专利名称：杀菌/通透性增强蛋白功能区变构肽的制作方法
技术领域：
本发明属于用于治疗人体细菌感染和内毒素血症的活性多肽分子，具体涉及杀菌/通透性增强蛋白质(BPI)功能区生物活性肽--BPI变构肽。
革兰氏阴性(G-)细菌引起的脓毒症是导致临床病人死亡的重要原因之一，其中存在于G-细菌外膜的脂多糖(内毒素，LPS)起着重要的作用。针对G-菌的治疗主要是采用抗生素来杀灭细菌。但是抗生素在杀灭细菌的同时导致内毒素的大量释放，其结果往往是病人死于严重的内毒素血症，这一直是临床亟待解决的难题。
目前已有一些或具有中和内毒素能力或具有杀菌作用的多肽分子，如从鲎血细胞提取的抗内毒素因子(LALF)，从多粘菌中提取的多粘菌素B1。和LALF一样，多粘菌素的类似物由于缺乏脂肪酸基因，虽然可以和LPS结合但无杀菌能力。又如Cecropins和magainins是两种具有杀菌功能的肽类化合物，此类肽的氨基酸长度多在20-40之间，杀菌能力最强的Cecropin是Cecropin A，但它们的中和内毒素作用却不强。为此寻找一种既能杀灭细菌又能中和细菌死亡后释放的内毒素的活性多肽分子，将是一项非常有意义的工作。
人体存在许多抵御外来微生物侵袭的防御机制，其中白细胞是一重要环节，杀菌/通透性增强蛋白(Bactericidal/permeability-increasingprotein，BPI)就是从哺乳类动物白细胞嗜天青颗粒中分离出的蛋白质。人源BPI已由weiss(Weiss J.et al.1987.Blood 69652)在1987年利用酸抽提及亲合层分析分离成功，其分子量为55KD，其cDNA及氨基酸序列已由Gray(Gray PW.Et al.1989.J.Bio.Chem.2649505)证实。研究结果表明其具有强大而广谱的杀灭G-细菌及中和内毒素的能力。
BPI特异杀灭G-细菌的机制可能与带正电的BPI与带负电脂多糖相互吸引，细菌表面电位发生变化，从而导致细菌外膜通透性的改变有关。同时，BPI还具有中和LPS毒性的能力，因此BPI可应用于治疗由G-细胞引起的感染性疾病，包括菌血症、内毒素血症、脓毒症等。不仅全序列的BPI具有杀菌和中和内毒素的能力，而且N末端的199个氨基酸(rBPI23)也具有完整BPI的全部生物学功能，不过C末端仅有轻微或无杀菌能力(Ooi CE.et al.1991 J.Exp.Med.174649)。但是rBPI23在对细菌感染和LPS血症的治疗时，需要绝对的量才能达到杀灭细菌和中和LPS的目的，存在用量较大、成本较高等问题。据文献报道(J5 Study Group.1992 J.Infect Dis.165695，Ziegler EJ.et al.1991 New Eng J.Med.324429)，BPI功能区主要由三大部分组成，①BPI 17-45氨基酸序列，②BPI 65-99氨基酸序列，③BPI 142-169氨基酸序列，也就是说BPI杀菌和中和LPS的生物活性区域分别存在于这三个氨基酸序列的区域内。
能否寻找出更小的既能杀灭细菌又能中和内毒素的BPI功能区结构，以及在此基础上寻找到新的杀菌和中和LPS活性更强、生产成本更低的多肽分子，并能产业化生产以满足临床治疗的需要，是一个十分重要的研究课题。
本发明的目的在于利用现今公知的合成方法提供一种可稳定重复生产的、包括全部或部分BPI生物功能如杀菌、中和内毒素活性的、小分子量多肽分子--BPI变构肽。
本发明所提供的BPI变构肽是一种具有与BPI同样功能的活性短肽，是基于在BPI功能区的一个位点置换不同的氨基酸，或在2个以上不同位置置换同一氨基酸或不同氨基酸所得的线性的BPI功能区片段变构体。
