专利名称：星形孢菌素衍生物在治疗眼睛新血管生成性疾病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明特别涉及星形孢菌素衍生物在制备用于治疗眼睛新血管生成性疾病例如视网膜新血管形成和脉络膜新血管生成的药物中的应用。
眼睛视网膜从两个血管床接收其血液供应，这两个血管床是供应内部三分之二视网膜的视网膜血管、和供应外部三分之一视网膜的脉络膜血管。在几种疾病的病变中会发生导致视网膜毛细血管关闭的损伤，这些疾病包括糖尿病性视网膜病、早熟性视网膜病、视网膜分支静脉闭塞、和中心视网膜静脉闭塞；它们统称为缺血性视网膜病。视网膜缺血导致释放一种或多种刺激新血管生成的血管生成因子。新血管会突破视网膜内表面的内界膜(ILM)，并沿着玻璃体外表面生长。它们要补充许多其它细胞，并生成对视网膜施加牵引力的血管片、细胞、和细胞外基质，而牵引视网膜经常导致视网膜脱离和严重失明。
脉络膜新血管生成在多种疾病、最常见的是老年黄斑变性的病变中发生。在该病症中，尤其用来适应急性和复杂视觉的黄斑由于光感受器和RPE细胞的逐渐死亡而受到损害。其构成了导致中央视觉逐渐损失的疾病的变性部分。细胞死亡的原因是未知的，并且当前没有任何治疗。当发生变性时，就有发生新血管从脉络膜生长以侵入RPE下和视网膜下空间的趋势。该过程称为脉络膜新血管生成(CNV)，并经常导致视觉由于出血和瘢痕形成而迅速且严重地损失。如果CNV的轮廓能被很好地划定、并且如果CNV在凹中心的下方(对于少数患者是这样的)，则激光治疗有时可有帮助。甚至当激光在最初是成功的时，也有很高的CNV复发比例，并导致视觉损失。需要针对刺激血管生长的治疗，这种治疗有益于患有视网膜或脉络膜新血管生成的患者。
本发明提供了治疗或预防眼睛新血管生成性疾病、包括视网膜新血管生成和脉络膜新血管生成的方法。该方法包括施用有效量星形孢菌素衍生物或其盐的步骤。
本发明使用星形孢菌素的治疗能高度有效地抑制和预防眼睛新血管生成，不像现有技术中的激光治疗仅具有有限的效力。此外，本发明星形孢菌素治疗施用简单，不像现有技术治疗方法，例如激光治疗有攻击性，并需要复杂装置。
本发明提供了治疗眼睛新血管生成性疾病的方法。本发明方法使用含有星形孢菌素衍生物的药物。现在令人惊奇地发现，式(I)化合物非常适用于治疗眼睛新血管生成性疾病、包括视网膜新血管生成和脉络膜新血管生成。
因此，本发明涉及式(I)化合物在制备用于治疗和/或预防眼睛新血管生成性疾病的药物中的应用 其中R代表烃基R0或酰基Ac。
合适的烃基包括最多总共具有优选30个、尤其是18个碳原子的开链、碳环、和碳环-开链烃基。其它合适的烃基是杂环基和杂环-开链基团。烃基(R0)可以是饱和或不饱和、以及取代或未取代基团。合适的酰基包括任选进行了官能修饰的羧酸和有机磺酸，和任选酯化的磷酸，例如焦磷酸或原磷酸。
优选的开链烃基包括C1-C20-烷基；其中羟基在除了1-位之外的任何位点的C2-C20羟基烷基；氰基-[C1-C20]-烷基；羧基-[C1-C20]-烷基；和其中自由价与双键不在相同碳原子上的C3-C20-链烯基。开链烃基的实例有低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基和庚基；低级链烯基，例如丙烯基、2-或3-甲代烯丙基和2-或3-丁烯基；低级链二烯基，例如1-戊-2，4-二烯基；和低级链炔基，例如炔丙基或2-丁炔基。优选的碳环烃基是单环、二环或多环环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、二环[2，2，2]辛基、2-二环[2，2，1]庚基和金刚烷基；环烯基；环二烯基；和相应的芳基。芳基包括苯基、萘基(例如1-或2-萘基)、联苯基(例如4-联苯基)、蒽基、芴基、甘菊环基、和它们具有一个或多个饱和环的芳香类似物。优选的碳环-开链基团是携带一个或多个碳环基团的开链基团。杂环基和杂环-开链基团包括具有芳香特征的单环、二环、多环、氮杂、硫杂、氧杂、硫氮杂、氧氮杂、二氮杂、三氮杂和四氮杂环状基团。
