专利名称：包括修饰的导向部分的嵌合毒素的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括修饰的导向部分的嵌合毒素，更具体地说，本发明涉及包括连接到假单胞菌外毒素蛋白质上的表皮生长因子的嵌合毒素，其制备方法及经修饰后提高了受体结合能力和细胞毒活性的嵌合毒素在肿瘤治疗中的应用。
可以将衍生于细菌或植物的蛋白质毒素连接到生长因子、细胞因子、激素、抗体或其片段，以及其他细胞导向分子上，构成具有寻靶能力和细胞毒活性的嵌合毒素，以杀伤携带特异性受体或抗原的有害细胞。一种很有开发前景的有效治疗用毒素是由铜绿色假单菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌的假单胞菌外毒素A(PE)单体蛋白质(分子量66KD)。当PE与其他导向因子组成的融合分子中的导向部分与细胞受体结合后，毒素-配体复合物通过胞吞作用经膜凹陷进入细胞膜囊泡，然后泡内质子泵迅速使膜囊泡内环境酸化(pH值降低)。当胞内pH降低至足够低时，延伸的毒素在胞内蛋白酶(弗林蛋白酶，Purin)作用下，于Arg279和Gly280之间发生断裂，同时联系这个部分(Cys265-Cys287)的二硫桥键亦被还原并断开，从而产生羧基末端37KD片段(Ogata et al．，J．Biol．Chem，26520678-20685，1990；Chiron et al．，J．Biol．Chem．27231707，1991)。然后37KD片段跨膜转位到高尔基复合体上，并经囊泡穿梭被带入内质网，进而转入胞浆内。毒素分子借助其末端特异序列(REDLK)固着于肽链上。内化后，该37KD片段催化氧化态NAD的ADP核糖基化部分向延伸因子2(EF-2)上转移，使EF-2核糖基化而失活，从而抑制细胞蛋白质的合成，最终导致细胞死亡。
从目前已知的假单胞菌外毒素融合蛋白质杀伤有害细胞(如肿瘤细胞)的上述机理可以看出，决定毒素导向并进而杀伤靶细胞的主要因素包括(1)融合蛋白质分子导向部分与其相应细胞受体的结合能力及稳定性；(2)融合蛋白质的空间构象及对其通过细胞膜向细胞溶胶内转位的能力；和(3)融合蛋白质在细胞内的适当折叠，及细胞内弗林蛋白酶裂解PE分子以产生37KD片段的能力。因此，对PE-配体融合蛋白质，特别是其中的毒素部分进行适当地修饰是十分必要的。这些修饰包括分子中一个或多个半胱氨酸的取代、氨基和／或羧基末端一个或多个氨基酸的删除、加入或取代等。迄今已有许多关于对毒素分子或其部分的修饰和功能分析的报导(参见美国专利5，705，163、5，821．238、5，621，078、5，705，156等)。
然而，当毒素分子如PE66或PE40与导向分子融合后，必然导致融合蛋白质的三维空间结构改变，包括分子折叠后个别氨基酸之间疏水相互作用甚至氢键形成所导致的对整个融合分子的受体结合能力及细胞毒活性的某些影响。为此，本发明人在充分考虑到这些影响的基础上，试图对融合蛋白质的导向部分的分子结构以及导向部分的连接方式进行某些修饰和改动，以期改善嵌合分子的受体结合效率及靶细胞杀伤活性。
因此，本发明的一个目的是提供包括连接到截短的毒素分子上的表皮生长因子序列的靶特异性嵌合毒素，特征在于其中作为导向部分的表皮生长因子序列以两分子串联方式连接到截短形式的毒素分子上。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的截短形式的毒素分子是缺失了Ia区的假单胞菌外毒素(PE40)。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的作为导向部分的两分子串联连接的表皮生长因子序列是缺失了羧基末端3个氨基酸残基，并且以头一尾串联方式连接的表皮生长因子序列。
本发明的另一个目的是提供含有如上文限定的嵌合毒素及一种或多种医药上可接受的载体的药物组合物。
本发明的再一个目的涉及上述药物组合物在治疗恶性增生性疾病中的应用。
图1显示用于表达以表皮生长因子(EGF)为导向部分的重组PE40嵌合蛋白质的重组质粒pEGF50×2-PE40的构建策略。
