专利名称：用于基因递送的生物可降解性混合聚合胶束的制作方法
相关申请的前后参照本申请要求美国临时专利申请号60/069，551(1997年12月12日提交)的权益。
早在二十世纪五十年代中期，人们就开始建立将核酸递送到组织培养细胞中的方法，参见H.E.Alexander等，病毒学(Virology)第5卷，第172-173页(1958)。其后，在改进功能性DNA、RNA和反义寡核苷酸(RNA功能抑制因子)之体内和体外的递送方面取得了稳定的进展。二十世纪七十年代后期，由于转染技术和重组DNA技术的相互融合，最近二十年来取得了实质性的进展。这种融合最早见于P.J.Southern等，分子应用遗传学杂志(J.Mol.Appl.Gen.)的第1卷，第327-341页(1982)，该文献采用磷酸钙和二乙基氨基乙基葡聚糖用于在培养哺乳动物细胞中表达重组质粒。目前，核酸的递送和表达已成为科学界持续关注的研究课题。
在体外递送功能性非复制质粒的研究方面，已经取得了一些成功。然而，目前，体内递送功能性非复制质粒的方法仍很不完善。转染技术包括如下方法不溶性无机盐的方法，参见F.Graham，52病毒学456-462(1973)；阳离子脂类的方法，参见E.R.Lee等，7人类基因治疗(Human Gene Therapy)1701-1717(1996)；阳离子聚合物的方法，参见B.A.Demeneix等，7人类基因治疗1947-1954(1996)、A.V.Kabanov等，6生物偶联物化学(Bioconjugate Chem.)7-20(1995)、E.Wagner，88美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)4255-4259(1991)；病毒载体的方法，参见A.H.Jobe，7人类基因治疗697-704(1996)、J.Gaulide，6生物工程当代观点(Current Opinonin biotechnology)590-595(1995)；采用细胞电穿孔技术的方法，参见美国专利US5，501，662(1996)和美国专利US5，273，525(1993)；以及显微注射技术，参见美国专利US5，114，854(1992)。上面列举的每种方法都有其特定的缺点和限制。研究最广泛的基因转移载体是病毒载体，包括逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和疱疹病毒体系。与非病毒载体相比，病毒载体已经表现出很高的转染效率。但是，它们在体内的应用则受到很大限制。它们的缺点包括只导向到分裂细胞、随机插入到宿主基因组、发生复制的风险以及可能的宿主免疫反应。参见J.M.Wilson，96临床研究杂志(J.Clin.Invest.)2547-2554(1995)。
与病毒载体相比，非病毒载体易于制造，不易发生免疫反应，也不会发生复制反应。以二甲基氨基乙基葡聚糖、磷酸钙和聚阳离子为媒介的转染方法已经用于实验室中的组织培养细胞。在某些条件下，体外细胞的转染率已接近100％。然而，已经发现，通常非病毒载体在将遗传材料体内导入细胞方面是无效的，造成基因表达相对较低。人们已经广泛研究了各种各样的两亲阳离子，并且已将它们加入到脂质体配方中用于基因转染。参见F.D.Ledley，6人类基因治疗1129-1144(1995)。目前为止，人们认为阳离子脂类体系是最有前途的DNA转染方案，因为它克服了使用病毒载体所引起的问题。然而，与使用病毒载体相比，使用阳离子脂类的转染效率仍然不高，另外，它的细胞毒性已招致越来越多的抱怨。因此，需要继续研究，以寻求一种新型的基因转移方案。
综上所述，需要开发一种安全有效的用于体内的基因递送体系，这将是本领域的重大进步。
发明概述本发明的一个目的是提供用于将核酸递送到细胞中去的组合物及方法。
本发明还有一个目的是通过提供微粒基因载体以提高递送效率，其中采用多变量(multivariate)方法可以容易地控制微球的体积和电荷密度。
本发明的另一个目的是提供一种基因递送的组合物及方法，其中基因载体是可生物降解的和生物可相容的。
