有利。
提供本文涉及的参考文献主要为其在本申请申请日之前的公开内容。本文中没有什么将被解释为不允许本发明人通过先发明而提前该公开的日期承诺。
发明概述本发明提供了利用缺乏能够结合功能性p53肿瘤抑制基因产物的表达的病毒癌蛋白质的重组复制缺陷腺病毒诊断和／或消除表现肿瘤抑制基因p53的肿瘤细胞，而对非肿瘤细胞很少或没有影响的新方法和组合物。肿瘤细胞以尚不清楚的方式显示，由于缺乏或基本上降低了错配修复活性(通过这些细胞支持病毒复制的能力评价)而降低了p53功能。本发明的腺病毒构建体在肿瘤细胞和非肿瘤细胞中复制表型的差异提供了癌症的病毒基治疗的生物学基础。腺病毒致细胞病变效应的表达与腺病毒复制表型有关，该复制表型代表本发明的重组腺病毒构建体感染肿瘤细胞，因此区别肿瘤细胞和非肿瘤细胞，并提供肿瘤细胞的选择性细胞毒作用。虽然本发明具体针对腺病毒构建体详细描述，但认为本发明将应用到基本上所有病毒类型，其中有效复制需要结合／或螯合和／或灭活存在于非肿瘤细胞但在肿瘤细胞中基本上缺乏或无功能的宿主细胞蛋白质(例如，p53)。
为了使腺病毒在细胞中有效复制，腺病毒E1b基因产物，p55，与宿主细胞p53蛋白质形成复合物，从而螯合和／或灭活p53并产生p53功能缺陷的细胞。后者还在缺乏或基本上无错配修复活性的p53+细胞中出现。该使p53功能缺陷的细胞能够支持腺病毒的复制。这样，野生型腺病毒能够在含有p53的细胞中复制，因为腺病毒p55蛋白质灭活和／或螯合宿主细胞的p53蛋白质。
如上所述，错配修复活性的缺乏或丧失有效地产生p53阳性肿瘤细胞，其失去p53介导的废除病毒复制的功能。因此该细胞易于被本发明的病毒杀死。
在本发明的一个实施方案中，将含有编码突变p55蛋白质(基本上不能与感染细胞中的p53蛋白质形成功能复合物)的E1b基因座的重组腺病毒给含有能够被重组腺病毒感染的肿瘤细胞的个体或细胞群给药。在感染的非肿瘤细胞中重组腺病毒基本上不能有效螯合p53蛋白质，其导致导入的重组腺病毒多核苷酸不能在非肿瘤细胞中表达复制表型。相比较而言，缺乏功能性p53蛋白质的肿瘤细胞支持导入的重组腺病毒复制表型的表达，其由于腺病毒的致细胞病变效应和／或与复制表型相连的阴性选择基因的表达导致肿瘤细胞的消除。在这些实施方案的优选改变中，重组腺病毒包括编码基本上不能结合p53的突变p55的E1b基因座，并且还可以任选缺乏功能性p19蛋白质(即，不能抑制腺病毒早期区基因在E1a多肽存在下的表达)。本发明的重组腺病毒可以进一步含有突变p19基因，其产生增强的致细胞病变效应；本领域已知的该突变是p19 cyt突变基因。然而，在某些突变体中可以优选保留功能性p19，以维持感染过程中病毒DNA的完整性。
本发明提供了重组腺病毒构建体，它在非肿瘤细胞中为复制缺陷型，但能够在缺乏功能性p53的肿瘤细胞中表达复制表型。该新的重组腺病毒构建体包括一种突变，例如在E1b基因区，特别是在编码E1b p55蛋白质的序列中的缺失或点突变。
本发明还提供了重组乳多空病毒，例如人乳头瘤病毒(HPV)、多瘤病毒属(例如，BK，JC)和SV40，它们缺乏结合和／或灭活p53的功能性蛋白质。缺乏功能性E6蛋白质表达的人乳头瘤病毒突变体基本上缺乏有效降解p53的能力，因此将能够在p53(-)细胞中但不能在含有有效水平的功能性p53细胞中表现复制表型。
本发明还提供了治疗肿瘤疾病的新方法，包括以下步骤给患者给药能够在肿瘤细胞群中优先表达复制表型和／或表达致细胞病变效应(与在非肿瘤细胞群中的表达相比)的重组病毒。
附图简述
图1表示不同感染复数(moi)的dl 1520或野生型腺病毒在p53+细胞系HCT 116(MMR-)和HCT 116+chr3(MMR+)上的致细胞病变效应。
图2表示不同moi的dl 1520或野生型腺病毒感染细胞系HCT 116(MMR-)，HCT 116+chr3(MMR+)，和HCT 116+chr3 rev．(MMR-)后产生的噬斑形成单位(pfu)。
定义除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。虽然类似于或等同于本文描述的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但优选的方法和材料是所述的那些。对本发明来说，下列术语如下定义。