图2显示本发明的EGF50×2-PE40(●)和按相似方法制备的EGF-PE40(△)对Hep2细胞的细胞毒活性比较。
图3显示本发明的EGF50×2-PE40和按相似方法制备的EGF-PE40置换与A431细胞结合之125I-EGF的能力比较。
本发明涉及修饰的靶特异性嵌合毒素，特别是涉及由表皮生长因子(EGF)与PE40融合而成的融合毒素，其中作为导向部分的EGF分子是以其缺失了C末端3个氨基酸残基的两分子串联形式连接到毒素部分上的。所说的导向部分与表面上带有EGF受体(EGFR)的靶细胞结合，并且促使融合分子内化到这些靶细胞中之后，融合分子的毒素部分即可有效地杀伤这些靶细胞肿瘤。
表皮生长因子(EGF)是由53个氨基酸组成的单链多肽。该因子广泛存在于人和哺乳动物的体液、汗腺细胞及血小板中，并具有介导上皮细胞生长、促进血管生成，以及促进成纤维细胞和内皮细胞增殖的功能。在许多肿瘤，特别是鳞状上皮癌及某些腺癌，如喉癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌及乳腺癌发生时，均表现有细胞表面EGF受体的过度表达(如参见Arteaga，CL．et al．，Cancer Res．54(17)4703-4709，1994)。有人发现鳞状上皮癌的复发及鳞癌病人的存活期与细胞EGF受体的表达水平密切相关(如参见Scambia，G．et al．，Cancer 671347-1351，1991；Yang，D．et al．，Clin．Cancer Res．4993，1998)。另外还有人发现，鳞状细胞癌组织中表皮生长因子受体(EGFR)的mRNA水平较正常粘膜上皮细胞约高69倍。并且证明了抑制EGFR基因的表达可阻止头颈部鳞癌细胞的增殖(Rubin，GA，et al．，Oncogene 15(4)409-416，1997)。早在八十年代末便有人使用EGF多肽作为导向分子，用于构建具有肿瘤细胞靶特异性的细胞毒性剂。此后，许多研究者针对毒素部分对整体融合蛋白质的细胞结合活性和细胞毒活性进行了许多深入研究。例如，Lee等人的研究表明，EGF与缺失Ia区的PE[PE(△Ia)，即PE40]结合所形成的融合分子EGF-PE40，较与天然PE66结合所形成的融合分子EGF-PE66具有更好的靶细胞特异性(Lee，CH，et al．，Protein Eng．6(4)433-440，1993)。
然而，考虑到EGF分子的结构特征，EGF与PE分子融合后所导致的分子折叠和其对融合蛋白质之三维结构的影响，以及融合蛋白质中作为导向部分的EGF与其细胞受体的结合几率和稳定性等因素，我们试图在按照现有技术对融合蛋白质的毒素部分进行必要的修饰的同时，特别对导向部分即EGF分子进行某些修饰。这些修饰包括删除EGF分子羧基末端的3个氨基酸残基、改变EGF与毒素分子特别是PE40分子间的连接方式。所说的改变导向部分与毒素部分间的连接方式则包括分别构建EGF50-EGF50-PE66、EGF50-EGF50-PE40、EGF50-PE40-EGF50及EGF50-PE40等四种不同结构形式的融合蛋白质，并使用MTT细胞增殖检测法(参见Mosman，T．，J．Immunol．Methods 6555-64，1983)比较了它们的靶细胞毒活性；使用膜受体结合置换试验法(参见Riemen et al．，Peptide 8877-885，1987)比较了它们的特异性受体结合活性。这里使用的缩写符号EGF50是指缺失C末端3个氨基酸残基的表皮生长因子多肽。
我们的实验研究发现，以两分子头-尾串联方式连接的EGF50作为导向部分，所制得的融合蛋白质具有更好的受体结合活性和细胞毒活性。
可使用天然PE分子(分子量为66KD)，作为靶特异性细胞毒性融合蛋白质的毒素部分，以减少嵌合毒素的非特异性细胞结合，进而改善毒素对携带EGFR的细胞的靶特异性毒性。另外，也可使用如美国专利5，621，078中所述的第265、287位半胱氨酸，或第265、287、372及379位半胱氨酸分别被丙氨酸取代的PE分子，或者如国际专利申请PCT／IL96／00151中所述的第57、546、247和249位上的一或几个氨基酸被谷氨酸取代的PE分子。