上述本发明所定义的这种BPI变构肽，具有以下特征(一)SEQ ID NO1(BPI A)(1)序列特征(A)长度10氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性
(2)分子类型肽(3)序列描述SEQ ID NO1A. N’---RRAFVFIHKM---C’或Arg Arg Ala Phe Val Phe Ile His Lys Met(二)SEQ ID NO2(BPI B)(1)序列特征(A)长度16氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(2)分子类型肽(3)序列描述SEQ ID NO2B. N’--RHKRRVGILLQLVRKR--C’或Arg His Lys Arg Arg Val Gly Ile Leu Leu Gln Leu ValArg Lys Arg。
(三)SEQ ID NO3(BPI C)(1)序列特征(A)长度14氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(2)分子类型肽(3)序列描述SEQ ID NO3C. N’--KTKVGWLIQLFHKK--C’或Lys Thr Lys Val Gly Trp Leu Ile Gln Leu Phe His Lys Lys。
(四)SEQ ID NO4(BPI D)(1)序列特征(A)长度14氨基酸(B)类型氨基酸
(C)拓扑结构线性(2)分子类型肽(3)序列描述SEQ ID NO4D. N’--KGKVGWLIQLFHKK--C’或Lys Gly Lys Val Gly Trp Leu Ile Gln Leu Phe His LysLys。
本发明的这些短肽--BPI变构肽，可按照Merrifield等(Merrifield RB.1963 J Am Chem Soc.852149)报告的公知的合成方法合成，这种公知的固相化学合成技术，是氨基酸为Fmoc保护的氨基酸，合成用树脂为HMP树脂，以水杨醛法测总胺来监控缩合率。合成时按多肽顺序由C端逐个向N端延伸，缩合剂为DCCI，加HOBT以活化氨基酸的羧基，每轮循环用六氢吡啶除去Fmoc。本发明物是在PE公司的433A多肽自动合成仪上进行合成，根据给定的BPI变构肽氨基酸序列，多肽自动合成仪能自动完成各种反应程序而得到所需的BPI变构肽片段，最后用三氟醋酸法将多肽从树脂上切割并除去所有的保护基团，合成得到的多肽须经过高压液相(HPLC)纯化纯化柱C-18反相柱，流动相A 0.1％三氟醋酸(TEA)，流动相B 100％乙晴/0.1％TFA，0-30min.10-100％流动相B线性梯度，检测波长 220nm，流速 2.0ml/分。
计算主峰面积占整个峰面积的比例即为纯度。经Sephadex G-25脱盐，冷冻干燥后作质谱鉴定和N端氨基酸序列分析测定分子量并确认其氨基酸序列。
实施例1.取HMR树脂294mg，根据给定的BPI C氨基酸序列采用PE公司433A多肽自动合成仪合成得到825mg BPI C树脂；
2.取上述合成的干燥BPI C树脂，加入到一个50ml的圆底烧瓶中，并放入搅拌子，在冰浴冷却20分钟；另取事先在冰浴冷却30分钟的裂解试剂B(无苯酚，含0.25ml EDT、0.5ml Anisole、0.5ml D.I.H2O、10ml TFA)加入圆底烧瓶中，磁力搅拌15分钟后，移去冰浴，在室温下反应1.5小时，过滤除去树脂，经减压蒸溜去除裂解试剂，再用醋酸乙酯洗涤7次，每次30ml，然后加入D.I.H2O使其溶解，再用无水乙醚萃取3次，以去除残余的裂解试剂，最后减压蒸溜去除残余的乙醚，浓缩得到粗肽溶液。