本文中用于修饰对象的术语“自然发生的”指可以在自然界中发现一种对象的事实。例如，存在于有机体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列，其可以从天然来源分离出来，还没有经过人类在试验室有目的的修饰，即为自然发生的。如本文中的应用，术语“重组”指部分经人类有意识的修饰产生的多核苷酸构建体(例如，和腺病毒基因组)。
如本文使用的术语“复制缺陷病毒”指在预先确定的(例如基本上缺乏p53的细胞)，支持病毒复制表型表达的细胞群中优先抑制细胞增殖或诱导细胞凋亡的病毒，其基本上不能在含有正常p53水平，代表非复制、非转化细胞的细胞中抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，或表达复制表型。典型地，复制缺陷病毒对含有正常p53功能的细胞表现基本上降低的噬斑效能。
如本文所用，错配修复活性(MMR)指涉及识别和修补在DNA的复制、重组、或化学修饰过程中由各种机制引起的基因组中碱基对错配和单链插入／缺失环(ILP)的蛋白质系统。
MMR活性的丧失可以通过很多机制发生，包括编码蛋白质的基因所在的染色体的丢失，基因突变，相关酶的降解等。
如本文所用，术语“p53功能”指具有基本上正常水平的p53基因编码的多肽的性质(即，相对于同样组织学类型的非肿瘤细胞)，其中p53多肽能够结合野生型腺病毒2或5的E1b p55蛋白质。例如，通过产生p53的灭活(即，突变)型或通过p53多肽表达的基本降低或总体丧失可以使p53功能丧失。另外，p53功能可以在含有编码野生型p53蛋白质的p53等位基因的肿瘤细胞中基本上缺乏；例如，p53基因座之外的基因改变，例如导致p53异常亚细胞加工或定位的突变(例如，导致p53主要定位在细胞质而不是细胞核的突变)可以导致p53功能的丧失。
在某些情况下，当肿瘤细胞表现野生型p53蛋白质，并且该细胞被本发明的病毒消除时，则这可以通过改变影响表达与p53有关的部分或全部活性或对该表达必须的细胞成分的改变实现。本发明的关键方面是使其得以发生的一种方式，例如，当肿瘤细胞是缺陷的或缺乏，错配修复(MMR)酶活性的实现。参见，Anthoney，D．A．，等，癌症研究，第56卷，1374-1381页(1996)；和Drummond，J．T．，等，生物化学杂志，第271卷，19645-19648页(1996)。因此，应当期望某些肿瘤细胞将表现正常的野生型p53功能，当病毒缺乏E1b p55时支持腺病毒复制，因为细胞缺乏或基本上无错配修复活性。事实上，已经表明错配修复和p53途径在生化上相连。参见，Drummond，J．T．，等，生物化学杂志，第271卷，19645-19648页(1996)。
如本文所用，术语“复制表型”指一种或多种下列表型，代表病毒例如复制缺陷腺病毒感染的细胞(1)晚期基因产物的基本上表达，例如衣壳蛋白(例如，腺病毒五邻体基片多肽)或由病毒晚期基因启动子引发的RNA转录，(2)病毒基因组的复制或复制中间体的形成，(3)病毒衣壳的组装或病毒体颗粒的包装，(4)致细胞病变效应(CPE)在感染细胞中的出现，(5)病毒裂解周期的完成，和(6)其它表型改变，它通常依编码功能性癌蛋白质的野生型复制DNA病毒感染的非肿瘤细胞中p53的消除而定。复制表型包括至少一种列出的表型特征，优选一种以上的表型特征。
术语“抗肿瘤复制缺陷病毒”在本文中用来指重组病毒，其具有通过对感染的肿瘤细胞(相对于同样组织学细胞类型的感染的非复制、非肿瘤细胞)优先细胞杀伤，抑制人类肿瘤发展或进行的功能特征。
如本文所用，“肿瘤细胞”和“肿瘤形成”指表现相对自主生长的细胞，以至于它们表现一种特征在于明显丧失细胞增殖控制的异常生长表型。肿瘤细胞包括活性复制状态或暂时非复制静息状态(G1或G0)的细胞；类似地，肿瘤细胞可以包括具有良好分化表型、贫乏分化表型、或两种类型混合的细胞。因此，在特定时间点上，不是所有肿瘤细胞都必须是复制细胞。定义为肿瘤细胞的集合由良性肿瘤细胞和恶性(或症状明显的)肿瘤细胞组成。或症状明显的肿瘤细胞经常被称为癌症(cancer)，如果起始于内胚层或外胚层组织来源的细胞，通常被称为癌(carcinoma)，如果起始于中胚层来源的细胞类型则被称为肉瘤。