根据本发明，可以使作为导向因子的EGF直接或间接连接到毒素分子上。如果两个部分是间接连接的，最好在两个部分之间插入一个大约10～30个氨基酸的“接头序列”或间隔臂。所说的接头序列较好是由5～10个主链不超过4个碳原子并且不带苯环侧链的中性氨基酸(如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸)的2～3次重复的串联重复序列。但考虑到如上文所述的受体结合效率和结合稳定性，以及融合蛋白质的空间结构对受体结合和毒素分子内化的影响因素，最好使用头-尾串联的两分子EGF作为导向部分。在这种情况下，其中一个EGF分子将作为导向分子与细胞膜表面上的受体结合，而另一个分子则起到连接毒素分子的“间隔臂”的作用。
可使用本领域技术人员已知的基因融合技术或化学合成与偶联技术制备本发明的嵌合毒素蛋白质，但最好是使用基因融合技术。为此，例如可按照已知的DNA操作技术(如参见Sambrook et al．，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，1989)克隆并扩增编码EGF50和编码两分子串联之EGF50(EGF50×2)的核苷酸序列。然后将扩增的2×EGF50基因按正确方向连接到已经过或未经修饰的PE40分子的5’末端，并将所得嵌合基因插入到适当的表达载体系统中。或者，亦可从携带PE40基因的起始质粒(如pVC8)中切出所需的PE40基因，并将其连接到适当的中间载体如pET17b中，然后将携带PE40基因的载体与PCR扩增得到的EGF50或2×EGF50基因连接，环化后即得到携带EGF50-PE40或EGF2×50-PE40融合基因的重组表达载体。用如此得到表达载体转化适当的宿主细胞例如大肠杆菌细胞，然后在适当条件下培养被转化的细胞，以产生所需的融合蛋白质。可使用离子交换层析、大小排阻层析、疏水作用层析以及盐析、超滤等方法从细胞溶胞产物中分离并纯化蛋白质表达产物。产物的分离与纯化步骤中，可使用SDS-PAGE法和酶联免疫吸附法(ELISA)或Western印迹法监测纯化产物的存在及其分子大小。
可使用文献中已描述的各种检测方法鉴定本发明的2×EGF50-PE40及EGF50-PE40融合蛋白质的性质。这些方法包括(1)ADP核糖基化试验，该方法是根据EGF2×50-PE40或EGF50-PE40催化延伸因子2的ADP核糖基化的能力检测其对哺乳动物细胞蛋白质合成的抑制；(2)受体结合试验，该方法根据2×EGF50-PE40或EGF50-PE40竞争性置换与A431细胞浆膜结合之125I-EGF的能力检测其特异性受体的结合活性；(3)MTT细胞存活率试验，该方法是根据活细胞将MTT转化成兰紫色甲瓒结晶体的能力检测肿瘤细胞与2×EGF50-PE40或EGF50-PE40接触后的存活性。
本发明进一步涉及含有至少一种上述嵌合毒素和一种医药上可接受的惰性载体的药物组合物。可按照制药工业领域已知的基本原则制备适于胃肠道外途径给药的本发明的药物组合物(例如参见Remington’s Pharmaceutical Science，15th ed．，Mack Publishing Company，1980)。可通过各种给药途径，特别是静脉内、肌肉内、关节内、腹腔内、鼻内及其他空腔器官内、皮内、皮下等胃肠道外途径投用本发明的药物组合物。
可使用本发明的嵌合毒素蛋白质或含有该嵌合毒素蛋白质的药物组合物作治疗药物，用于治疗由可依靠该蛋白质的毒性作用缓解或消除的特定人体细胞引发的各种疾病。一种优选的用途是用于治疗其细胞表面上过量表达EGFR之细胞的恶性增生性疾病，如各种组织来源的鳞状细胞癌。本发明的嵌合毒素或含该嵌合毒素的药物组合物的治疗有效剂量一般将根据疾病的性质、严重程度、病人的一般状况和对药物的敏感性，以及给药途径等因素由临床医生确定。
下列实施例旨在进一步阐述本发明，而不构成对本发明待批权利要求的限制。
