专利名称：蕲蛇酶及其生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药品及其生产工艺，尤其涉及一种蕲蛇酶及其生产工艺。
文献专利申请公开号CN1106699A公开了一种蕲蛇酶注射液及其制备工艺，采用福建的尖吻蝮蛇毒经葡聚糖凝胶G-75柱层析洗脱出蛋白峰，取具活性的蛋白峰上DEAE-葡聚糖凝胶A-50洗脱，收集V、VI、VII峰，再上葡聚糖凝胶G-75进行纯化，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检定，即得到分子量分别为14000、31000及66000道尔顿的三种同功酶，按4∶5∶1比例混合成蕲蛇酶后再配制成蕲蛇酶注射液，但此种蕲蛇酶配制成的蕲蛇酶注射液，在临床上存在一些不良反应，表现为血小板计数下降较多，出现轻度的粘膜、皮肤出血及皮疹。
本发明的目的在于提供一种纯度较高、不良反应较少、临床效果好的蕲蛇酶及其生产工艺。
本发明的目的是这样实现的，所述的蕲蛇酶，其特点为由尖吻蝮蛇毒分离纯化而得的具有凝血酶样酶活力和精氨酸酯酶活力、分子量为24000～30000道尔顿以及等电点为4.5～5.0的丝氨酸型蛋白水解酶混合物。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的，所述的蕲蛇酶生产工艺，依序为1)去杂质的尖吻蝮冻干蛇毒粉末经适量的pH值为8.3～8.7、浓度为0.01～0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液溶解后溶液上葡聚糖凝胶G-75柱，过滤得A，B，C三个蛋白峰，收集具有凝血酶样酶活力的A峰和B峰；2)收集到的具有凝血酶样酶活力的A峰和B峰用DEAE-葡聚糖凝胶A-50柱层析，得12个蛋白峰，分别收集具有凝血酶样酶活力的V、VI、VII峰；3)分别收集到的具有凝血酶样酶活力的V、VI、VII峰，分别用CM-葡聚糖凝胶C-50柱层析，各得3个蛋白峰，分别收集具有凝血酶样酶活力的CM1、CM2、CM3蛋白峰；4)分别收集到的具有凝血酶样酶活力的CM1、CM2、CM3蛋白峰分别用superdex75PG柱过滤，相应各得到a，b两个蛋白峰，收集高纯度的具有高凝血酶样酶活力的b蛋白峰，将其混合即为蕲蛇酶。
本发明的生产工艺第1)、2)步骤与对比文献相同，但3)、4)步骤与对比文献不相同，因而能收集到具有高纯度及高凝血酶样酶活力和精氨酸酯酶活力、分子量为24000～30000道尔顿以及等电点为4.5～5.0的丝氨酸型蛋白水解酶混合物。而对比文献生产工艺收集到分子量分别为14000、31000及66000道尔顿的三种同功酶混合物。在HPLC对产品纯度的检测上本工艺为单一蛋白峰，纯度达95～100％，对比文献为3个蛋白峰，在SDS-PAGE检测上本工艺产品为单一条带，对比文献为3条带，本工艺产品的酶活力亦比对比文献高。本发明的生产工艺生产的蕲蛇酶与对比文献生产工艺生产的蕲蛇酶都是一种丝氨酸型蛋白水解酶，能使血液中的纤维蛋白原裂解为可溶性纤维蛋白，另具有精氨酸酯酶活力。注射液按卫生部规定的方法测定均具有如下特点1)6分钟内出现纤维蛋白凝块；2)精氨酸酯酶活力达1000μmolTAME/mg·min以上，含蕲蛇酶蛋白质为标示量的100±15％；3)在药理方面表现为能使血液中的纤维蛋白原裂解为可溶性纤维蛋白，并迅速在体内消除，因而降低血液粘稠性，并能抑制血小板聚集，因而防止血栓形成；3)能促使血管内皮细胞释放组织纤溶酶原激活物，因而促使血栓溶解；4)用于防治脑血栓(脑梗塞)和其它外周动静脉血栓性疾病。毒理学方面进行急性毒性及长期毒性和特殊毒性测定，均符合新药审批的各项要求。本发明的生产工艺生产的蕲蛇酶与对比文献生产工艺生产的蕲蛇酶由于具有不同的分子量，说明是蛇毒中的不同组分，且纯度高。本发明的生产工艺生产的蕲蛇酶其注射液在临床上不良反应较小，1)表现为血小板计数无明显下降，停药后可很快自行回升；2)极个别病例出现较轻度的粘膜、皮肤出血及皮疹，停药后症状自然消失。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细说明