如本文所用，术语“有效地连接”指存在功能关系的多核苷酸元件的连接。如果核酸与另一个核酸序列置于功能关系，则该核酸是“有效地连接”。例如，如果启动子或增强子影响了编码序列的转录，则该启动子或增强子有效地与编码序列连接。有效地连接意味着被连接的DNA序列通常是邻近的，如果需要连接两个蛋白质的编码区，靠近或在读码框内。然而，因为增强子通常在距启动子几千碱基的位置发挥功能，并且内含子序列长度可变，一些多核苷酸元件可以有效连接但不相邻。
如本文所用，“生理条件”指离子强度、pH、和温度基本上类似于完好哺乳动物细胞中，或活哺乳动物组织空间或器官中条件的液体环境。典型地，生理条件包括约150mM NaCl(或任选KCl)，pH6．5-8．1，和温度约20-45℃的水溶液。通常，生理条件是生物大分子的分子间相关的合适结合条件。例如，150mM NaCl，pH 7．4，37℃的生理条件普遍适用。
发明详述下面论述中参考的所有科学或专利文献意在指示这些参考文献以其全文并入，不管是否有对该作用的清楚陈述。
通常，下文使用的术语和下面描述的细胞培养、分子遗传学、和分子病毒学的试验室程序是本领域公知和常规使用的。重组核酸法、多核苷酸合成、多肽合成、病毒原种的产生和增殖(包括能够与复制缺陷病毒原种反向互补的细胞系)、细胞培养等使用标准技术。一般的酶反应和纯化步骤按照生产商的说明进行操作。方法和步骤一般地按照本领域常规方法和各种普遍参考文件进行(一般性地参见，Sambrook等，分子克隆试验室手册，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N．Y．；病毒学，第2版，Fields BN和Knipe DM(1990)Raven Press，New York，NY，以参考文献引入本发明)，其通过这篇文献提供。认为其中的程序是本领域公知的，为了方便读者而提供。其中包括的所有信息通过参考文件插入本文。
肿瘤形成是一种病理状况，其特征部分在于变异基因型和表现型肿瘤细胞的产生。一些肿瘤细胞可能缺乏p53功能；这些细胞被称为p53(-)。还有一些肿瘤细胞可以含有基本上正常水平的p53(p53+)；这些具有正常p53的细胞可以缺乏其它癌蛋白质(例如，除了p53之外的其它肿瘤抑制基因产物，即RB)，这可以为能够在肿瘤细胞中优先表现复制表型的抗该肿瘤的病毒构造物提供基础。
本发明的基础在于感染哺乳动物细胞的几种DNA病毒(例如，腺病毒；乳多空病毒例如BK和JC，SV40，和乳头瘤病毒例如HPV等)编码对于病毒复制周期的有效进行十分关键的病毒蛋白质，这些病毒蛋白质中的一些螯合细胞蛋白质，例如涉及细胞周期控制和／或转录复合物形成的那些蛋白质，作为有效病毒复制的必要条件。在缺乏结合、螯合、或降解p53的病毒蛋白质中，病毒复制基本上被抑制。用缺乏螯合或降解p53能力的突变病毒感染的正常(即非肿瘤)细胞通常不能支持突变病毒的复制，因此认为该突变病毒是复制缺乏的(或者复制缺陷的)。然而，因为p53的螯合或降解对于病毒在缺乏功能性p53的细胞(该细胞被称为p53(-))中的复制不是必须的，因此p53螯合或降解缺陷的复制缺陷突变病毒能够在该p53(-)细胞中以超过在具有基本上正常p53功能的细胞中的更大程度表达复制表型。肿瘤细胞经常缺乏p53功能(p53(-)细胞)。因此，一些复制缺陷病毒突变体可以在肿瘤细胞中优先表现复制表型。
缺乏表达功能性p53灭活蛋白质(例如，腺病毒E1b p55，HPV E6蛋白质)能力的病毒突变体将在p53(-)细胞中表现复制表型。因此与复制表型的表达相连的细胞毒性可以作为优先杀死具有p53(-)表型的肿瘤细胞的基础。虽然一些复制非肿瘤细胞可以在细胞周期的进程中短暂表现p53(-)表型，可以使用本发明的病毒突变体优先，尽管不需要完全选择性，杀死肿瘤细胞，由此构成了一个有用的，可以单独使用，也可以与其它治疗形式组合使用的抗肿瘤治疗形式。
虽然下面提供的方法和组合物是对涉及复制缺陷腺病毒构建体方法的具体描述，但认为可以用其它编码螯合p53蛋白质或增强p53蛋白质降解的癌蛋白质的DNA病毒实现本发明，例如在E6包含突变的复制缺陷乳头瘤病毒种(例如，HPV 16、18、33型突变体)，其基本上消除了p53。除了腺病毒科家族的成员(具体为乳腺腺病毒属)，认为编码螯合和／或灭活p53的病毒蛋白质的乳多空病毒科家族的成员(具体为乳头瘤病毒和多瘤病毒)适用于本发明的方法。