实施例12×EGF50-PE40嵌合毒素的制备A．分别用携带PE40基因的质粒载体pVC8(Chaudhary et al．，PNAS USA 844538-4542，1987)和pET-17b(Novagen)转化感受态大肠杆菌HB101。将被转化的细胞铺涂于含氨苄青霉素(50μg／ml)的普通培养基上37℃保温过夜。选择氨苄青霉素抗性菌落进行扩大培养后提取质粒DNA，并用XbaI+EcoRI分别消化质粒pVC8和pET-17b。用低溶点琼脂糖凝胶分离得到PE40核苷酸编码序列(1098bp)和较大的pET-17b载体DNA片段(3174bp)。然后在T4 DNA连接酶(Promega)存在下连接两片段，并用连接反应混合物转化大肠杆菌HB101。挑取单菌落，并在LB培养基中培养后，快速提取质粒DNA并进行酶切鉴定，然后对酶切鉴定为阳性的中间质粒进行DNA序列分析。将所得到的连接正确的中间质粒定名为pET17b-PE40。
B．使用DNA合成仪(Applied Biosystems Inc．)合成寡核苷酸引物15’-CGCATATGAACTCCGACTCCGAATGTC-3’(SEQ ID NO1)和引物25’-GCCATATGCCACCACTTCAAGTCTCT-3’(SEQ ID NO2)及引物35’-GACTTGAAGTGGTGGAACTCCGACTCCGAA-3’(SEQ ID NO3)。在5％甲酰胺和各50pmol引物1及2存在下，使用5ng pVC8／EGF作为模板，并使用热循环仪(Perkin Elmer Cetus Instruments)及提供的其他试剂进行聚合酶链反应(PCR)95℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃聚合1分钟，30次循环后，72℃延伸10分钟。在1．5％低熔点琼脂糖凝胶上回收长度约160bp的扩增产物EGF50。将5μg纯化的EGF50片段加入含100pmol引物3的扩增反应体系中，进行片段串联连接反应95℃变性1分钟，63℃退火延伸5分钟，5次循环后，分别加入50pmol的引物1和引物2，依前述条件扩增并回收长约320bp的扩增产物，即EGF50×2。
C．用NdeI分别酶切扩增的2×EGF50或EGF50片段，以及中间载体pET17b-PE40，并将NdeI酶切的EGF片段插入到用同样核酸内切酶切割的pET17b-PE40中。然后用连接反应混合物转化感受态大肠杆菌HB101。
在5％CO2环境下，37℃培养被转化的细胞。培养后收集Ampr菌落并使用上述寡核苷酸引物，按上文B中所述的反应条件进行PCR鉴定。从PCR鉴定阳性的菌落中提取质粒DNA，再次用PCR方法和酶切方法鉴定重组体中EGF或2×EGF的存在和其连接方向。选择连接方向正确的重组质粒，分别定名为pETEGF50-PE40和pETEGF50×2-PE40。使用T7测序试剂盒(Pharmacia)进行DNA序列测定，EGF核苷酸编码序列和PE40基因的嵌合DNA序列如SEQ IDNO4所示。两分子串联的EGF核苷酸编码序列和PE40基因的嵌合DNA序列如SEQ ID NO5所示。并根据SEQ ID NO5的DNA序列推导出EGF50×2-PE40的氨基酸序列(SEQ ID NO6)。
D．用如上制备的重组表达载体pET-EGF50×2-PE40转化大肠杆菌BL21(λDE3)，并在含有氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中培养被转化的大肠杆菌细胞。当培养物的OD600值约为0．6～0．8时加入IPTG至0．4mM以诱导融合蛋白质表达。诱导3小时后离心收集细胞并悬浮于TE缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8．0，1mM EDTA)中，超声破碎细胞并按Chaudhary等人(文献出处同上)所述的方法制备周质部分。收集所制得的细胞周质部分，并进行SDS-PAGE检测和Western印迹分析。在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离并染色后可见一条清晰的相当于52KD的泳带。Western印迹试验结果可见与兔抗PE40抗血清和抗EGF抗血清特异性反应的条带，从而初步证实细胞周质中2×EGF50-PE40嵌合毒素的存在及其分子大小。