本发明的这些、以及其它的目的是这样实现的提供了用于将所选核酸递送到宿主细胞中的载体，所述载体包含两亲聚酯-聚阳离子共聚物和两亲聚酯-糖共聚物的混合物。在本发明的一个优选实施方案中，聚酯-聚阳离子共聚物的百分比含量约为载体重量的5～95％，聚酯-糖共聚物百分比含量也优选约为载体重量的5～95％。聚酯-聚阳离子共聚物可以是含有通过酰胺键连到亲水聚阳离子嵌段上的疏水聚酯嵌段的二嵌段共聚物，或者，可以是含有疏水性聚酯部分和亲水性阳离子部分的接枝共聚物。优选的聚酯选自下列物质聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D-，L-乳酸)、聚乙醇酸、L-乳酸/乙醇酸共聚物、D-乳酸/乙醇酸共聚物、聚(ε-己内酯)、聚丁内酯和聚丙醇酸内酯。进一步优选的，聚酯是聚(L-乳酸)。在本发明的一个优选实施方案中，聚酯的分子量约为500～10，000。优选的聚阳离子选自下列物质聚(L-丝氨酸酯)、聚(D-丝氨酸酯)、聚(L-赖氨酸)、聚(D-赖氨酸)、聚鸟氨酸和聚精氨酸，更优选的是聚(L-丝氨酸酯)。在本发明的一个优选实施方案中，聚阳离子的分子量约为500～10，000。
聚酯-糖共聚物包含疏水聚酯链段和亲水糖链段。优选的聚酯链段选自下列物质聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D-，L-乳酸)、聚乙醇酸、L-乳酸/乙醇酸共聚物、D-乳酸/乙醇酸共聚物、聚(ε-己内酯)、聚丁内酯和聚丙醇酸内酯，进一步优选的是聚(L-乳酸)。在本发明的一个优选实施方案中，聚酯链段的分子量约为500～10，000。糖链段可以包括多糖或糖基化聚合物。优选的糖基化聚合物至少包括一种选自下列物质的糖部分半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、纤维素二糖、nytrose、丙糖、右旋糖、海藻糖、麦芽糖、半乳糖胺、葡糖胺、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、葡糖酸和乳糖酸，进一步优选的是乳糖酸。糖基化聚合物的聚合物部分优选地选自下列物质聚(L-丝氨酸酯)、聚(D-丝氨酸酯)、聚(L-赖氨酸)、聚(D-赖氨酸)、聚鸟氨酸和聚精氨酸，进一步优选的是聚(L-丝氨酸酯)，更优选的是聚(L-赖氨酸)。
载体还可任选地包括含有下列组分的共聚物(a)疏水部分，(b)连到疏水部分上的亲水部分，和(c)与亲水部分偶联的功能部分，其中所述功能部分选自配体、融合剂、溶酶体定位剂(lyosomotrophic agent)、核定位信号以及它们的混合物。优选的配体选自运铁蛋白、表皮生长因子、胰岛素、脱唾液酸血清类粘蛋白、甘露糖-6-磷酸、甘露糖、LewisX、唾液LewisX、N-乙酰基乳糖胺、半乳糖、葡萄糖和凝血调节蛋白；优选的融合剂选自多粘菌素B和血凝素H2；优选的核定位信号是T-抗原。
一种将所选核酸递送入宿主细胞的组合物，包括水性介质中的混合-聚合-胶束/核酸复合物，其中的混合-聚合-胶束/核酸复合物包含(a)两亲聚酯-聚阳离子共聚物和两亲聚酯-糖共聚物的混合物，和(b)有效量的所选核酸。
一种用于将所选核酸递送入宿主细胞的方法，包括施用水性介质中的有效量的混合聚合胶束/核酸复合物，其中混合-聚合-胶束/核酸复合物含有(a)两亲聚酯-聚阳离子共聚物和包括糖部分在内的两亲聚酯-糖共聚物的混合物，和(b)有效量的上述所选核酸。通过施用使所述复合物与宿主细胞接触，所述糖部分引发受体介导的混合-聚合-胶束/核酸复合物的内吞作用，从而将所述核酸递送入宿主细胞。
详细描述在公开和描述本发明的用于基因递送的组合物和方法前，需指出，本发明不局限于本文所描述的特殊结构、方法步骤和材料，这些结构、方法步骤和材料可以有所改变。还需指出，此处所用的术语仅用于描述特定的实施方案，而不意在对本发明范围加以限制。本发明以本发明的权利要求书及其等价物为准。
需要指出，除非在上下文中明确指出，本发明的说明书和权利要求书中使用的单数形式的“一”和“这”、“该”均包含复数的含义。因此，例如，提及的含有“一种聚酯-阳离子共聚物”包括两种或两种以上的上述聚酯-阳离子共聚物的混合物，提及的“一种寡核苷酸”包括一种或一种以上的提及的寡核苷酸，提及的“一种糖部分”包括提及的两种或两种以上的上述糖部分。
在本发明的描述和权利要求中，下列术语的含义以下面给出的定义为准。
本文使用的“有效量”是指胶束/核酸复合物的量无毒性，但是在用于任何医学治疗以合理的损/益比将核酸递送到所选细胞中去时，足以提供预期的效果。这里使用的有效量的核酸是指所选择的量能够在细胞内提供核酸所希望的效果，例如，表达mRNA、表达蛋白质、用同mRNA的反义杂交抑制表达，等等。采用有效量的载体是指当与所选核酸通过静电相互作用形成复合物时，载体的量足以在水性介质中形成胶束。