对于腺病毒和乳多空病毒生物学的一般性描述(病毒学，第二版，Fields BN和Knipe DM编，第2卷，1651-1740页，Raven Press，New York，NY，经以参考文献形式并入本文)可以作为指导引用。下面具体描述指，但不限于，腺病毒血清型5和腺病毒血清型2。腺病毒型2为E1b病毒基因区和其它病毒基因区的编号规则提供了方便的参考。认为本领域技术人员将会容易地鉴定其它腺病毒血清型中的相应位置。涉及人乳头瘤病毒的参考文献通常指与肿瘤形成有关的型(例如，型16、18或33)，尽管也可以使用非致瘤基因型。E1b突变体细胞磷蛋白质p53的功能是抑制哺乳动物细胞细胞周期的进行。野生型腺病毒E1b p55蛋白质在具有p53的感染细胞中结合p53，产生基本上灭活的p53功能，好象在灭活型中螯合p53。功能性E1b p55蛋白质对于腺病毒在含有功能性p53细胞中的有效复制是必需的。因此，基本上缺乏结合p53能力的腺病毒变异体在具有正常水平功能性p53的非复制、非肿瘤细胞中是复制缺陷的。
人肿瘤细胞通常是对突变(例如，取代、删除、移码突变物)p53等位基因的纯合的或杂合的，其缺乏正常控制细胞周期必须的p53功能(Hollstein等(1991)科学，25349；Levine等(1991)op．cit．，以参考文献插入本文)。因此，许多肿瘤细胞是p53(-)，因为它们缺乏足够水平的p53蛋白质和／或因为它们表达不能发挥基本p53功能的p53突变型，这可以基本上减小p53的功能，甚至当存在野生型p53时(例如，通过抑制功能性多聚体的形成)。一些肿瘤细胞可以含有编码基本上为野生型p53蛋白质的等位基因，但可以含有基本上消除p53功能的第二位点突变，例如导致p53蛋白质定位于细胞质而不是细胞核中的突变；该第二位点突变也基本上缺乏p53功能。
认为缺乏复合p53能力但基本上保留其它关键病毒复制功能的复制缺陷腺病毒种将在p53功能缺陷(例如，基本上缺失p53等位基因纯合细胞，含有基本上无功能的突变p53蛋白质的细胞，表现野生型p53但缺陷、或缺乏错配修复(MMR)活性的细胞)细胞中表现复制表型，但基本上不在非复制、非肿瘤细胞中表现复制表型。该复制缺陷腺病毒种为了方面在本文中被称为E1b-p53(-)复制缺陷腺病毒。
含有缺乏p53功能的肿瘤细胞亚群和表达基本上正常p53功能的非肿瘤细胞亚群的细胞群(例如混合的细胞培养物或人癌症患者)可以在感染条件下(即适合腺病毒感染细胞群的条件，典型地为生理条件)与含有感染剂量E1b-p53(-)复制缺陷腺病毒的组合物接触。该接触导致细胞群感染E1b-p53(-)复制缺陷腺病毒。该感染在包括缺乏p53功能的肿瘤细胞亚群的有效细胞部分中产生复制表型的优先表达，但不在具有基本上正常p53功能的非肿瘤细胞亚群中产生复制表型的实质表达。复制表型在感染的p53(-)细胞中的表达导致细胞死亡，例如通过致细胞病变效应(CPE)、细胞裂解作用、凋亡等，导致从细胞群中选择性消除肿瘤p53(-)细胞。
典型地，适合于选择性杀伤p53(-)肿瘤细胞的E1b-p53(-)复制缺陷腺病毒构建体含有有效灭活E1b p55多肽结合p53蛋白质的能力的突变(例如，缺失、取代、移码)。该灭活突变典型地发生在结合p53的p55区。任选地，突变E1b区可以编码和表达由E1b区其余部分编码的功能性p19蛋白质，它在缺乏E1a多肽的情况下发挥反式激活腺病毒早期基因的功能。
用于本发明方法和组合物的合适E1b-p53(-)复制缺陷腺病毒构建体包括，但不限于下列实例(1)腺病毒2型dl 1520，它含有在2022位核苷酸上C到T的突变，其在用于起始p55蛋白质转录的AUG密码子的3个氨基酸下游产生终止密码子，以及在核苷酸2496到3336位间的删除替换为较小的连接插入物，其在核苷酸3336位产生第二个终止密码子；p19蛋白质的表达基本上不受影响(Barker和Berk(1987)病毒学，156107，以参考文件形式插入本文)；(2)一种复合腺病毒构建体，包括至少含有2022位突变和／或2496-3323缺失突变，或其基本部分，以及另外一种在p19中的产生p19 cyt突变体的突变的腺病毒2型dl 1520；该组合病毒构建体缺乏p55并具有P19 cyt突变的增强的致细胞病变效应。Ad2 dl 1520由A．Berk博士提供，Los Angeles，CA的California大学，并在文献中描述，包括Barker和Berk(1987)病毒学156107，以参考文献形式并入本文。