图1为蛇毒经葡聚糖凝胶G-75柱过滤的A峰和B峰用DEAE-葡聚糖凝胶A-50柱层析图。
图2为收集到具有凝血酶样酶活力的V、VI、VII三个峰，分别用葡聚糖凝胶G75柱过滤，去掉无活性的C峰，将有活性的A，B峰混合，用CM-葡聚糖凝胶C-50柱层析分别收集各自具有凝血酶样酶活力的CM1、CM2、CM3蛋白峰的柱层析图。
图3为CM1、CM2、CM3蛋白峰经superdex75PG柱的柱层析图。
本发明所述的凝血酶样酶活力和精氨酸酯酶活力测定方法同文献“尖吻蝮蛇毒凝血酶样酶的分离、纯化及其生化药理研究”《福建医学院学报》VoL.23(4)303～308，1989公开的方法。分子测定按SDS-PAGE法(Weber K，Osborn M.J Biol Chemistry 1969 2444406)实施例取去杂质的尖吻蝮蛇毒冻干粉末10.0克用适量的pH值为8.3～8.7、浓度为0.01～0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液溶解后，离心分离去杂质，离心分离溶液在温度为25℃以下，上葡聚糖凝胶G-75柱过滤，洗脱液用pH值为8.3～8.7、浓度为0.01～0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷-HCl，用紫外分光光度计测光吸收值，得A，B，C三个蛋白峰，测定凝血酶样酶活力。收集具有凝血酶样酶活力的A峰和B峰，收集到的A峰和B峰用DEAE-葡聚糖凝胶A-50柱层析，洗脱液用pH值为8.3～8.7、浓度为0.01～0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷-HCl，得12个蛋白峰，测定凝血酶样酶活力。分别收集具有凝血酶样酶活力的V、VI、VII三个峰，收集到的V、VI、VII三个峰，分别用葡聚糖凝胶G-75柱过滤，去掉无活性的C峰，将有活性的A，B峰混合，用CM-葡聚糖凝胶C-50柱层析，洗脱液用pH值为8.3～8.7、浓度为0.01～0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷-HCl，每个峰经柱层析各得3个蛋白峰，测定凝血酶样酶活力。V、VI、VII三个峰经柱层析后分别收集各自具有凝血酶样酶活力的CM1、CM2、CM3蛋白峰，收集到的CM1、CM2、CM3蛋白峰分别再用superdex75PG柱过滤，洗脱液用pH值为8.3～8.7、浓度为0.01～0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷-HCl含0.15mol/LNaCl，相应各得到a，b两个蛋白峰，测定凝血酶样酶活力。收集SDS-PAGE检定高纯度的具有凝血酶样酶高度活力的b蛋白峰。将上述三个具有凝血酶样酶活力的b蛋白峰混合即为蕲蛇酶母液。经测定其分子量为24000～30000道尔顿以及等电点为4.5～5.0的丝氨酸型蛋白水解酶混合物。蕲蛇酶母液经HPLC柱TSK G3000-SW(7.5×300毫米)，(东ソ一株式会社南阳事业所出品)检测，塔板数10000N/30厘米，流动相0.02mol/L磷酸钠-0.1mol/L硫酸钠缓冲液，pH值为7.0，流速1.5毫升/分钟，测得其纯度为95～100％。蕲蛇酶母液经6号垂熔漏斗过滤后，作蛋白含量测定，再作凝血酶样酶活力和精氨酸酯酶活力测定，热原及过敏反应试验，全部合格后，用无菌、无热源的0.9％NaCl稀释再经6号垂熔漏斗过滤后，按每支1ml0.75单位，灌封安瓿。