依次使用连接到FPLC系统上的Mono Q(HR5／5)阴离子交换柱和SephacrylS-200柱(Pharmacia)纯化2×EGF50(或EGF)-PE40。纯化中使用0．2-0．3M的NaCl洗脱融合蛋白质，并根据ADP核糖基化活性和细胞毒活性检测和收集嵌合毒素的活性峰值部分。SDS-PAGE检测表明，毒素的纯度约为97％。使用牛血清白蛋白作为标准品，用福林酚试剂测定蛋白质浓度约为3mg／ml。对SDS-PAGE凝胶进行薄层扫描，表明融合蛋白质约占菌体总蛋白质的35％。
实施例22×EGF50-PE40嵌合毒素的生物学活性分析细胞毒活性检测-MTT细胞增殖试验将人喉癌Hep-2细胞(维持在添加有10％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、50u／ml青霉素和50μg／ml链霉素的Eagle氏极限基本培养基(MEM)中，按2×104个细胞／孔的细胞密度加至40孔细胞培养板的各孔内。37℃保温1小时后，在所有各孔内加入溶于PBS溶液(5mg／ml)，并过滤除菌的MTT(3-(4，5-二甲苯-2-噻唑)2，5-二苯基溴化四唑(Sigma)，并加入2×EGF50-PE40或EGF50-PE40，然后将培养板37℃保温4小时。保温后向各孔内加入100μl含10％SDS的10mMHCl溶液，并彻底混合均匀，待所有暗兰色结晶溶解后(约12小时)，检测570nm波长处吸光率(OD570)。试验中以单纯MEM培养基作为空白对照，并将其OD570设定为0。
图2中显示不同浓度(0．1-1000ng／ml)2×EGF50-PE40(●)和EGF50-PE40(△)对Hep-2细胞的细胞杀伤活性。根据活细胞内的隐酶(琥珀酸脱氢酶)将其摄入的MTT转化成为兰紫色结晶体甲瓒的能力，检测嵌合毒素蛋白质的细胞杀伤活性。结果可见，以两分子串联的EGF50作为导向部分的嵌合毒素(2×EGF50-PE40)对Hep-2细胞的EC50值约为50pM，而作为阳性对照的EGF-PE40的EC50值则为大约80pM。而且，随着毒素浓度的增加，前者的细胞毒活性仍有缓慢增加，而后者则基本上达到细胞毒活性平台。
在另一项MTT细胞增殖试验中，我们使用A431肿瘤细胞和正常哺乳动物CHO细胞进一步比较了两种不同结构形式的融合蛋白质对这些靶细胞的杀伤能力。结果显示两种形式的毒素蛋白均对表皮样肿瘤A431细胞有明显地杀伤活性，而对正常CHO细胞则基本上没有可检测的细胞毒性(数据未示出)。EGF受体结合试验简单地说，为了检测EGF肽与细胞膜表面EGF受体的结合，首先将A431细胞(约106个)悬浮于冰冷的检测缓冲液(10mM Tris-HCl，pH7．6，lmM DTT，0．1％牛血清白蛋白，1mM EDTA)中制备细胞匀浆，以2500×g4℃离心15分钟后收集上清，并再次以22，000×g离心30分钟(4℃)，然后收集细胞浆膜沉淀物并悬浮于上述缓冲液中4℃保存。
在有或没有未标记的EGF50或2×EGF50-PE40和EGF50-PE40存在下，将含有50μg浆膜蛋白质的等分样品(终体积100μl)与5mg放射性碘标记的EGF(125I-EGF，New England Nuclear)4℃保温2小时。保温后用上述检测缓冲液通过Whatman滤膜彻底洗样品，并用λ计数器检测浆膜结合的配体。在0．1mM未标记的EGF存在下确定非特异性结合。实验结果如图3所示。
图3显示部分纯化(Mono Q离子交换层析后)的2×EGF50-PE40(○)或EGF50-PE40(△)对A431细胞膜结合的125I-EGF的置换作用。其中B代表在竞争物2×EGF-PE40或EGF以所指出的浓度存在下，与浆膜结合的125I-EGF的量(cpm)；Bo代表没有竞争物存在时与细胞浆膜结合的125I-EGF的量(cpm)。
从图3所示的数据可以看出，向膜表面上带有EGF受体的肿瘤细胞配体-受体反应体系中加入渐增浓度的本发明部分纯化的2×EGF-PE40嵌合毒素后，随着嵌合毒素浓度的增加而逐渐取代细胞膜结合的125I-EGF。而且，与以单分子EGF连接的毒素分子相比，本发明的以两分子串联的EGF(2×EGF)表现有更好受体结合能力。