3.上述粗肽溶液按以下纯化条件下纯化柱C-18反相柱，流动相A 0.1％三氟醋酸(TFA)，流动相B 100％乙晴/0.1％TFA，0-30min.10-100％流动相B线性梯度，检测波长 220nm，流速 2.0ml/分，进行纯化，收集主峰溶液，再经Sephadex C-25脱盐，溶液冷冻干燥，得到77.38mg纯度(HPLC百分面积)为78.33％的BPI C变构肽。
经质谱鉴定和N端氨基酸序列分析测定分子量并确认其氨基酸序列。如表1所示，本发明的BPI变构肽的实测分子量和N端氨基酸序列分析结果与理论分子量及理论序列完全相符。
表1编号 理论分子量 实测分子量 理论序列 序列分析BPI A1305 1306.37 RRAFVFIHKM 与理论序列相符BPI B2028 2029.71 RHKRRVGILLQLVRKR与理论序列相符BPI C1726 1727.65 KTKVGWLIQLFHKK 与理论序列相符BPI D 16821681.83KGKVGWLIQLFHKK 与理论序列相符这些短肽--BPI变构肽，及其2个或3个相同或不同的肽相连成的肽，或这些肽作为稀释剂、佐剂及载体，都具有杀灭G-、G+及真菌和中和LPS的多种功效，可用于细菌性感染疾病的治疗，包括对传统抗生素耐药的细菌性感染的治疗，也可应用于治疗内毒素血症。
本发明的BPI变构肽的问世，由于其分子量小，治疗剂量小，成本低，而且可通过化学合成法合成，因而可实现工业化生产。
BPI变构肽生物活性的检测1.中和内毒素活性
图1是本发明的BPI变构肽中和LPS能力的测试图。将各种BPI变构肽与内毒素O111B4混匀，37℃孵育30分钟，间断摇晃，然后加入pH8.0磷酸盐缓冲液(PBS)，使内毒素终浓度为200pg/ml，最后采用基质显色法鲎试剂盒检测内毒素含量，以多粘菌素B为阳性对照。如图1所示，BPI变构肽在体外均有中和LPS的作用，其中以BPI B的活性最高。
2.杀菌活性检测图2是本发明的BPI变构肽杀菌活性的测试图。检测细菌为大肠杆菌J5，O111B4，先将细菌复苏于普通琼脂平板，挑取单个菌落接种于5ml M-H肉汤，37℃，3-4h至细菌生长于对数期。1000rpm/min离心5分钟，弃上清，沉淀用5mlPBS冲洗，离心后用M-H肉汤稀释至2×106cfu/ml，加入BPI变构肽，按200μg/ml倍比稀释至每管，37℃振荡孵育20小时，于590nm处读取吸光度；另取50μl菌液于血晾脂平板上，过夜培养计数，如图2所示，几种BPI变构肽在体外有杀菌作用，BPI B效果最好。
3.抑制肿瘤坏死因子(TNF)的产生人单核细胞株(THP-1)受内毒素刺激后可释放TNF，且有剂量依赖关系，中和内毒素后，TNF必将减少，TNF的量可采用ELISA法检测(试剂盒由Roch公司提供)。
图3是本发明的BPI变构肽抑制肿瘤坏死因子能力的测试图。将THP-1培养于RPMI1640中，细胞悬液离心后用新鲜RPMI1640配成1×105/ml，接种于96孔培养板，加入大肠杆菌O111B4内毒素5μg/ml，37℃培养6小时，每孔中分别加入BPI变构肽0.1μg/ml至100μg/ml，离心，取上清，测TNF含量，如图3所示，BPI B在浓度为0.1μg/ml时即产生明显的抑制TNF产生的作用。
4.对小鼠内毒素血症的治疗作用小鼠尾静脉注射大肠杆菌O111B4内毒素，LD90为20mg/kg。然后迅速同途径注射不同剂量BPI变构肽(剂量为1mg/kg或5mg/kg体重)，用地塞米松为阳性对照，生理盐水为空白对照，观察7天后动物死亡率。结果见表2。
表2 BPI变构肽对小鼠内毒素血症模型的保护作用组别 剂量(mg/kg) 实验动物(只) 死亡动物(只) P值空白对照组0 20 18BPIA 1 20 7 ＜0.05BPIA 5 20 4 ＜0.01BPIB 1 20 4 ＜0.01BPIB 5 20 1 ＜0.01BPIC 1 20 12 ＞0.05BPIC 5 20 8 ＞0.05BPID 1 20 14 ＞0.05BPID 5 20 10 ＞0.05地塞米松 5 20 6 ＜0.05结论BPI变构肽对LPS(20mg/kg体重)攻击的小鼠有明显的保护作用。
