一种1,2,4-三嗪并嘧啶二酮类化合物作为hCBS酶抑制剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种hCBS酶抑制剂的应用。
【背景技术】
[0002] 人体内源性的H2S气体分子参与并调控很多生理和病理过程，为重要的信号转导 通路的调控分子。在结肠癌、神经退行性疾病、缺血性中风、低血压、高血压和胰腺炎等很多 病理条件下，内源性H 2S含量都发现有异常变化。因此，目前需要内源性H2S信号的特异抑 制剂或激活剂作为分子探针工具去进一步阐述H 2S的生理功能，和治疗与H2S-相关的疾病 的小分子药物先导物。
[0003] CBS (cystathionine β-synthase,胱硫醚-β -合成酶）是一种 PLP-依赖型（ρ yridoxal-5' -phosphate-dependent)酶，即维生素 B6依赖型酶。在人体内，CBS催化底物 L-半胱氨酸（Cysteine)和L-同型半胱氨酸（L-Homocysteine)产生内源性H2S气体。在 循环休克、中风、唐氏综合症和癌症病人或模型动物的体内已发现过量的H 2S和/或CBS活 性的增强，因此，hCBS (human CBS)已经被认为是治疗循环休克、中风、唐氏综合症以及肿 瘤等与H2S相关的疾病的潜在靶标。
[0004] 已知的hCBS小分子抑制剂，不仅与酶的结合力弱而且选择性也很低，因为他们对 其它维生素 B6-依赖型酶也有抑制作用。因此，急需筛选出特异性的hCBS抑制剂，可作为 "工具药"去证实已发现的H 2S的生物学效应和信号通路作用，同时也可作为药物研发的先 导化合物。
[0005] 目前，酶抑制剂的发现主要通过两种方法，即生物筛选和合理药物设计。基于靶点 的合理药物设计就是通过对药物作用的靶点进行研究，找到新的、合适的药物来治疗某些 疾病。发现一个的靶点往往就能设计出一类新药，在新药研究领域也是极受重视的。
[0006] 深入认识酶结构，特别是当它与特异性抑制剂复合时的结构，将会产生一种鉴定 该酶中结合位点的方法，并获得酶/抑制剂复合物以及该酶中敏感残基的构象，这些知识 对药物设计和优化方法来讲都是至关重要的。
[0007] hCBS纯酶3D晶体结构已被报道，这为其靶向抑制剂的设计提供了一定的结构基 础，但是与底物-结合相关的氨基酸残基还不清楚。
[0008] 因此，本领域的技术人员致力于研究hCBS酶促反应的抑制剂以及这种抑制剂作 为研究治疗循环休克、中风、唐氏综合症和肿瘤等与H 2S相关的疾病的药物的先导化合物的 应用。
【发明内容】
[0009] 本发明中所用缩写如下：
[0010] hCBS 指人源胱硫醚-β -合成酶，即 human cystathionine β -synthase ;
[0011] 0丁咄指5,5'-二硫代二（2-硝基苯甲酸)，即5,5'-0行111〇1^8-(2-11行1'(*61^〇1。 acid)；
[0012] Tris-HCl 指三轻甲基氨基甲烧盐酸盐，即 Tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride；
[0013] EDTA 指乙二胺四乙酸，即 Ethylene Diamine Tetraacetic Acid ;
[0014] L-Cys 指 L-半胱氨酸，即 L-Cysteine ;
[0015] D, L-HCys 指 D, L-同型半胱:氛酸，即 D, L-Homocysteine ;
[0016] SAM 指 S-腺苷甲硫氨酸，即 S-adenosyl methionine ;
[0017] PLP 指憐酸批咳醒，即 pyridoxal-5' -phosphate ;
[0018] HepG2 细胞指人肝癌细胞系，即 a human liver carcinoma cell line ;
[0019] 1，6-二甲基[1，2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(lH，6H)-嘧啶二酮，即 I, 6-dimethylpyrimido [5, 4-e] [I, 2, 4] triazine-5, 7 (1H, 6H)-dione ；
[0020] 1,6-二甲基-3-苯基[1，2,4]三嗪并[5,4-6]-5,7(1!1，6!1)-嘧啶二酮，即1，6-(1 imethyl-3-phenylpyrimido[5, 4-e][I, 2, 4]triazine-5, 7(1H, 6H)-di one ；
[0021] 6-甲基[1,2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(lH，6H)-嘧啶二酮，即 6_methylpyrimido[5, 4_e] [1，2, 4]triazine_5, 7(1H，6H)_dione〇
[0022] 蝶啶-2,4(3H，8H)-二酮，即 pteridine-2, 4(3H, 8H)-dione。
[0023] HepG2 细胞指人肝癌细胞系，即 a human liver carcinoma cell line ;
[0024] 本发明中用 Compd.2 指代 1，6-二甲基[1，2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(lH，6H)-. 啶二酮；
[0025] 用 Compd.5 指代 1，6-二甲基-3-苯基[1，2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(lH，6H)-. 啶二酮；
[0026] 用 Compd 6 指代 6 -甲基[1，2, 4 [三嗪并[5, 4-e]-5, 7 (1H，6H)_ 嘧啶二酮；
[0027] 用 Compd. 7 指代蝶啶-2, 4 (3H，8H)-二酮。