序列表(1)一般信息(Ⅰ)申请人中国人民解放军农牧大学(Ⅱ)发明名称包括修饰的导向部分的嵌合毒素(Ⅲ)序列数6(Ⅰ)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(Ⅱ)分子类型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID No1CGCATATGAA CTCCGACTCC GAATGTC(2)SEQ ID No2的信息(Ⅰ)序列特征(A)长度26碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(Ⅱ)分子类型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO2GCCATATGCC ACCACTTCAA GTCTCT(2)SEQ ID No3的信息(Ⅰ)序列特征(E)长度30碱基对(F)类型核酸(G)链型单链(H)拓扑结构线性(Ⅱ)分子类型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO3
GACTTGAAGT GGTGGAACTC CGACTCCGAA(2)SEQ ID NO4的信息(Ⅰ)序列特征(A)长度1254碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(Ⅱ)分子类型cDNA(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO4ATGAACTCCG ACTCCGAATG TCCATTGTCC CACGACGGTT ACTGTTTGCA CGACGGTGTTTGTATGTACA TCGAAGCTTT GGACAAGTAC GCCTGTAACT GTGTTGTTGG TTACATCGGTGAAAGATGTC AATACAGAGA CTTGAAGTGG TGGCATATGG CCGAAGAGGG CGGCAGCCTGGCCGCGCTGA CCGCGCACCA GGCTTGCCAC CTGCCGCTGG AGACTTTCAC CCGTCATCGCCAGCCGCGCG GCTGGGAACA ACTGGAGCAG TGCGGCTATC CGGTGCAGCG GCTGGTCGCCCTCTACCTGG CGGCGCGGCT GTCGTGGAAC CAGGTCGACC AGGTGATCCG CAACGCCCTGGCCAGCCCCG GCAGCGGCGG CGACCTGGGC GAAGCGATCC GCGAGCAGCC GGAGCAGGCCCGTCTGGCCC TGACCCTGGC CGCCGCCGAG AGCGAGCGCT TCGTCCGGCA GGGCACCGGCAACGACGAGG CCGGCGCGGC CAACGCCGAC GTGGTGAGCC TGACCTGCCC GGTCGCCGCCGGTGAATGCG CGGGCCCGGC GGACAGCGGC GACGCCCTGC TGGAGCGCAA CTATCCCACTGGCGCGGAGT TCCTCGGCGA CGGCGGCGAC GTCAGCTTCA GCACCCGCGG CACGCAGAACTGGACGGTGG AGCGGCTGCT CCAGGCGCAC CGCCAACTGG AGGAGCGCGG CTATGTGTTCGTCGGCTACC ACGGCACCTT CCTCGAAGCG GCGCAAAGCA TCGTCTTCGG CGGGGTGCGCGCGCGCAGCC AGGACCTCGA CGCGATCTGG 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GCTGGGAACA ACTGGAGCAGTGCGGCTATC CGGTGCAGCG GCTGGTCGCC CTCTACCTGG CGGCGCGGCT GTCGTGGAACCAGGTCGACC AGGTGATCCG CAACGCCCTG GCCAGCCCCG GCAGCGGCGG CGACCTGGGCGAAGCGATCC