5.对小鼠腹膜炎的保护作用小鼠腹腔注入活大肠杆菌O111B4，1×107cfu/ml 0.5ml，随即注入1mlBPI变构肽(剂量为1或5mg/kg体重)，以多粘菌素B为阳性对照，生理盐水为空白对照，观察动物7天后的死亡率，结果见表3。
表3 BPI变构肽对小鼠腹膜炎的保护作用组别 剂量(mg/kg) 实验动物(只)死亡动物(只) p值空白对照组 020 19BPIA120 9 ＞0.05520 5 ＜0.05BPIB120 2 ＜0.01520 0 ＜0.01BPIC120 11 ＞0.05520 7 ＜0.05BPID120 13 ＞0.05520 9 ＞0.05多粘菌素B 10 20 4 ＜0.01结论BPI变构肽对产生腹膜炎的小鼠有较强的保护作用。
权利要求
1.一种由BPI功能区氨基酸序列经置换而来的活性多肽分子--BPI变构肽(BPI-A)，其特征在于其(1)序列特征(A)长度10氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(2)分子类型肽(3)序列描述SEQ ID NO1A. N’---RRAFVFIHKM---C’。
2.一种由BPI功能区氨基酸序列经置换而来的活性多肽分子--BPI变构肽(BPI-B)，其特征在于其(1)序列特征(A)长度16氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(2)分子类型肽(3)序列描述SEQ ID NO2B. N’---RHKRRVGILLQLVRKR---C’。
3.一种由BPI功能区氨基酸序列经置换而来的活性多肽分子--BPI变构肽(BPI-C)，其特征在于其(1)序列特征(A)长度14氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(2)分子类型肽(3)序列描述SEQ ID NO3C. N’---KTK/VGW/LIQ/LFH/KK---C’。
4.一种由BPI功能区氨基酸序列经置换而来的活性多肽分子--BPI变构肽(BPI-D)，其特征在于其(1)序列特征(A)长度14氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(2)分子类型肽(3)序列描述SEQ ID NO4D. N’---KGK/VGW/LIQ/LFH/KK---C’。
5.如权利要求1，2，3或4所述的BPI变构肽及其2个或3个相同或不同的肽相连成的肽，其特征在于用于治疗G-细菌感染或内毒素血症。
6.如权利要求1，2，3或4所述的BPI变构肽及其2个或3个相同或不同的肽相连成的肽作为稀释剂、佐剂及载体，其特征在于用于治疗G-细菌感染或内毒素血症。
全文摘要
一种由BPI功能区氨基酸序列经置换而来的、其氨基酸序列为:A.N’－RRAFVFIHKM－C’,B.N’－RHKRRVGILLQLVRKR－C’C.N’－KTKVGWLIQLFHKK－C’D.N’－KGKVGWLIQLFHKK－C’活性多肽分子及其2个或3个相同或不同的肽相连成的肽,或其作为稀释剂、佐剂及载体,用于治疗G－细菌感染或丙毒素血症,治疗剂量小,成本低,而且可通过化学合成法合成,因而可实现工业化生产。
文档编号A61K38/10GK1270175SQ9910507
公开日2000年10月18日 申请日期1999年4月13日 优先权日1999年4月13日
发明者姚志勇, 沈福泉, 曾少贵 申请人:深圳市翰宇生物工程有限公司