优选在该腺病毒构建体中引入其它突变，以抑制肿瘤细胞中感染病毒颗粒的形成，否则其将会支持E1b-p53(-)突变体的复制。该附加的灭活突变在治疗形式中应当是优选的，其中形成能够扩散到和感染邻近细胞的感染病毒颗粒的完全病毒复制是不期望的。这种完全灭活突变体被称为非复制E1b-p53(-)突变体。该非复制突变体包括甚至在p53(-)RB(-)细胞中也能防止感染病毒颗粒形成的突变体；该突变典型地是基本病毒颗粒蛋白质或蛋白酶中的结构突变。
然而，在许多用药程式中，理想的突变病毒是可复制的，并形成含有突变病毒基因组的可以扩散并感染其它细胞的感染病毒颗粒，从而增强起始剂量的突变病毒的抗肿瘤活性。
其它缺乏结合p53能力的E1b(-)突变体可以由本领域技术人员通过以下方式产生在编码p55多肽的E1b基因区产生突变，表达突变体p55多肽，使突变p55多肽与p53或p53的结合片段在含水的结合条件下接触，然后鉴定不能特异性结合p53的突变型E1b多肽作为适用于本发明的候选E1b(-)突变体。
更典型地，将用一种功能性检测法鉴定候选E1b(-)突变体。例如，基本上如Frebourg等((1992)癌症研究526977，以参考文献形式并入本文)的描述进行Friend检测，用于确定p53的功能。缺乏灭活p53能力的E1b突变体将被鉴定为候选E1b(-)复制缺陷突变体。
很多E1b突变的腺病毒可以应用于本发明。1996年12月31日提交的流水号为60／034616的美国专利申请中描述了其中几种。E1a／E1b双突变成视网膜细胞瘤肿瘤抑制基因(RB)基因功能的丧失与很多类型的肿瘤病因学有关。一些人肿瘤细胞既缺乏p53功能又缺乏RB功能，或者经突变灭活或者缺失一种或两种蛋白质种类。这类细胞被称为p53(-)RB(-)细胞。
认为缺乏结合p53能力并且还缺乏结合RB能力，但基本上保留了其它基本病毒复制功能的复制缺陷腺病毒种将在p53(-)RB(-)细胞中优先表现复制表型。还将在p53+但缺乏错配修复活性或错配修复活性缺陷的肿瘤细胞中表现复制表型。为了方便该复制缺陷腺病毒种在本文中被称为E1a-RB(-)／E1b-p53(-)复制缺陷腺病毒，或者简单地称为E1a／E1b双重突变体。该E1a／E1b双重突变体可以如美国专利5677178(以参考文献形式并入本文)所述构建。阴性选择病毒构建体虽然腺病毒复制表型在感染细胞中的表达与病毒诱导的细胞毒性，通常为细胞裂解、致细胞病变效应(CPE)、细胞凋亡、或其它细胞死亡机制相互关联，但增强抗肿瘤治疗中应用的重组腺病毒的细胞毒性通常是优选的。可以采用下列方式增强细胞毒性，包括重组腺病毒中的阴性选择基因，典型地有效连接于在表达复制表型的细胞中表现阳性转录调节的腺病毒启动子上。参见，美国专利5677178。例如，HSV tk基因盒可以有效连接于复制缺陷腺病毒E3启动子的立即下游。通常，删除腺病毒基因组的非实质部分(即，对于病毒复制和包装)以适应阴性选择性盒是可取的；因此可以删除E3基因区的实质部分，然后替换为有效连接于E2启动子(和增强子)或其它适当启动子／增强子的阴性选择性盒例如HSV tk基因。或者，阴性选择性基因可以有效连接于腺病毒晚期区启动子，以使阴性选择基因产物在表达特征在于从晚期基因启动子开始转录的复制表型的细胞中有效表达。
HSV tk基因在细胞中的表达不直接对细胞产生毒性，除非细胞暴露于阴性选择性试剂例如甘西洛维(gancyclovir)或FIAU。基中基本上表达阴性选择性基因的表达复制表型的感染细胞可以基本上不产生其它的细胞毒性，直到在有效的选择性剂量的阴性选择性试剂(例如甘西洛维)给药，此时表达tk基因的感染细胞将被选择性消除；因此阴性选择可以用于增强细胞致病性杀伤和／或通过杀伤表现复制表型的细胞进一步减弱病毒复制。
一个优选实施方案是有效连接于具有形成tk表达盒的聚腺苷化(polydenylation)位点的Ad5 NT dl1110的E2启动子或可替换的启动子和／或增强子(例如，主要晚期启动子，E1a启动子／增强子、E1b启动子／增强子)的HSV tk基因盒(zjilstra等(1989)，自然342435；Mansour等(1988)自然336348；Johnson等(1989)科学2451234；Adair等(1989)美国国家科学院院刊(Proc．Natl．Acad．Sci．)864574；Capecchi，M．(1989)科学2441288，以参考文献形式并入本文)。tk表达盒(或其它阴性选择性表达盒)插入腺病毒基因组，例如，取代基本上删除的E3基因。