衍生自任选进行了官能修饰的羧酸的酰基(Ac1)的实例具有式Z-C(＝W)-，其中W是氧、硫、或亚氨基，且Z是氢、烃基R0、烃氧基R0O、或氨基。优选地，W是氧或硫，且Z是C1-C7烷基，尤其是C1-C4烷基，所述烷基可任选被卤素、羧基或C1-C4烷氧基羰基取代。另外优选的Z是苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、喹啉基、异喹啉基、苯并呋喃基或苯并咪唑基，所述基团分别未取代或者被C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素、硝基、三氟甲基、羧基、C1-C4烷氧基羰基、亚甲二氧基、氰基和/其盐取代。优选的Ac1酰基具有式Rb0-CO-，其中Rb0是氢、苯甲酰基或烃基，例如C1-C19烷基，所述烃基可任选被羧基、氰基、酯基、氨基或卤素取代。另一组优选的Ac1酰基具有式R0-O-CO-。再一组优选的Ac1酰基具有式 其中R1和R2独立地选自氢和未取代的开链C1-C7烃基，优选C1-C4烷基和C3-C7链烯基。R1和R2可独立地为最多具有10个碳原子的单环芳基、芳烷基或芳烯基，所述基团分别任选被C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素和/或硝基取代。在这组基团当中，特别可取的是其中R1为氢，R2为任选取代的C1-C4烷基、C3-C7链烯基、苯基、吡啶基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、喹啉基、异喹啉基、苯并呋喃基或苯并咪唑基的这类基团。
衍生自有机磺酸的酰基(Ac2)的实例具有式R0-SO2-，其中R0是烃基。优选地，该磺酸酰基的R0是C1-C7烷基、苯基、吡啶基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、喹啉基、异喹啉基、苯并呋喃基或苯并咪唑基，所述基团分别未取代或者被C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素、硝基、三氟甲基、羧基、C1-C4烷氧基羰基、亚甲二氧基、氰基和/其盐取代。
衍生自任选酯化的磷酸的酰基(Ac3)的实例具有式 其中R1和R2独立地选自氢和未取代的开链C1-C7烃基，优选C1-C4烷基和C3-C7链烯基。R1和R2可独立地为最多具有10个碳原子的单环芳基、芳烷基或芳烯基，所述基团分别任选被C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤素和/或硝基取代。
其它合适的星形孢菌素衍生物包括其中R衍生自下述α-氨基酸的式(I)星形孢菌素甘氨酸、苯基甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸和天冬氨酸、或它们的盐。Caravatti等人的US 5,093,330中进一步详细公开了适用于本发明的星形孢菌素衍生物。该专利中关于星形孢菌素衍生物的描述引入本发明以作参考。
用于本发明的特别优选的式(I)星形孢菌素衍生物包括N-(3-羧基丙酰基)星形孢菌素、N-苯甲酰基星形孢菌素、N-三氟乙酰基星形孢菌素、N-甲基氨基硫代羰基星形孢菌素、N-苯基氨基甲酰基星形孢菌素、N-(3-硝基苯甲酰基)星形孢菌素、N-(3-氟苯甲酰基)星形孢菌素、N-叔丁氧基羰基星形孢菌素、N-(4-羧基苯甲酰基)星形孢菌素、N-(3，5-二硝基苯甲酰基)星形孢菌素、N-丙氨酰基星形孢菌素、N-乙基星形孢菌素、N-羧基甲基星形孢菌素、N-[(叔丁氧基羰基氨基)乙酰基]星形孢菌素、N-(2-氨基乙酰基)星形孢菌素、和它们的可药用盐。
含有式I化合物作为活性组分的本发明药物组合物可经肠给药，经鼻给药，颊给药，直肠给药，局部给药，口服给药，和非胃肠道给药，例如静脉内给药、肌内给药、玻璃体内给药、结膜下给药或皮下给药，来治疗哺乳动物个体、尤其是人中的眼睛新血管生成。本发明组合物可仅含有活性组分，或者优选含有活性组分和可药用载体。活性组分的有效剂量取决于欲治疗疾病的类型、以及治疗对象的种类、年龄、体重和身体状况、药动学数据、和给药方式。