GCGAGCAGCC GGAGCAGGCC CGTCTGGCCC TGACCCTGGC CGCCGCCGAGAGCGAGCGCT TCGTCCGGCA GGGCACCGGC AACGACGAGG CCGGCGCGGC CAACGCCGACGTGGTGAGCC TGACCTGCCC GGTCGCCGCC GGTGAATGCG CGGGCCCGGC GGACAGCGGCGACGCCCTGC TGGAGCGCAA CTATCCCACT GGCGCGGAGT TCCTCGGCGA CGGCGGCGACGTCAGCTTCA GCACCCGCGG CACGCAGAAC TGGACGGTGG AGCGGCTGCT CCAGGCGCACCGCCAACTGG AGGAGCGCGG CTATGTGTTC GTCGGCTACC ACGGCACCTT CCTCGAAGCGGCGCAAAGCA TCGTCTTCGG CGGGGTGCGC GCGCGCAGCC AGGACCTCGA CGCGATCTGGCGCGGTTTCT ATATCGCCGG CGATCCGGCG CTGGCCTACG GCTACGCCCA GGACCAGGAACCCGACGCAC GCGGCCGGAT CCGCAACGGT GCCCTGCTGC GGGTCTATGT GCCGCGCTCGAGCCTGCCGG GCTTCTACCG CACCAGCCTG ACCCTGGCCG CGCCGGAGGC GGCGGGCGAGGTCGAACGGC TGATCGGCCA TCCGCTGCCG CTGCGCCTGG ACGCCATCAC CGGCCCCGAGGAGGAAGGCG GGCGCCTGGA GACCATTCTC GGCTGGCCGC TGGCCGAGCG CACCGTGGTGATTCCCTCGG CGATCCCCAC CGACCCGCGC AACGTCGGCG GCGACCTCGA CCCGTCCAGCATCCCCGACA AGGAACAGGC GATCAGCGCC CTGCCGGACT ACGCCAGCCA GCCCGGCAAACCGCCGCGCG AGGACCTGAA GTAA(2)SEQ ID NO6的信息(Ⅰ)序列特征(A)长度468氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(Ⅱ)分子类型蛋白质(Ⅲ)序列描述SEQ ID NO6Met-Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu-His-Asp-Gly-Val-Cys-Met-Tyr-Ile-Glu-Ala-Leu-Asp-Lys-Tyr-Ala-Cys-Asn-Cys-Val-Val-Gly-Tyr-Ile-Gly-Glu-Arg-Cys-Gln-Tyr-Arg-Asp-Leu-Lys-Trp-Trp-Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-Cys-Pro-Leu-Ser-His-Asp-Gly-Tyr-Cys-Leu-His-Asp-Gly-Val-Cys-Met-Tyr-Ile-Glu-Ala-Leu-Asp-Lys-Tyr-Ala-Cys-Asn-Cys-Val-Val-Gly-Tyr-Ile-Gly-Glu-Arg-Cys-Gln-Tyr-Arg-Asp-Leu-Lys-Trp-Trp-His-Met-Ala-Giu-Glu-Gly-Gly-Ser-Leu-Ala-Ala-Leu-Thr-Ala-His-Gln-Ala-Cys-His-Leu-Pro-Leu-Glu-Thr-Phe-Thr-Arg-His-Arg-Gln-Pro-Arg-Gly-Trp-Glu-Gln-Leu-Gly-Gln-Cys-Gly-Tyr-Pro-Val-Gln-Arg-Leu-Val-Ala-Leu-Tyr-Leu-Ala-Ala-Arg-Leu-Ser-Trp-Asp-Gln-Val-Asp-Gln-Val-Ile-Arg-Asn-Ala-Leu-Ala-Ser-Pro-Gly-Ser-Gly-Gly-Asp-Leu-Gly