除非另外特别指明尺寸，本文使用的术语“多糖”和“寡糖”没有特意的尺寸限制。
本文使用的“施用”和类似术语是指将组合物递送给被处理的个体中，以使组合物可以由循环系统流通到身体的某些部位，在这些部位，组合物的配体部分或糖部分能够与它的相关受体或结合位点结合。因此，组合物优选以系统施用的方式施用于个体，通常是由皮下的、肌肉内的、静脉内的施用或者是腹膜内的施用。上述用途的注射剂可以用常规形式制备，可以是液体溶液或悬浮液或固体形式，该形式适合在注射前制成溶液或液体中的悬浮液，或者是乳液。合适的赋形剂的例子包括例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等。如果需要的话，可以加入少量的附加物质，诸如湿润剂或乳化剂、缓冲剂等等。
本发明涉及用于形成自装配的、混合聚合胶束的组合物，所述混合聚合胶束用于将基因构建体运输进特定的真核细胞。聚合胶束和核酸形成一种静电复合物，该复合物通过受体介导的内吞作用进入细胞。合适的核酸包括DNA、RNA、特定的基因或RNA功能抑制因子，例如反义寡核苷酸。混合聚合胶束包含两种或两种以上的组分，所有这些组分都是可生物降解的、两亲的共聚物。第一种组分，聚酯-聚阳离子共聚物，其与聚阴离子核酸之间发生静电相互作用。第二种组分，聚酯-糖共聚物，在体内将胶束-核酸复合物特异性地导向所选的细胞。本发明任选地还可进一步包含一种或多种附加的聚酯-聚阳离子共聚物或聚酯-糖共聚物。两亲共聚物包括在聚合物链中既有亲水链段又有疏水链段的嵌段或接枝共聚物。在聚酯-聚阳离子共聚物中，亲水链段包含可生物降解的阳离子聚合物，例如，聚(丝氨酸酯)。在聚酯-糖共聚物中，亲水链段包含多糖或者连有单糖或寡糖的聚合物。在这两种组分中，用生物降解性聚酯(如聚(乳酸))作为疏水链段。
在水中，当两种或更多种组分的浓度足够高时，这些组分就自发聚集成热力学上稳定的聚合胶束，胶束微粒呈椭圆形，并且实质上是双层结构。核心“层”是由于疏水聚酯之间的疏水相互作用形成的。类似地，表面“层”是依靠亲水聚阳离子和糖与水之间的相应的亲水相互作用形成的。胶束表面周围将存在净正电荷，因为第一种组分的亲水链段是聚阳离子。正电荷使得可以和核酸(即聚阴离子)之间发生静电相互作用，这种作用对于压紧并保护核酸是非常重要的。表面的糖基团可以包括体内将胶束-核酸复合物导向特定器官细胞或组织细胞的配体。糖基团还可以引发受体介导的内吞作用，造成基因的内在化和表达。
颗粒大小对于基因递送系统的优化是非常关键的，因为颗粒大小经常控制体内的转染效率、细胞毒性和组织定向。参见F.C.Szoka4生物偶联物化学372-379页(1993)。通常，基因递送颗粒的建议尺寸不应超过病毒的大小，从而使得基因递送颗粒能够有效地渗透到组织中。本发明中，通过使用共聚物的不同组合可以容易地改变颗粒大小。单个共聚物的尺寸和结构决定聚集数-即聚集形成胶束的单个共聚物的数目。因此，尺寸和结构部分控制聚合胶束的颗粒大小。而颗粒大小又可以进一步由制备颗粒的条件和方法控制。通过改变聚阳离子共聚物的化学组成、聚阳离子链段的分子量和电荷密度、以及聚阳离子共聚物对含糖共聚物的摩尔比，也可以容易地控制电荷密度。此外，可以掺入附加的离子和/或非离子组分来控制开始的和残留的电荷密度。
导向特定细胞并能掺入胶束的配体包括除了其它之外，运铁蛋白、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、脱唾液酸血清类粘蛋白、甘露糖-6-磷酸(定向单核细胞)、甘露糖(定向巨噬细胞和某些B-细胞)、LewisX、唾液LewisX(定向内皮细胞)、N-乙酰基乳糖胺(定向T-细胞)、半乳糖(定向黑素瘤细胞)、葡萄糖(定向结肠癌细胞)和凝血调节蛋白(定向小鼠肺内皮细胞)。其它的可以加入胶束的化合物包括除了其它之外，融合剂，例如多粘菌素B和血凝素HA2；溶酶体定位剂和核定位信号，如T-抗原。功能性化合物使得外源核酸的递送和表达更为有效，因此，功能性化合物对于成功地递送和表达基因十分重要。可以用胶束通过如下方式容易地导入功能性化合物(1)制出第三种共聚物组分，它在官能团上带有化合物，和(2)将共聚物偶联到预装配的聚合胶束表面。或者，含有功能性化合物的第三种组分可以在胶束刚开始形成时同第一种和第二种组分一起引入胶束。如果那样的话，就可以优选使用官能团留在亲水链段中的共聚物，以便其暴露在胶束表面层。这样，糖、配体和其它功能性化合物的各种组合可以留在第二种组分及其后的组分中，以使胶束-核酸复合物的转染效率达到最大。本发明的一个优点是官能团的种类和含量可不受限制地方便地改变。