如图1所示，为A峰和B峰用DEAE-葡聚糖凝胶A-50柱层析图，层析柱50mm×100cm，总A280nm＝14000～15000OD，洗脱液用pH值为8.3～8.7、浓度为0～0.3mol/LNaCl--0.01～0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液，流速8毫升/15分钟/管，从图中可知柱层析后共得12个蛋白峰，测定凝血酶样酶活力，其中V、VI、VII三个峰具有凝血酶样酶活力。如图2所示，为收集到具有凝血酶样酶活力的V、VI、VII三个峰，分别用葡聚糖凝胶G-75柱过滤，去掉无活性的C峰，将有活性的A，B峰混合，用CM-葡聚糖凝胶C-50柱层析分别收集各自具有凝血酶样酶活力的CM1、CM2、CM3蛋白峰的柱层析图，所用的柱为CM-葡聚糖凝胶C-50柱，柱长为40mm×450cm，洗脱液分别用浓度为0.01mol/L的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液、0.2mol/L NaCl--0.01mol/L的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液、0.3mol/L NaCl--0.01mol/L的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液和0.4mol/LNaCl--0.01mol/L的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液梯度洗脱。流速5毫升/15分钟/管，样品1000O.D(A280nm)/28ml。如图3所示，为CM1、CM2、CM3蛋白峰经superdex75PG柱的柱层析图，层析柱superdex75PG 26mm×74.5cm，流速4毫升/分钟，CM1、CM2、CM3蛋白峰分别过滤，洗脱液用pH值为8.3～8.7、浓度为0.15mol/L NaCl--0.01～0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷-HCl含0.15mol/L NaCl的缓冲液，从图中可知柱层析后相应各自得到a，b两个蛋白峰，测定凝血酶样酶活力，收集高纯度的具有高凝血酶样酶活力的b蛋白峰，将上述三个具有凝血酶样酶高度活力的b蛋白峰混合即为蕲蛇酶。本发明所用的柱及凝胶均为瑞典Pharmacia公司产品。
权利要求
1.蕲蛇酶，一种由尖吻蝮蛇毒分离纯化而得的具有凝血酶样酶活力和精氨酸酯酶活力、分子量为24000～30000道尔顿以及等电点为4.5～5.0的丝氨酸型蛋白水解酶混合物。
2.权利要求1所述的蕲蛇酶生产工艺，其特征在于依序包括如下步骤1)去杂质的尖吻蝮蛇毒冻干粉末经适量的pH值为8.3～8.7、浓度为0.01～0.05mol/L的三羟甲基氨基甲烷-HCl缓冲液溶解后溶液上葡聚糖凝胶G-75过滤得A，B，C三个蛋白峰，收集具有凝血酶样酶活力的A峰和B峰；2)收集到的具有凝血酶样酶活力的A峰和B峰用DEAE-葡聚糖凝胶A-50柱层析，得12个蛋白峰，分别收集具有凝血酶样酶活力的V、VI、VII峰；3)分别收集到的具有凝血酶样酶活力的V、VI、VII峰，分别用葡聚糖凝胶G75柱过滤，得A，B，C三个峰，去掉无活性C峰，将A，B峰混合后用CM-葡聚糖凝胶C-50柱层析，得3个蛋白峰，分别收集各自具有凝血酶样酶活力的CM1、CM2、CM3蛋白峰；4)收集到的具有凝血酶样酶活力的CM1、CM2、CM3蛋白峰分别用superdex75PG柱过滤，相应各得到a，b两个蛋白峰，收集高纯度的具有凝血酶样酶活力的b蛋白峰，将上述三个具有凝血酶样酶活力的b蛋白峰混合即为蕲蛇酶。
全文摘要
本发明公开了蕲蛇酶及其生产工艺,工艺为冻干蛇毒用已知的缓冲液溶解上葡聚糖凝胶G－75柱过滤,收集具有凝血酶样酶活力的A、B峰,用DEAE－葡聚糖凝胶A－50柱层析,收集具有凝血酶样酶活力的Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ峰,用CM－葡聚糖凝胶C－50柱层析,收集具有凝血酶样酶活力的CM1、CM2、CM3峰,用superdex75PG柱过滤,各得a,b两峰,收集具有高凝血酶样酶活力的b峰,混合为分子量24000～30000道尔顿及等电点4.5～5.0的蕲蛇酶。
文档编号A61P7/00GK1229136SQ9911640
公开日1999年9月22日 申请日期1999年3月26日 优先权日1999年3月26日
发明者王晴川, 刘广芬 申请人:福建医科大学