可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去除/灭活方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药及制品，尤其是可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材 料的病毒去除/灭活方法。
【背景技术】
[0002] 生物制品/生物材料FSP(FibrinSealantPatch)是一种止血用的生物材料，可 用于手术和急救场合的辅助止血、创伤封闭等目的。具有易使用、易携带、止血迅速、可被人 体完全吸收、人体相容性好、副作用小等特点。由于其主要成分中含有源自血浆的纤维蛋白 原和凝血酶以及来源于富含胶原组织的胶原蛋白，因此具有潜在的病毒感染的风险。为了 尽可能地降低和（或）消除这种风险，需要在其制造工艺中加入病毒灭活的处理步骤。
[0003] 目前应用较多的去除/灭活病毒方法有巴氏消毒法、干热法、有机溶剂/去污剂处 理法、膜过滤法、低pH孵化法。这些方法有的只能针对特定类型的病毒，如有机溶剂/去污 剂处理法；有的方法由于其灭活条件的要求，只能用于少数特定的制品生产工艺，如低pH 孵放法、干热法等。随着技术的进步，新的去除/灭活病毒方法不断出现，例如亚甲基蓝光 照法、紫外照射法、臭氧去除/灭活法、Y射线辐射法等。这些方法在一些产品生产工艺中 取得了积极的去除/灭活病毒效果，尤其是针对一些不适宜使用常规方法的生物制品/生 物材料。同时新方法的使用，也能起到缩短工艺步骤、节约生产成本、简便生产操作等作 用。
[0004] 考虑到各种病毒灭活方法都存在一定的局限性，也为了尽量减少病毒对生物制品 /生物材料感染的风险，在生产过程中一般要求采用的病毒去除/灭活方法必须能去除/灭 活各种类型的病毒，包括脂包膜病毒、非脂包膜、DNA病毒、RNA病毒以及细小病毒等。
[0005] 现有技术中也存在许多关于病毒去除/灭活的方法：
[0006]CN102210854B猪纤维蛋白原冻干加热病毒灭活的方法
[0007] CN102286095B纤维蛋白原的制备方法
[0008]CN102295696B由冷沉淀制备凝血因子VIII、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法
[0009] CN103785065A-种软骨再生支架材料的制备方法
[0010]CN87101294A免疫球蛋白溶液的巴氏灭菌法
[0011] CN1448407A静脉注射用人免疫球蛋白的生产工艺
[0012] CN101974070B-种人凝血酶原复合物的制备工艺
[0013]CN102036740A过滤方法
[0014]USP5116950Processforheattreatingfibrinogen
[0015]USP5639730Methodofproducingavirus-safebiologicalpreparation
[0016] 上述专利中，USP5116950和USP5639730采用的干热方法灭活病毒，它们是针对纤 维蛋白原或其他凝血因子在溶液状态或西林瓶装冻干粉时进行灭活。专利CN102210854B是在65±2°C时加热140±1小时灭活猪纤维蛋白原西林瓶装冻干粉中的病毒。专利 CN102286095B和CN102295696B虽然不是专门针对血液制品的病毒灭活，但在其权利要 求书中提到l〇〇°C加热30分钟灭活病毒。专利CN103785065A是一种生物材料的制备 方法，同其他一些膜状材料类似，其采用的是过氧乙酸-乙醇浸泡灭活病毒的方法。专利 CN87101294A采用低pH值和巴氏消毒法相结合，两种方法同时对免疫球蛋白进行病毒灭 活。专利CN1448407A采用60°C加热10小时的巴氏消毒法灭活免疫球蛋白中的病毒。专利 CN101974070B中凝血酶原制备中采用S/D法和99. 5±0. 5°C干热30分钟的方法灭活病毒。 专利CN102036740A涉及蛋白制剂中间品的病毒去除的过滤方法。不同产品所采用的病毒 去除/灭活方法不一样，效果也不同。
【发明内容】
[0017] 本发明所要解决的技术问题是提供一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生 物材料的病毒去除/灭活方法，具有操作简便、效果显著、成本较低的优点。
[0018] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种可被生物机体吸收的止血生物 制品/生物材料的病毒去除/灭活方法，凝血酶溶液、胶原蛋白溶液和纤维蛋白原溶液制得 止血生物制品/生物材料，病毒去除/灭活方法包括以下步骤中的一种或多种：
[0019] (a)利用S/D法去除原料血浆中的病毒，然后从原料血浆中提取得到凝血酶并制 成凝血酶溶液，利用过滤法去除凝血酶溶液中的病毒；
[0020] (b)利用低pH孵放法对胶原蛋白溶液中的病毒进行灭活；
[0021] (c)利用S/D法或巴斯德消毒法对纤维蛋白原溶液中的病毒进行去除/灭活；
[0022] (d)利用干热法对止血生物制品/生物材料进行病毒灭活。
[0023] 本发明针对的产品为海绵状或膜状的生物材料，它的主要成分含纤维蛋白原、凝 血酶、白蛋白、第XIII凝血因子以及胶原蛋白；其辅助成分含糖、糖醇、氨基酸、盐、PEG或 其衍生物、维生素等。本发明的病毒灭活产品不仅包含纤维蛋白原、凝血酶和胶原蛋白，而 且还首次将干热法用于海绵状或膜状的生物材料灭活病毒。本发明采用多种对病毒的去除 /灭活方式，有效去除/灭活生物制品/生物材料FSP成品中潜在的各种脂包膜病毒和非脂 包膜病毒，而且这几种方法都是操作简便、效果显著、成本较低的病毒去除/灭活方法。