根据本发明得到的胶束含有可生物降解的生物相容性共聚物，因而是无免疫原性和无毒的。本文公开的优选共聚物降解成为可由肾排泄的无毒小分子，该共聚物在所要求的基因表达期间是惰性的。通过简单的水解和/或酶促反应进行降解。当共聚物主链包含酯键时，以简单水解进行的降解作用可能占主导地位的。当存在某些细胞器(如溶酶体之类)时，酶促降解将变得主要起来。通过使用不同种类和分子量的聚合物，可以改变降解期的长短，从几天到几个月不等。因此，可以看出是如何用生物降解性聚合物进行基因递送，以解决与聚阳离子基因载体相关的毒性问题的。众所周知，大多数聚阳离子基因载体具有严重的细胞毒性，如果在体内长期存在会引起严重后果。因此，优选的基因载体应在完成作用之后能够降解成为无毒产物。本发明使用可生物降解的聚酯或多肽，所述聚酯或多肽具有安全的、可生物相容的降解途径。此外，本发明的高度支链化的胶束结构可以进一步降低细胞毒性，因为诸如树枝状的聚酰胺型胺类的分支聚阳离子的细胞毒性比线性聚阳离子的细胞毒性低。参见F.C.Szoka，4生物偶联物化学372-379(1993)。因而，由于降低了细胞毒性，本发明聚合胶束的有利组分和结构将是人们所期待的。
如
图1所示，根据本发明的混合聚合胶束10包含两种或两种以上的生物降解性两亲共聚物。第一种共聚物12是含有亲水聚阳离子链段14和疏水聚酯链段16的聚酯-聚阳离子嵌段或接枝共聚物。亲水聚阳离子链段14应当足够大以使共聚物具有水溶性。第一种共聚物可以制成二元、三元或多元嵌段或接枝共聚物，但是优选二嵌段或接枝共聚物。聚酯链段16优选自下列物质聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚乙醇酸、L-乳酸/乙醇酸共聚物、D-乳酸/乙醇酸共聚物、聚(ε-己内酯)、聚丁内酯和聚丙醇酸内酯，但是更优选聚(L-乳酸)。所述聚阳离子链段14优选为单体单元通过酯键或酰胺键相连的聚阳离子，例如聚(L-丝氨酸酯)、聚(D-丝氨酸酯)、聚(L-赖氨酸)、聚(D-赖氨酸)、聚鸟氨酸或聚精氨酸，由于生物降解性较好更优选聚(L-丝氨酸酯)。
第二种共聚物18是聚酯-糖嵌段或接枝共聚物，其中，糖链段20足够大以使共聚物能够溶于水中。聚酯链段22可以与第一种共聚物12中的相同，也可以不同，优选自上面所指出的第一种共聚物12中聚酯链段16的这些物质。糖链段20优选多糖或糖基化聚合物，但是更优选糖基化聚合物。如图1所示，糖基化聚合物是通过将一个或多个单糖或寡糖或其衍生物24偶联到含有一个或多个侧基官能团(如羟基、羧基或氨基)的聚合物26上制备的。单糖或寡糖或其衍生物优选半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、纤维素二糖、nytrose、丙糖、右旋糖、海藻糖、麦芽糖、半乳糖胺、葡糖胺、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、葡糖酸或乳糖酸。最优选将糖以酸的形式结合到聚阳离子聚合物上。因此，本发明最优选的方案为将乳糖酸(4-O-β-D-吡喃半乳糖-D-葡糖酸)偶联到聚(L-丝氨酸酯)或聚(L-赖氨酸)上。由于细胞上半乳糖受体的高度亲和力，乳糖的半乳糖基单元可以方便地定向于肝细胞。
由图1还可看出，将混合的聚合胶束10与所选核酸28相混合，会使核酸上的负电荷与胶束上的正电荷之间产生静电结合，从而形成胶束-核酸复合物30。
将两种或两种以上的共聚物以合适的设定重量比相混合，就可形成混合聚合胶束。换句话说，颗粒大小应约为10-100nm，这取决于聚合物的组成和两种或两种以上共聚物的混合比。本发明的一个最优选实施方案为通过以细胞表面上的半乳糖基受体介导的内吞作用，将所选核酸有效地递送入肝细胞。通过将带有所选受体的细胞和所选糖匹配，能够将核酸转移到其它细胞中。例如，混合胶束可由下列物质制备用于转染巨噬细胞的带甘露糖侧链的共聚物、用于转染T-细胞的N-乙酰基乳糖胺和用于转染结肠癌细胞的葡萄糖。
因此，本发明特别提供了通常用于将所选核酸递送到肝细胞(通常也可以是其它细胞)中的可生物降解的、无毒的非病毒性载体。另外，本发明提供了一种简单有效的方法，以构建各种各样的、可精确设计的胶束结构，也可以用各种各样的糖配体和融合剂例如内体破坏性肽(EDP)，使表面功能化。