其它有益地适用于本发明病毒颗粒的阴性选择性基因是胞嘧啶脱氨酶。美国专利5358866对其有描述，该文献以参考文献形式并入本文。诊断和体外应用本发明的复制缺陷腺病毒可以用于检测是p53+但缺乏p53功能的细胞的存在。
本发明特别值得注意的诊断应用是应用E1b突变病毒颗粒治疗表现正常水平野生型p53但缺乏错配修复酶活性的肿瘤细胞。因此，如果患者的肿瘤表现正常p53水平，很可能病毒的消除作用源于错配修复活性的缺乏。然后该结果可以用于指导医生为患者推荐最好的治疗过程。
可以利用已知测序技术或如美国专利5362623或EPA 518650的描述确定p53的基因状态属于正常亦或突变。这些参考文献描述了利用特异于P53结合的DNA序列检测细胞提取物中p53的方法。
可以如Hawn，M．T．等(癌症研究，55卷，3721-3725页(1995))的描述进一步分析错配修复活性。
可替换的诊断应用和改变是显而易见的例如，可以用报道基因(例如，荧光素酶，b-半乳糖苷酶)取代复制缺陷腺病毒中的阴性选择基因；可以通过报道基因的表达对转化细胞打分(例如在细胞样品中或转化分析中)，其与指示细胞中缺乏p53和／或RB的复制表型的表达相关。治疗方法通过对患者给药含有本发明复制缺陷腺病毒的组合物治疗肿瘤疾病，本发明的复制缺陷腺病毒包括复制缺陷腺病毒、E1b-p53(-)复制缺陷腺病毒、E1a／E1b双突变体，进一步包括阴性选择性基因的复制缺陷腺病毒。通常医生会对患者的肿瘤进行活组织检查，以确定其p53和错配修复状况。优选的分析法是显示p53+或p53-细胞亚群存在的免疫组织化学法。
含有表现p53但缺乏p53功能(由于缺乏或基本上丧失错配修复活性)细胞的人肿瘤可以用本发明的复制缺陷腺病毒构建体治疗。例如，但不限于，患有支气管源性癌、鼻咽癌、喉癌、小细胞性和非小细胞性肺癌、肺腺癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠癌、乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、或淋巴细胞性白血病的人类患者或非人类哺乳动物可以通过给药有效抗肿瘤剂量的适当复制缺陷腺病毒治疗。感染性腺病毒颗粒的悬浮液可以经多种途径应用于肿瘤组织，包括静脉内、腹膜内、肌内、皮下、和局部。每毫升约含约103-1013或更多病毒颗粒的腺病毒悬浮液可以作为喷雾吸入(例如，用于治疗支气管源性癌、小细胞性肺癌、非小细胞性肺癌、肺腺癌、喉癌的肺部给药)或直接拭抹肿瘤部位以治疗肿瘤(例如治疗支气管源性癌、鼻咽癌、喉癌、子宫颈癌)或者可以经输注给药(例如，输注到腹膜腔治疗卵巢癌，输注到门静脉治疗肝癌或从其它非肝性原发的肿瘤的肝转移瘤)或者其它适当途径，包括直接注射到肿瘤块上(例如，乳腺肿瘤)，灌肠(例如，结肠癌)，或者插管(例如，膀胱癌)。
抗肿瘤复制缺陷腺病毒突变体可以配制成制剂用于对患肿瘤疾病的患者治疗和诊断给药。对于治疗和预防应用，给人类患者或兽类非人患者给药含有药理学有效量的一种或多种抗肿瘤的复制缺陷腺病毒突变体的无菌组合物，用于治疗肿瘤病症。通常，组合物在水性悬浮液中含有约103-1015或更多腺病毒颗粒。在该无菌组合物中通常应用药物可接受载体或赋形剂。多种水溶液可以应用，例如，水、缓冲水、0．4％盐水、0．3％甘氨酸等。这些溶液是无菌的，并且通常除了所需的腺病毒毒粒无其它颗粒物质。组合物可以按照需要含有药剂可接受的辅料，以适应生理条件，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。可以包括增强腺病毒感染细胞能力的赋形剂。
复制缺陷病毒可以通过脂质体或免疫脂质体传送到肿瘤细胞；该传送可以基于存在于肿瘤细胞群体上的细胞表面特性(例如，结合免疫脂质体中免疫球蛋白的细胞表面蛋白质的存在)选择性靶向肿瘤细胞。典型地，含有病毒颗粒的水悬浮液包封于脂质体或免疫脂质体。例如，可以利用常规方法将复制缺陷腺病毒病毒颗粒的悬浮液包封于胶束，以形成免疫脂质体(美国专利5043164，美国专利4957735，美国专利4925661；Connor和Huang(1985)细胞生物学杂志101582；Lasic DD(1992)自然355279；新型药物传送系统(Prescott LF和Nimmo WS编Wiley，New York，1989)；Reddy等(1992)免疫学杂志1481585；以参考文献形式并入本文)。含有特异性结合存在于个体癌症细胞上癌症细胞抗原(例如，CALLA，CEA)的抗体的免疫脂质体可以用于向那些细胞靶向病毒颗粒。