[0028] 本发明中所提到的酶促反应容器能够容纳H2S气体检测容器，即气体检测容器能 够置入酶促反应容器中，以使酶促反应产生的H 2S气体能够全部扩散进入检测体系。
[0029] 本发明公开了一种1，2, 4-三嗪并嘧啶二酮类化合物作为hCBS酶抑制剂的应用， 该化合物是1，6 -二甲基[1，2, 4]三嗪并[5, 4-e]-5, 7 (1H，6H)-嘧啶二酮，结构式如（I)所 不，分子量191. 19。
[0030]
【主权项】
1. 一种1，2, 4-三嗪并嘧啶二酮类化合物作为hCBS酶抑制剂的应用，该化合物是 1，6_二甲基[1，2,4]三嗪并[5,4-6]-5,7(111，611)-嘧啶二酮，结构如式（1)所示，分子量 193. 16 ：
2. -种抑制离体hCBS酶促反应的方法，其步骤如下： 步骤一、配制缓冲溶液：在酶促反应容器中配置Tris-HCl浓度为50mM，PLP浓度为 100iiM，hCBS-413浓度为50-500nM，L-Cys浓度为4mM，D,L-HCys浓度为4mM的去离子水溶 液，pH为 7. 6-9. 0 ; 步骤二、配制酶促反应混合液：将化合物1，6 -二甲基[1，2, 4]三嗪并 [5, 4-e]-5, 7 (1H，6H)_嘧啶二酮分别加入到步骤一所配制的缓冲溶液中，配制成不同浓度 的酶促反应混合液，形成酶促反应体系； 步骤三、配制H2S气体检测体系： 在H2S气体检测容器中，加入50yL的DTNB溶液，所述DTNB溶液为：DTNB浓度为 300iiM，Tris-HCl浓度为262mM，EDTA浓度为13mM，pH=8. 9的去离子水溶液，形成H2S气体 检测体系，将气体检测容器置入酶促反应容器中，以使酶促反应产生的H2S气体能够扩散进 入气体检测体系； 步骤四、孵育过程： 用封板膜密封酶促反应容器，在37°C下孵育60分钟； 步骤五、化合物1，6_二甲基[1，2,4]三嗪并[5,4-6]-5,7(111，611)-嘧啶二酮作为hCBS抑制剂应用效果的检测： 在酶标仪上测定H2S气体检测体系在413nm下的光吸收。
3. 如权利要求2所述的方法，其中，步骤一中所述pH=8. 6。
4. 如权利要求2所述的方法，其中，步骤一中所述hCBS-413浓度为100nM。
5. 如权利要求2所述的方法，其中，步骤二中所述化合物1,6-二甲基[1，2, 4]三嗪并 [5, 4-e] -5, 7 (1H，6H)-嘧啶二酮的浓度为 0-400iiM。
6. 如权利要求2所述的方法，其中，步骤二中所述化合物1,6-二甲基[1，2, 4]三嗪并 [5, 4-e] -5, 7 (1H，6H)-嘧啶二酮的浓度为 12iiM。
7. -种抑制细胞内hCBS酶抑制剂的方法，其步骤如下： 步骤一、将人源H印G2培养在由氨基酸营养液中孵育一天后，将化合物1，6-二甲基 [1，2, 4]三嗪并[5, 4-e]-5, 7 (1H，6H)-嘧啶二酮加入到所述氨基酸营养液中，进行共孵育； 然后，用冷的Tris-HCl缓冲液将细胞洗涤两次，并用细胞刮刷收集；收集的细胞在裂解缓 冲液中，先用液氮冷冻，然后在37°C下解冻2分钟，此冷冻、解冻操作重复3次；之后，裂解 液在转离心机上离心1小时后，收集上层清液。作为H印G2细胞溶液进行下一步实验；所述 Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，pH=8. 6 ; 步骤二、在酶促反应容器中加入步骤一中得到的H印G2细胞溶液，然后加入PLP浓度为 100iiM、SAM浓度为200iiM的去离子水溶液20iiL和L-Cys浓度为4mM、D,L-HCys浓度为 4mM的去离子水溶液； 步骤三、配制H2S气体检测体系： 在H2S气体检测容器中，加入50yL的DTNB溶液，所述DTNB溶液为：DTNB浓度为 300iiM，Tris-HCl浓度为262mM，EDTA浓度为13mM，pH=8. 9的去离子水溶液，形成H2S气体 检测体系；将气体检测容器置入酶促反应容器中，以使酶促反应产生的H2S气体能够扩散进 入气体检测体系； 步骤四、孵育过程： 用封板膜密封酶促反应容器，在37°C下孵育60分钟； 步骤五、化合物1，6_二甲基[1，2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(lH，6H)-嘧啶二酮作为细 胞内hCBS酶抑制剂应用效果的检测： 在酶标仪上测定H2S气体检测体系在413nm下的光吸收。
8. 如权利要求7所述的方法，其中，步骤一中加入的1,6-二甲基[1，2, 4]三嗪并 [5, 4-e] -5, 7 (1H，6H)-嘧啶二酮的最终浓度 10iiM、1iiM、0. 1iiM或 0? 05iiM。
9. 一种如权利要求1所述的1，2, 4-三嗪并嘧啶二酮类化合物在治疗循环休克、中风、 唐氏综合症和肿瘤的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种1,2,4-三嗪并嘧啶二酮类化合物作为hCBS酶抑制剂的应用，具体涉及化合物1,6–二甲基[1,2,4]三嗪并[5,4-e]-5,7(1H，6H)-嘧啶二酮作为hCBS酶抑制剂的应用。该小分子化合物对离体hCBS酶促反应的IC50为12μM，可以作为研究H2S信号通路的工具药，以及开发治疗循环休克、中风、唐氏综合症和肿瘤等与H2S相关的疾病的药物的先导化合物。
【IPC分类】A61K31-53, A61P9-00, C12Q1-527, A61P9-10, A61P35-00, C12Q1-02, A61P25-00
【公开号】CN104546860
【申请号】CN201310466969
【发明人】吴方, 周越洋, 于晶
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月9日