聚(N-苄氧羰基-L-丝氨酸酯)二嵌段共聚物。首先，按照大分子(Macromolecules)，1990年23期第65-70页(此处引入本文供参考)描述的步骤，将等摩尔量的4-(二甲氨基)吡啶和对甲苯磺酸在无水苯中反应，制得4-(二甲氨基)吡啶鎓4-甲基苯磺酸盐。将2.392克N-苄氧羰基(N-CBZ)丝氨酸放入一装有搅拌棒、氮气管线和橡胶隔片的双口圆底烧瓶中，在氮气保护下，用注射器加入30毫升四氢呋喃，将其溶解。用注射器连续加入2.94克4-(二甲氨基)吡啶鎓4-甲苯磺酸盐和二异丙基碳二亚胺的二氯甲烷溶液80毫升，将反应混合物在室温下搅拌1～5天。反应一完成，将反应混合物过滤，除去二异丙基脲，然后用旋转式汽化器充分干燥。用甲醇重结晶，得到反应产物。以聚苯乙烯作基准，用凝胶渗透色谱(GPC)对产物进行表征。
聚(L-乳酸)。将3克L-乳酸放入一带有搅拌棒并连有减压蒸馏设备的单口圆底烧瓶中。用氮气彻底冲洗反应瓶，然后将混合物在5毫米汞柱的真空度下加热至160℃。为了得到不同分子量的聚(L-乳酸)，反应时间从1～10小时不等。在产物的氯仿溶液中用大大过量的甲醇使其沉淀，即得产品。以聚苯乙烯作基准，用凝胶渗透色谱(GPC)对产物进行表征。
聚(L-乳酸)-聚(L-丝氨酸酯)二嵌段共聚物。将1克聚(L-乳酸)(分子量为1200)用THF溶解，在二环己基碳二亚胺的存在下，加入两倍摩尔量的二氨基乙烷，反应生成胺终止的聚(L-乳酸)。在室温下搅拌2小时，然后用甲醇沉淀得到反应产物。在室温下，用二环己基碳二亚胺使胺终止的聚(L-乳酸)与等摩尔量的聚(N-苄氧羰基L-丝氨酸酯)(分子量为2900)在二甲基甲酰胺中反应，然后通过催化加氢除去苄氧羰基基团。参见第23卷大分子，第3399-3406页，1990。
聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-丝氨酸酯)二嵌段共聚物。将1.33克乳糖酸溶于50毫升无水THF中，用等摩尔量的三乙胺500毫升中和该溶液，然后在室温下加入500毫升氯代碳酸异丁基酯。搅拌10分钟以后，将反应混合物加到0.67克聚(L-乳酸)-聚(L-丝氨酸酯)的50毫升二甲亚砜溶液中，在室温下搅拌20分钟。过滤，并用乙醚沉淀，得到反应产物。用SPECTRAPOR膜管(分子量截止1000)，通过渗析法提纯反应产物。
混合聚合胶束。在pH值为7.4的磷酸盐缓冲剂中，制得聚(L-乳酸)-聚(L-丝氨酸酯)和聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-丝氨酸酯)的混合物，然后用于利用β-半乳糖苷酶基因和HepG2细胞的实施例4中的转染程序中。
步骤同实施例1，区别在于，胺终止的聚(L-乳酸)由N-三苯甲游基乙醇胺引发的L-交酯的开环聚合来制备。在室温下，将3克三苯甲游基氯在20ml乙醇胺中搅拌，制得N-三苯甲游基乙醇胺。过滤，析出产物，将产物在甲醇-水(9∶1)中重结晶进行提纯。在催化量的辛酸亚锡存在条件下，用N-三苯甲游基乙醇胺在回流甲苯中引发L-交酯的聚合反应。用大大过量的乙醚使聚(L-乳酸)沉淀析出。在二噁烷中，用0.1M的三氟乙酸除去三苯甲游基基团。
由聚(L-乳酸)-聚(L-赖氨酸)和聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-赖氨酸)共聚物制备混合聚合胶束。聚(L-赖氨酸)(分子量为2700)是从Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)得到的，聚(L-乳酸)(分子量为1200)是按照实施例1的步骤进行缩聚反应制备的。用等摩尔量的氯甲酸异丁酯活化聚(L-乳酸)的羧基末端，然后与等摩尔量的聚(L-赖氨酸)反应，生成聚(L-乳酸)-聚(L-赖氨酸)共聚物。将乳糖酸和聚(L-乳酸)-聚(L-赖氨酸)按实施例1的步骤进行反应，制备聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-赖氨酸)。在pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中制得聚(L-乳酸)-聚(L-赖氨酸)和聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-赖氨酸)的多种组合，然后用于利用半乳糖编苷酶编码基因的实施例4的人肝癌HepG2细胞转染程序中。