可以给药含有本发明的抗肿瘤复制缺陷腺病毒或其混合物的组合物，用于预防和／或治疗肿瘤疾病。在治疗应用中，对已经受特定肿瘤疾病影响的患者给药足以治愈或至少部分阻止病症和其并发症剂量的组合物。足以实现上述目的的量被定义为“治疗有效量”或“有效剂量”。该应用的有效量将依赖于疾病的严重性、患者的一般状况、以及给药途径。
在预防应用中，对目前还不处于肿瘤疾病状态的患者给药含有抗肿瘤复制缺陷腺病毒或其混合物的组合物，以增强患者抗肿瘤复发能力或延长缓解时间。该量被定义为“预防有效剂量”。在该应用中，准确量同样依赖于患者的健康状况和一般免疫水平。
可以按照治疗医生选择的剂量水平和模式进行组合物的单次或多次给药。在任何情况下，药物制剂应当提供足以有效治疗患者的本发明的抗肿瘤复制缺陷腺病毒剂量。
本发明的抗肿瘤复制缺陷腺病毒治疗可以与其它抗肿瘤方案(例如常规化疗)联合。突变腺病毒的增殖本发明的腺病毒突变体(例如，复制缺陷腺病毒，E1b-p53(-)复制缺陷腺病毒)典型地以在分别能够反式提供E1a功能、E1b功能，或E1a和E1b功能，支持感染突变病毒颗粒的复制和形成的细胞系(例如，293细胞系ATCC#CRL 1573，美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD；Graham等(1977)遗传病毒学杂志(J．Gen．Virol．)3659)中的病毒原种增殖。
通过举例而不是限制的方式提供了下列实施例。改变或其它可选择的实施方案对本领域技术人员是显而易见的。
实施例1进行下述试验以表明复制缺陷重组腺病毒突变体可以用于选择性杀伤在缺乏错配修复酶活性或错配修复酶活性缺陷时的表现正常p53水平的肿瘤细胞。
使用结肠癌细胞系，HCT 116。已知该细胞系是错配修复活性缺陷，并为p53阳性。参见，Anthoney，D．A．，等，癌症研究，56卷，1374-1381页(1996)；和Drummond，J．T．，等，生物化学杂志，271卷，19645-19648页(1996)。还用到另外两种细胞系，HCT 116的衍生物HCT 116 chr．3，其为错配修复阳性(MMR+)，和HCT 116 chr．3 rev．，其为错配修复阴性(MMR-)。前者通过将一个正常人染色体转到HCT 116细胞中产生。Koi，M．，等，癌症研究，54卷，4308-4312页(1994)。HCT 116 chr．3 rev．(MMR-)通过用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍筛选HCT 116 chr．3(MMR+)产生。参见，Hawn，M．T．，等，癌症研究，55卷，3721-3725页(1995)。
为了确定错配修复对在HCT 116细胞系中腺病毒复制和致细胞病变性的关系，用wt腺病毒或复制缺陷重组腺病毒突变体，dl 1520感染细胞系。如上所述，该病毒是E1b-。Burk，A．，和Barker，病毒学，156卷，107-121页(1987)。
如美国专利5677178的描述进行该试验。还参见Heise，C．，等，天然药物(Nature Medicine)，3卷，639-645页(1997)和Bischoff，J．R．，等，科学，274卷，373-376(1996)。第一个试验为确定dl1520或野生型腺病毒对不同细胞系的致细胞病变性。简要地说，将m．o．i．为1、0．1、或0．01的dl1520或野生型病毒加入细胞。同时操作无病毒的对照。当细胞达到70-90％铺满度时进行细胞病变效应的分析。在连续增加的moi下感染细胞90分钟。感染后四到五天，用结晶紫染色平板，以显示细胞破坏的程度。结果表明dl1520的致细胞病变性与在H116细胞系中的错配修复(MMR-)表型相关。具体地说，moi为1、0．1和0．01的dl1520表现明显的H116(其为MMR-和p53+)裂解作用。当测试针对HCT116+chr3(其为MMR+和p53+)时，moi为1的dl1520显示少量细胞裂解，moi为0．1和0．01时极少或没有细胞裂解。野生型腺病毒对两种细胞系相等地有效，在moi为1、0．1时显示广泛的细胞裂解，但moi为0．01时极少或没有细胞裂解。结果如图4所示。