-Glu-Ala-Ile-Arg-Glu-Gln-Pro-Gln-Gln-Ala-Arg-Leu-Ala-Leu-Thr-Leu-Ala-Ala-Ala-Glu-Ser-Glu-Arg-Phe-Val-Arg-Gln-Gly-Thr-Gly-Asn-Asp-Gln-Ala-Gly-Ala-Ala-Asn-Ala-Asp-Val-Val-Ser-Leu-Thr-Cys-Pro-Val-Ala-Ala-Gly-Glu-Cys-Ala-Gly-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-Ala-Len-Len-Glu-Arg-Asn-Tyr-Pro-Thr-Gly-Ala-Glu-Phe-Len-Gly-Asp-Gly-Gly-Asp-Val-Ser-Phe-Ser-Thr-Arg-Gly-Thr-Gln-Asn-Trp-Thr-Val-Gln-Arg-Leu-Leu-Gln-Ala-His-Arg-Gln-Leu-Gln-Gln-Arg-Gly-Tyr-Val-Phe-Val-Gly-Tyr-His-Gly-Thr-Phe-Len-Gln-Ala-Ala-Gln-Ser-Ile-Val-Phe-Gly-Gly-Arg-Ala-Arg-Ser-Gln-Gln-Asp-Leu-Asp-Asp-Ala-Ile-Trp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Ile-Ala-Gly-Asp-Pro-Ala-Len-Ala-Tyr-Gly-Tyr-Ala-Gln-Asp-Gln-Gln-Pro-Asp-Ala-Arg-Gly-Arg-Ile-Arg-Asp-Gly-Ala-Len-Len-Arg-Val-Tyr-Val-Pro-Arg-Ser-Ser-Len-Pro-Gly-Phe-Tyr-Arg-Thr-Ser-Len-Thr-Len-Ala-Ala-Pro-Gln-Ala-Ala-Gly-Gln-Val-Gln-Arg-Len-Ile-Gly-His-Pro-Len-Pro-Len-Arg-Len-Asp-Ala-Ile-Thr-Gly-Pro-Gln-Gln-Gly-Gly-Arg-Len-Gln-Thr-Ile-Len-Gly-Trp-Pro-Len-Ala-Gln-Arg-Thr-Val-Val-Ile-Pro-Ser-Ala-Ile-Pro-Thr-Asp-Pro-Arg-Asn-Val-Gly-Gly-Asp-Len-Asp-Pro-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp-Lys-Gln-Gln-Ala-Ile-Ser-Ala-Len-Pro-Asp-Tyr-Ala-Ser-Gln-Pro-Gly-Lys-Pro-Arg-Gln-Asp-Len-Lys-end
权利要求
1．包括连接到截短的假单胞菌外毒素A蛋白质上的EGF序列的嵌合毒素，特征在于其中作为嵌合分子导向部分的EGF是以两分子串联方式连接到截短的毒素分子上的。
2．根据权利要求1的嵌合毒素，其中所说的以两分子串联连接的EGF是缺失了C末端3个氨基酸残基的EGF50。
3．根据权利要求1的嵌合毒素，其中所说的截短的假单胞菌毒素A是缺失了毒素分子中Ia区的PE40。
4．含有根据权利要求1至3中任一项的2×EGF50-PE40嵌合毒素及一种或几种医药上可接受的载体的药物组合物。
5．根据权利要求4的药物组合物在治疗恶性增生性疾病中的应用。
全文摘要
本发明涉及经过修饰而提高了受体结合活性的靶特异性嵌合毒素,特别是包括与假单胞菌外毒素PE40连接之表皮生长因子序列的嵌合毒素,其特征在于其中作为导向部分的EGF是两分子串联的截短形式的EGF50。本发明进一步涉及所说的嵌合毒素的制备及其在治疗恶性增生性疾病,特别是鳞状细胞癌中的应用。
文档编号A61K39/104GK1293202SQ9912190
公开日2001年5月2日 申请日期1999年10月13日 优先权日1999年10月13日
发明者朱平, 张国利 申请人:中国人民解放军农牧大学军事兽医研究所