用人肝癌细胞(HepG2)测试了混合聚合胶束的体外转染效率，该细胞是在含10％的胎牛血清的MEM培养基中培养的。收获细胞，用血细胞计数器计数，以2×105细胞/ml的密度置于96孔平板上。一天以后，在转染前30分钟，新配制含有聚(L-乳酸)-聚(L-赖氨酸)和/或聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-赖氨酸)共聚物的胶束-基因复合物和pSV-β-gal质粒DNA(Promega Corp.，Madison，Wisconsin；EMBL保藏号为X65335)的各种制剂。用无血清的新鲜生长培养基取代96孔平板上每个孔内的生长培养基，加入胶束-基因复合物，至最终体积为10μl。经过4小时培育以后，用含血清的培养基取代原来的生长培养基，在37℃下、5％的CO2的培养箱中将细胞再进一步培育44小时。然后用0.25％的胰蛋白酶-EDTA处理，收获细胞。向每个孔中加入100μl的1x裂解缓冲剂(Promega，Madison，WI)，得到细胞裂解物。
质粒pSV-β-gal是监控哺乳动物细胞转染效率的阳性控制病毒。pSV-β-gal含有SV40早期启动子和增强子序列，转录起始点，编码β-半乳糖苷酶的大肠杆菌lacZ编码区和SV40小T抗原聚腺苷酸化信号。SV40早期启动子和增强子驱动lacZ基因的转录。
转染效率是通过测定细胞裂解物中β-半乳糖苷酶的活性来测量的。用2x检测缓冲液将细胞裂解物和邻硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG，1.33mg/ml)的等量混合物在37℃培养4小时。向每个孔中加入150μl的1M碳酸钠溶液来终止反应，用分光光度计读取420nm处的吸光度数值以测定β-半乳糖苷酶的活性。用LIPOFECTIN试剂(GIBCO/BRL，Gaithersburg，MD)作为比较转染效率的对照。LIPOFECTIN试剂为膜过滤水中的脂质体制剂，其中阳离子脂类N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-n，n，n-氯化三甲基铵(DOTMA)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)的重量之比为1∶1。
用T.Mosmann的“细胞生长及存活的快速比色检测增殖和细胞毒性检测的应用”，65免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)55-63(1983)中描述的MTT比色法测定混合聚合胶束对HepG2细胞的细胞毒性。简要地说，从呈指数性生长的培养物中得到细胞，将细胞以2×105细胞/毫升的密度置于96-孔板上。经过24小时的培育后，用各种量的、不含血清的聚(L-乳酸)-聚(L-赖氨酸)和/或聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-赖氨酸)共聚物溶液处理细胞。经4小时培养后，用含血清的生长培养基替代原生长培养基，使细胞在37℃下、5％的CO2培养箱中再额外培养44小时。然后，向每个孔中加入25微升的3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基溴化四唑(MTT)随后，在37℃下培养4小时。小心除去生长培养基，加入150微升DMSO以溶解所形成的甲结晶。在570nm下，采用Bio-TekEL-3311微板读数器(Bio-TekInstrument；Winooski，VT)测定光密度(OD)。根据下面的方程式计算细胞的存活力(％)存活力(％)=[OD570(样本)/OD570(对照)]×100其中，OD570(对照)代表从仅用PBS缓冲液处理的孔得到的测定数据，OD570(样本)代表从用不同量聚合物处理的孔得到的测定数据。
如表1所示，当无血清存在时，体外在HepG2细胞中根据本发明的混合-聚-胶束的转染效率同LIPOFECTIN试剂一样高。如表2所示，混合聚合胶束对HepG2细胞的细胞毒性要比LIPOFECTIN试剂小得多或稍小，这提示除肝细胞外，聚合胶束可广泛应用于其它组织或器官。
表1.相比于LIPOFECTIN试剂用HepG2细胞测得的由聚(L-乳酸)-聚(L-赖氨酸)(PLL)和聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-赖氨酸)(PLGL)组成的混合聚合胶束的相对转染效率