还观察到moi为1和0．1但不是0．01的dl1520有效地裂解回复体(reverant)细胞系，HCT116 chr3．rev．。该细胞系丢失3号染色体，为MMR-。它也是p53+，因此显示与野生型腺病毒作用于HCT116和HCT116+chr3类似的细胞裂解敏感度。
基于这些结果，理所当然地推断出，野生型腺病毒的致细胞病变性独力于受测细胞系的错配修复表型的状态，而对于E1b突变病毒，dl1520，其裂解细胞系的能力与它们的错配修复状态相关。
作为E1b突变腺病毒在p53+和错配修复缺陷的肿瘤细胞中复制能力的测定，用dl1520或野生型腺病毒感染上述HCT细胞系，通过噬斑分析确定病毒生产。简单地说，用moi为1或10的dl1520或野生型腺病毒感染后四十八小时，将细胞刮入细胞培养基并冷冻。冷冻和解冻循环三次，然后在超声发生器的水浴中接受30秒脉冲，制备溶胞产物。在HEK293细胞上滴定胞溶产物的连续稀释液。
图2显示了结果。显而易见的是，对于HCT 116细胞，moi同样为1或10时，dl1520和野生型病毒的pfu都是类似的。然而，对于细胞系HCT 116 chr3(MMR+)，两种moi下野生型腺病毒比dl1520的pfu都显著地高。该结果与p53+细胞中错配修复的缺乏有利于E1b突变体效应的推测一致。这进一步由在HCT 116 chr3 rev．(MMR-)上进行的试验所证实。其中moi为1或10时，野生型腺病毒和dl1520都表现相似的pfu。
虽然为了清楚理解的目的，通过举例说明的方式详细描述了本发明，但在权利要求的范围内可以进行某些改变和调整是显而易见的。
权利要求
1．一种消除细胞群中的肿瘤细胞的方法，包括以下步骤在感染条件下使(1)缺乏能够结合功能性p53肿瘤抑制基因产物的表达的病毒癌蛋白质的重组复制缺陷腺病毒与(2)包括含有所述能够与病毒癌蛋白质形成结合复合物的功能性肿瘤抑制基因产物的非肿瘤细胞，和含有所述功能性肿瘤抑制基因产物但缺乏或基本上无错配修复活性的肿瘤细胞的细胞群接触，从而产生感染细胞群。
2．按照权利要求2的方法，其中病毒癌蛋白质是腺病毒E1b多肽。
3．按照权利要求1的方法，其中肿瘤细胞为p53(+)。
4．按照权利要求3的方法，其中重组复制缺陷腺病毒不编码能够结合RB的E1a多肽，也不编码能够结合p53的E1b p55多肽。
5．按照权利要求1的方法，其中重组复制缺陷腺病毒是dl1520。
6．按照权利要求1的方法，其中所述包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞的细胞群存在于哺乳动物中，所述接触步骤通过对个体给药重组复制缺陷腺病毒在体内进行。
7．按照权利要求6的方法，其中哺乳动物是人。
8．按照权利要求1的方法，其中重组复制缺陷腺病毒是E1a／E1b双重突变体。
9．一种诊断患者肿瘤对重组腺病毒治疗的敏感度的方法，所述肿瘤包括表现肿瘤抑制基因p53的肿瘤细胞，和所述重组腺病毒具有缺乏能够结合功能性p53癌抑制基因产物的表达的病毒癌蛋白质特性；包括分析所述肿瘤细胞的错配修复活性，和确定是否所述肿瘤细胞缺乏或基本上无该活性。
10．按照权利要求9的方法，其中重组复制缺陷腺病毒是E1b突变体。
11．按照权利要求10的方法，其中重组复制缺陷腺病毒是Ad5 dl1520。
12．按照权利要求9的方法，其中所述错配修复活性经酶学检测。
全文摘要
提供了利用病毒治疗和诊断肿瘤疾病的方法和组合物。优选对患肿瘤(含有表现p53和缺乏或基本上无错配修复活性的细胞)的患者给药缺乏结合和/或灭活p53的病毒蛋白质的突变腺病毒。该突变病毒基本上能够在所述肿瘤细胞中产生复制表型,但基本上不能在具有基本正常p53功能的非复制、非肿瘤细胞中产生复制表型。复制表型在肿瘤细胞中的优先产生导致直接地或通过在表达病毒复制表型的细胞中表达毒性基因优先杀死肿瘤细胞。
文档编号A61K48/00GK1281512SQ98812119
公开日2001年1月24日 申请日期1998年11月11日 优先权日1997年12月12日
发明者A·桑普森－约翰尼斯, D·柯恩 申请人:昂尼克斯药物公司