式I化合物以能有效地治疗哺乳动物例如人的病理状态的量给药。对于体重约为70kg的个体，日全身给药剂量为约0.1g-约20g、优选为约0.5g-约5g活性组分，合适的药物组合物可含有约1％-约95％活性组分。合适的单位剂型包括包衣和未包衣片剂、安瓿剂、小瓶装制剂、栓剂或胶囊。其它合适的剂型包括注射剂、眼内装置、玻璃体内装置、软膏剂、霜剂、糊剂、泡沫剂、酊剂、擦唇剂、滴眼剂、口服滴剂、喷雾剂、分散剂等。本发明药物组合物是通过本领域已知方法制得的，例如通过常规的混合、制粒、包衣、溶解或冷冻干燥方法制得。
优选使用活性组分的溶液、和悬浮液或分散液，尤其是等渗的溶液、和悬浮液或分散液。含有活性组分的合适的药物组合物可包含载体，例如甘露醇和淀粉、防腐剂、稳定剂、湿润剂、润滑剂、助溶剂、用于调节渗透压的盐、缓冲剂等。这样的组合物是通过本领域已知的方法制得的，例如通过常规的溶解和冷冻干燥方法制得。溶液或悬浮液形式的本发明组合物可含有增粘剂，例如羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、和明胶；和稳定剂，例如吐温80[聚氧乙烯(20)脱水山梨醇一油酸酯；ICI Americas，Inc，USA的商品名]。
合适的载体包括填充剂，例如糖，如乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制备物；磷酸钙，例如磷酸三钙和磷酸氢钙；粘合剂，例如淀粉、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮；和如果需要的话崩解剂，例如淀粉、交联聚乙烯吡咯烷酮、藻酸或其盐。其它合适的赋形剂是流动调节剂和润滑剂，例如硅酸、滑石、硬脂酸及其盐如硬脂酸镁或硬脂酸钙、聚乙二醇及其衍生物。
活性组分，即本发明星形孢菌素衍生物能完全或基本上完全抑制眼睛新血管生成、尤其是视网膜新血管生成和脉络膜新血管生成。此外，当把本发明化合物施用给个体时，也观察到了预防性效力。在每一治疗中，病变血管都明显且深深地被完全或近乎完全抑制，但是对成熟的视网膜血管却没有任何可辨认的毒性效应。
通过下述实施例进一步举例说明本发明。然而，这些实施例不是对本发明的限制。
治疗5天后，将小鼠处死，迅速地取出眼睛并在最佳切割温度包埋化合物(OCT；Miles Diagnostics，Elkhart，IN)中冷冻，或者固定在10％用磷酸盐缓冲的福尔马林中，并包埋在石蜡中。用药物或载体通过管饲法治疗成年C57BL6J小鼠，5天后，将它们处死，把它们的眼睛进行冷冻或石蜡切片处理。
用能选择性地结合内皮细胞的生物素化griffoniasimplicifolia凝集素B4(Vector Laboratories，Burlingame，CA)给药物治疗小鼠与对照小鼠眼睛的冷冻切片(10μm)进行组织化学染色。将载玻片在甲醇/H2O2中于4℃培养10分钟，用0.05M Tris-缓冲液盐水，pH 7.6(TBS)洗涤，在10％标准猪血清中培养30分钟。将载玻片与生物素化凝集素在室温培养2小时，用0.05M TBS洗涤后，将其与偶合有过氧化物酶的抗生物素蛋白(VectorLaboratories)在室温培养45分钟。用0.05M TBS洗涤10分钟后，将载玻片与二氨基联苯胺培养，以生成棕色反应产物。用苏木精给一些载玻片进行对比染色，并用Cytoseal固定。
为了进行定量评定，穿过每只眼睛的一半切割10μm系列切片，用凝集素将隔开大约50-60μm的切片染色，每只眼睛作13个切片以进行分析。用Axioskop显微镜(Zeiss，Thornwood，NY)检查凝集素染色切片，用3 CCD彩色电视照相机(IK TU40A，Toshiba，Tokyo，Japan)和帧接受器(frame grabber)将影像进行数字化处理。使用Image-Pro Plus软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)来描绘视网膜表面上的凝集素染色细胞的轮廓，并测定其面积。对于每只眼睛，将13个测定的平均值用作单个实验值。