表2．相比于LIPOFECTIN试剂，用HepG2细胞测得的由聚(L-乳酸)-聚(L-赖氨酸)(PLL)和聚(L-乳酸)-聚(N-乳糖基-L-赖氨酸)(PLGL)组成的混合聚合胶束的细胞毒性(以细胞全部成活为100％计)
权利要求
1．一种将药物送入宿主细胞的载体，该载体包含两亲聚酯-聚阳离子共聚物和两亲聚酯-糖共聚物的混合物。
2．根据权利要求1的载体，其中所述聚酯-聚阳离子共聚物是包含通过酰胺键连到亲水聚阳离子嵌段上的疏水聚酯嵌段的二嵌段共聚物。
3．根据权利要求2的载体，其中所述聚酯嵌段选自下列物质聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚乙醇酸、L-乳酸/乙醇酸共聚物、D-乳酸/乙醇酸共聚物、聚(ε-己内酯)、聚丁内酯和聚丙醇酸内酯。
4．根据权利要求3的载体，其中所述聚酯嵌段是聚(L-乳酸)。
5．根据权利要求3的载体，其中所述聚酯嵌段的分子量约为500～10，000。
6．根据权利要求2的载体，其中所述聚阳离子嵌段选自下列物质聚(L-丝氨酸酯)、聚(D-丝氨酸酯)、聚(L-赖氨酸)、聚(D-赖氨酸)、聚鸟氨酸和聚精氨酸。
7．根据权利要求6的载体，其中所述聚阳离子嵌段是聚(L-丝氨酸酯)。
8．根据权利要求6的载体，其中所述聚阳离子嵌段的分子量约为500～10，000。
9．根据权利要求1的载体，其中所述聚酯-糖共聚物包含疏水聚酯链段和亲水糖链段。
10．根据权利要求9的载体，其中所述聚酯链段选自下列物质的一种聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚(乙醇酸)、L-乳酸/乙醇酸共聚物、D-乳酸/乙醇酸共聚物、聚(ε-己内酯)、聚丁内酯和聚丙醇酸内酯。
11．根据权利要求10的载体，其中所述聚酯链段是聚(L-乳酸)。
12．根据权利要求10的载体，其中所述聚酯链段的分子量约为500～10，000。
13．根据权利要求9的载体，其中所述糖链段包括多糖。
14．根据权利要求9的载体，其中所述糖链段包括糖基化聚合物。
15．根据权利要求14的载体，其中所述糖基化聚合物至少包括一种选自下列物质的糖部分半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、纤维素二糖、nytrose、丙糖、右旋糖、海藻糖、麦芽糖、半乳糖胺、葡糖胺、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、葡糖酸和乳糖酸。
16．根据权利要求15的载体，其中所述糖链段是乳糖酸。
17．根据权利要求14的载体，其中所述糖基化聚合物包含选自下列物质的聚合物部分聚(L-丝氨酸酯)、聚(D-丝氨酸酯)、聚(L-赖氨酸)、聚(D-赖氨酸)、聚鸟氨酸和聚精氨酸。
18．根据权利要求17的载体，其中所述聚合物部分是聚(L-丝氨酸酯)。
19．根据权利要求17的载体，其中所述聚合物部分是聚(L-赖氨酸)。
20．根据权利要求1的载体，其含有重量百分比约5％～95％的所述聚酯-聚阳离子共聚物。
21．根据权利要求1的载体，该载体还包括含有下列组分的共聚物(a)疏水部分，(b)键合到疏水部分上的亲水部分，和(c)与亲水部分偶联的功能部分，其中所述功能部分选自下列物质配体、融合剂、溶酶体定位剂、核定位信号，以及它们的混合物。
22．根据权利要求21的载体，其中所述配体选自运铁蛋白、表皮生长因子、胰岛素、脱唾液酸血清类粘蛋白、甘露糖-6-磷酸、甘露糖、LewisX、唾液LewisX、N-乙酰基乳糖胺、半乳糖、葡萄糖和凝血调节蛋白；所述融合剂选自多粘菌素B和血凝素H2；所述核定位信号是T-抗原。
23．根据权利要求1的载体，其中所述药物是核酸。
24．一种将所选核酸递送入宿主细胞的组合物，该组合物包括水性介质中的混合聚合胶束/核酸复合物，其中的混合聚合胶束/核酸复合物包含(a)两亲聚酯-聚阳离子共聚物和两亲聚酯-糖共聚物的混合物，和(b)有效量的上述所选核酸。
25．根据权利要求24的组合物，其中所述聚酯-聚阳离子共聚物是包含通过酰胺键连到亲水聚阳离子嵌段上的疏水聚酯嵌段的二嵌段共聚物。
26．根据权利要求25的组合物，其中所述聚酯嵌段选自下列物质聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚乙醇酸、L-乳酸/乙醇酸共聚物、D-乳酸/乙醇酸共聚物、聚(ε-己内酯)、聚丁内酯和聚丙醇酸内酯。