[0024] 干热法灭活病毒的验证
[0025] 在生物制品/生物材料FSP生产过程中的纤维蛋白原、凝血酶、胶原蛋白等原液 中加入脑心肌炎病毒、Sindbis病毒、伪狂犬病毒和猪细小病毒等四种指示病毒（其中含有 脂包膜病毒和非脂包膜病毒），真空冷冻干燥，将FSP装入包装盒和包装袋中密封，然后于 100土 1°C干热处理30分钟。加热后将FSP剪碎，按lOml/cm2加入0. 9%氯化钠溶液37°C 水浴30分钟，检测浸提液中病毒滴度。4种指示病毒的灭活效果如表1所示，均大于4Lg， 符合国家相关规定要求，达到了病毒灭活的效果。
[0026] 表1生物制品/生物材料FSP干热灭活病毒的滴度结果
[0027]
【主权项】
1. 一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去除/灭活方法，其特征 在于，凝血酶溶液、胶原蛋白溶液和纤维蛋白原溶液制得止血生物制品/生物材料，病毒去 除/灭活方法包括以下步骤中的一种或多种： (a) 利用S/D法去除原料血浆中的病毒，然后从原料血浆中提取得到凝血酶并制成凝 血酶溶液，利用过滤法去除凝血酶溶液中的病毒； (b) 利用低pH孵放法对胶原蛋白溶液中的病毒进行灭活； (c) 利用S/D法或巴斯德消毒法对纤维蛋白原溶液中的病毒进行去除/灭活； (d) 利用干热法对止血生物制品/生物材料进行病毒灭活。
2. 根据权利要求1所述的一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去 除/灭活方法，其特征在于：所述S/D法为在溶液中加入有机溶剂/去污剂聚山梨酯80至 0? 5 % ?2. 0 % (V/V)或 TritonX-100 至 0? 5 % ?2 % (V/V)和磷酸三丁酯至 0? 1 % ?0? 5 % (V/V)，搅拌均匀后于16?30°C孵育1?10小时。
3. 根据权利要求1所述的一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去 除/灭活方法，其特征在于：所述巴斯德消毒法为让溶液于50?80°C中加热4?12小时。
4. 根据权利要求1所述的一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去 除/灭活方法，其特征在于：利用巴斯德消毒法对纤维蛋白原溶液去除/灭活病毒时，在纤 维蛋白原溶液中添加蔗糖、白蛋白、精氨酸或盐酸精氨酸、氯化钠、柠檬酸三钠作为保护剂。
5. 根据权利要求1所述的一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去 除/灭活方法，其特征在于：所述过滤法为利用滤膜将溶液过滤去除病毒的方法。
6. 根据权利要求5所述的一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去 除/灭活方法，其特征在于：所述低pH孵放法为将溶液于pH2. 5?4. 5环境下放置0. 5? 24天。
7. 根据权利要求1所述的一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒 去除/灭活方法，其特征在于：所述干热法为将产品置于80?10(TC环境加热0. 5?72小 时。
8. 根据权利要求1所述的一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去 除/灭活方法，其特征在于：所述止血生物制品/生物材料的制备方法步骤： (1) 将纤维蛋白原溶液在模盒中冷冻形成第一固体； (2) 在冻结的第一固体上喷洒凝血酶溶液，并迅速冷冻形成第二固体； (3) 在冻结的第二固体上倒入胶原蛋白溶液，并迅速冷冻形成第三固体； (4) 将冻结的第三固体于冻干机内真空冷冻干燥即得到止血生物制品/生物材料。
9. 根据权利要求1所述的一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去 除/灭活方法，其特征在于：所述止血生物制品/生物材料用于手术和急救中的辅助止血、 封闭和粘合。
【专利摘要】一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去除/灭活方法，包括以下步骤中的一种或多种：(a)利用S/D法去除原料血浆中的病毒，然后从原料血浆中提取得到凝血酶并制成凝血酶溶液，利用过滤法去除凝血酶溶液中的病毒；(b)利用低pH孵放法对胶原蛋白溶液中的病毒进行灭活；(c)利用S/D法或巴斯德消毒法对纤维蛋白原溶液中的病毒进行去除/灭活；(d)由上述(a)、(b)、(c)中的凝血酶溶液、胶原蛋白溶液和纤维蛋白原溶液制得止血生物制品/生物材料，利用干热法对止血生物制品/生物材料进行病毒灭活。本发明采用多种对病毒的去除/灭活方式，有效去除/灭活生物制品/生物材料FSP成品中潜在的各种脂包膜病毒和非脂包膜病毒，而且这几种方法都是操作简便、效果显著、成本较低的病毒去除/灭活方法。
【IPC分类】A61L15-32, A61L2-04, A61L2-00, A61L2-18, A61L2-02, A61L101-32
【公开号】CN104524603
【申请号】CN201410853989
【发明人】黄志霞, 李若冰, 万德夫, 付岩霖, 朱晋辉, 李敏, 万华印
【申请人】广州市拜特凇医药科技有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月30日