与在浅和深的毛细血管床中显示出正常血管、并且有很少连接血管的非缺血性小鼠相比，用不合NBS的载体治疗的患有缺血性视网膜病的小鼠在整个视网膜都表现出显著增加的染色内皮细胞面积、并且在视网膜表面上有大的细胞丛。与载体治疗小鼠相比，每天接受一次600mg/kg NBS、接受5天治疗的缺血小鼠在视网膜表面和内部中的染色内皮细胞都有明显减少。实际上，对于用NBS治疗的缺血小鼠，其视网膜内的染色内皮细胞比非缺血小鼠还要少。高放大率表明在视网膜表面上没有任何可辨认的内皮细胞，这意味着新血管生成被完全抑制。在深层毛细血管床所正常位于的内核层和外丛状层中也醒目地没有内皮细胞。
每天通过管饲法接受2次300mg/kg或60mg/kg NBS的患有缺血性视网膜病的小鼠在视网膜表面上表现出一些新血管生成丛，但是比载体治疗对照小鼠的视网膜中的新血管生成丛少。NBS治疗小鼠的视网膜还表现出视网膜内染色内皮细胞的某些减少。影像分析的结果证实，对于每天用600或60mg/kg治疗一次的小鼠，其视网膜上和视网膜内的染色内皮细胞都比载体治疗小鼠有显著减少，并且当与每天治疗2次的小鼠比较时，其表现出与剂量有关的效应。这些结果清楚地证实了星形孢菌素衍生物能抑制视网膜新血管生成。
影像分析表明，NBS治疗小鼠与载体治疗小鼠的视网膜内染色内皮细胞的总面积或视网膜血管的外观没有任何不同。该分析还表明，在NBS治疗小鼠与载体治疗小鼠之间染色的视网膜内皮细胞的量没有任何不同。这证实了星形孢菌素衍生物对成熟血管没有毒性。
在第7天(年龄)，载体治疗小鼠中的视网膜血管几乎到达了视网膜的外周边缘，但是在NBS治疗小鼠中，视网膜血管仅伸展到比离外周的一半距离稍多处。在第10天(年龄)，浅的毛细血管床已完全形成，并伸展到视网膜外周边缘，深的毛细血管床仅部分形成。但是在NBS治疗小鼠中，浅的毛细血管床没有到达视网膜边缘。通过影像分析计算从视神经到血管前头的距离，在第7和10天(年龄)，治疗小鼠与对照小鼠之间的差异有统计学显著性。这表明了星形孢菌素衍生物能抑制视网膜血管的发展。
为了进行定量评定，用Axioskop显微镜(Zeiss，Thornwood，NY)检查凝集素染色切片，用3 CCD彩色摄相机(IK TU40A，Toshiba，Tokyo，Japan)和帧接受器将影像进行数字化处理。使用Image-ProPlus软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)来描绘轮廓，并测定视网膜下空间内的凝集素染色血管的面积。对于每一损伤，都是测定所有切片，其中是把切片上一些显现出的损伤加在一起以给出积分面积测定。对于每只小鼠，将获得的值平均以给出一个实验值。进行用于不等方差的2-样本t-检验来比较治疗小鼠与对照小鼠之间的对数平均积分面积。
激光照射2周后，这两组小鼠中的所有损伤都表现出在Bruch’s膜(具有与视网膜上面大体相等的损伤)中有间断。所有仅用载体治疗的小鼠都在各激光诱导的Bruch’s膜破裂位点表现出脉络膜新血管生成。沿着新血管的边缘有视网膜色素沉着内皮细胞的增殖。在视网膜上面看见了用凝集素染色的视网膜血管。与之相反，施用400mg/kg/天NBS的所有小鼠在各激光诱导的Bruch’s膜破裂位点都具有非常小的(若有的话)脉络膜新血管生成。在大多数例子中，在整个烧伤部位没有任何可辨认的凝集素染色新血管组织，但是一些烧伤部位包含其中有凝集素染色组织薄片的区域。RPE细胞有轻度增殖。在治疗小鼠的眼睛中脉络膜新血管生成有明显减少，而且视网膜上面的血管显得是正常的。在没有对比染色的切片中这是最佳观察效果。
对每一损伤所作的凝集素染色的积分面积的定量处理表明，与仅用载体治疗的小鼠中的损伤相比(0.0695621±0.0073960mm2)，用NBS治疗的小鼠中的损伤有显著下降(0.0090182±0.0017540mm2)。该差异有高度的统计学显著性(p＝0.004)。这些结果清楚地证实了星形孢菌素衍生物能显著地抑制脉络膜新血管生成。