27．根据权利要求26的组合物，其中所述聚酯嵌段是聚(L-乳酸)。
28．根据权利要求26的组合物，其中所述聚酯嵌段的分子量约为500～10，000。
29．根据权利要求25的组合物，其中所述聚阳离子嵌段选自聚(L-丝氨酸酯)、聚(D-丝氨酸酯)、聚(L-赖氨酸)、聚(D-赖氨酸)、聚鸟氨酸和聚精氨酸。
30．根据权利要求29的组合物，其中所述聚阳离子嵌段是聚(L-丝氨酸酯)。
31．根据权利要求29的组合物，其中所述聚阳离子嵌段的分子量约为500～10，000。
32．根据权利要求24的组合物，其中所述聚酯-糖共聚物包含疏水聚酯链段和亲水糖链段。
33．根据权利要求32的组合物，其中所述聚酯链段选自下列物质聚(L-乳酸)、聚(D-乳酸)、聚(D，L-乳酸)、聚乙醇酸、L-乳酸/乙醇酸共聚物、D-乳酸/乙醇酸共聚物、聚(ε-己内酯)、聚丁内酯和聚丙醇酸内酯。
34．根据权利要求33的组合物，其中所述聚酯链段是聚(L-乳酸)。
35．根据权利要求33的组合物，其中所述聚酯链段的分子量约为500～10，000。
36．根据权利要求32的组合物，其中所述糖链段包含多糖。
37．根据权利要求32的组合物，其中所述糖链段包含糖基化聚合物。
38．根据权利要求37的组合物，其中所述糖基化聚合物至少包括一种选自下列物质的糖部分半乳糖、葡萄糖、岩藻糖、果糖、乳糖、蔗糖、甘露糖、纤维素二糖、nytrose、丙糖、右旋糖、海藻糖、麦芽糖、半乳糖胺、葡糖胺、半乳糖醛酸、葡糖醛酸、葡糖酸和乳糖酸。
39．根据权利要求38的组合物，其中所述糖部分是乳糖酸。
40．根据权利要求37的组合物，其中所述糖基化聚合物包含选自下列物质的聚合物部分聚(L-丝氨酸酯)、聚(D-丝氨酸酯)、聚(L-赖氨酸)、聚(D-赖氨酸)、聚鸟氨酸和聚精氨酸。
41．根据权利要求40的组合物，其中所述聚合物部分是聚(L-丝氨酸酯)。
42．根据权利要求40的组合物，其中所述聚合物部分是聚(L-赖氨酸)。
43．根据权利要求24的组合物，该组合物含有重量百分比约5％～95％的所述聚酯-聚阳离子共聚物。
44．根据权利要求24的组合物，其中所述混合物还包括含有下列组分的共聚物(a)疏水部分，(b)键合到疏水部分上的亲水部分，和(c)与亲水部分偶联的功能部分，其中所述功能部分选自下列物质配体、融合剂、溶酶体定位剂、核定位信号，以及它们的混合物。
45．根据权利要求44的组合物，其中所述配体选自运铁蛋白、表皮生长因子、胰岛素、脱唾液酸血清类粘蛋白、甘露糖-6-磷酸、甘露糖、LewisX、唾液LewisX、N-乙酰基乳糖胺、半乳糖、葡萄糖和凝血调节蛋白；所述融合剂选自多粘菌素B和血凝素H2；所述核定位信号是T-抗原。
46．一种用于将所选核酸递送入宿主细胞的方法，该方法包括施用水性介质中的有效量的混合聚合胶束/核酸复合物，其中混合聚合胶束/核酸复合物含有(a)两亲聚酯-聚阳离子共聚物和包含糖部分的两亲聚酯-糖共聚物的混合物，和(b)有效量的上述所选核酸，以使所述混合聚合胶束/核酸复合物与宿主细胞接触，所述糖部分引发受体介导的混合聚合胶束/核酸复合物的内吞作用，从而将所述核酸递送入宿主细胞。
47．根据权利要求46的方法，其中所述糖部分是半乳糖，所述宿主细胞是肝细胞。
48．根据权利要求46的方法，其中所述糖部分是甘露糖，所述宿主细胞是巨噬细胞。
49．根据权利要求46的方法，其中所述糖部分是N-乙酰基乳糖胺，所述宿主细胞是T细胞。
50．根据权利要求46的方法，其中所述糖部分是葡萄糖，所述宿主细胞是结肠癌细胞。
51．根据权利要求46的方法，其中所述糖部分是半乳糖，所述宿主细胞是黑素瘤细胞。
全文摘要
用于将所选核酸递送到靶定宿主细胞中的生物降解性混合聚合胶束,所述混合聚合胶束含有两亲聚酯－聚阳离子共聚物(12)和两亲聚酯－糖共聚物(18)。聚酯－聚阳离子共聚物(12)与聚阴离子核酸之间发生静电相互作用,聚酯－糖共聚物(18)体内将胶束－核酸复合物导入细胞。也可以包括具有类似性质的其它共聚物。本发明组合物通过提供颗粒基因载体提高了递送效率,该载体易于用多变量方法控制颗粒大小和电荷密度。使用该组合物还可以引入多种配体和其它功能性化合物。在用所选核酸转化靶定宿主细胞的方法中,可以使用本发明组合物。
文档编号A61K9/107GK1281355SQ98812132
公开日2001年1月24日 申请日期1998年12月11日 优先权日1997年12月12日
发明者Y·K·乔伊, J·S·基姆 申请人:三阳株式会社