上述实施例举例说明了本发明活性组分的效能。本发明星形孢菌素衍生物能高度有效地完全或基本上完全抑制视网膜和脉络膜新血管生成，本发明活性组分可通过常规和/或实用的药物治疗方式施用给患者。
权利要求
1.式(I)化合物或其盐在制备用于治疗和/或预防眼睛新血管生成性疾病的药物中的应用 其中R代表烃基R0或酰基Ac。
2.权利要求1的应用，其中所述烃基是开链、碳环、碳环-开链、杂环或杂环-开链烃基。
3.权利要求2的应用，其中所述开链烃基是C1-C20-烷基，其中羟基在除了1-位之外的任何位点的C2-C20羟基烷基，氰基-[C1-C20]-烷基，羧基-[C1-C20]-烷基，和其中自由价与双键不在相同碳原子上的C3-C20-链烯基。
4.权利要求2的应用，其中所述碳环烃基是单环、二环或多环环烷基；环烯基；环二烯基；和芳基。
5.权利要求2的应用，其中所述碳环-开链基团是携带一个或多个碳环基团的开链基团，所述杂环基和杂环-开链基团是具有芳香特征的单环、二环、多环、氮杂、硫杂、氧杂、硫氮杂、氧氮杂、二氮杂、三氮杂和四氮杂环状基团。
6.权利要求1的应用，其中所述酰基是任选进行了官能修饰的羧酸、有机磺酸，和任选酯化的磷酸。
7.权利要求6的应用，其中所述酰基具有式Z-C(＝W)-，其中W是氧、硫、或亚氨基，且Z是氢、C1-C7烷基、氨基、苯基、吡啶基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、喹啉基、异喹啉基、苯并呋喃基或苯并咪唑基。
8.权利要求6的应用，其中所述酰基具有式Rb0-CO-，其中Rb0是氢、苯甲酰基、或C1-C19烷基。
9.权利要求6的应用，其中所述酰基具有式R0-O-CO-，其中R0是开链、碳环、碳环-开链、杂环或杂环-开链烃基。
10.权利要求6的应用，其中所述酰基具有式 其中R1和R2独立地选自氢和未取代的开链C1-C7烃基。
11.权利要求6的应用，其中所述酰基具有式R0-SO2-，其中R0是烃基。
12.权利要求6的应用，其中所述酰基具有式 其中R1和R2独立地选自氢和未取代的开链C1-C7烃基。
13.权利要求1的应用，其中所述活性组分选自N-(3-羧基丙酰基)星形孢菌素、N-苯甲酰基星形孢菌素、N-三氟乙酰基星形孢菌素、N-甲基氨基硫代羰基星形孢菌素、N-苯基氨基甲酰基星形孢菌素、N-(3-硝基苯甲酰基)星形孢菌素、N-(3-氟苯甲酰基)星形孢菌素、N-叔丁氧基羰基星形孢菌素、N-(4-羧基苯甲酰基)星形孢菌素、N-(3，5-二硝基苯甲酰基)星形孢菌素、N-丙氨酰基星形孢菌素、N-乙基星形孢菌素、N-羧基甲基星形孢菌素、N-[(叔丁氧基羰基氨基)乙酰基]星形孢菌素、N-(2-氨基乙酰基)星形孢菌素、和它们的盐。
14.权利要求1的应用，其中所述活性组分是N-苯甲酰基星形孢菌素或其盐。
15.权利要求1的应用，其中所述治疗和/或预防是治疗和/或预防人的眼睛新血管生成性疾病。
16.权利要求1的应用，其中所述治疗和/或预防是治疗和/或预防人的视网膜新血管生成性疾病。
17.权利要求1的应用，其中所述治疗和/或预防是治疗和/或预防人的脉络膜新血管生成性疾病。
18.权利要求1的应用，其中所述治疗和/或预防是治疗和/或预防哺乳动物的眼睛新血管生成性疾病。
19.用于治疗或预防眼睛新血管生成性疾病的药物组合物，其中包含治疗有效量的权利要求1的式(I)化合物或其盐。
20.权利要求19的药物组合物，其中所述化合物是N-苯甲酰基星形孢菌素。
全文摘要
本发明提供了治疗或预防新血管生成的方法。所述方法包括施用有效量的星形孢菌素衍生物来治疗或预防视网膜或脉络膜新血管生成。
文档编号A61P27/02GK1328462SQ99813600
公开日2001年12月26日 申请日期1999年11月22日 优先权日1998年11月23日
发明者R·K·布拉泽尔, J·M·伍德, P·A·坎普奇亚罗, F·E·凯恩 申请人:诺瓦提斯公司