一种海绵细胞膜提取物及其作为血管紧张素转化酶抑制剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种海绵细胞膜提取物，以及该种海绵细胞膜提取物作为血管紧张素 转化酶抑制剂的应用。
【背景技术】
[0002] 海绵是世界上第一也是最原始的多细胞动物，其种类至今已发展到1万多种，占 海洋动物种类的1/15,是一个庞大的海洋"家族"。正是由于其数量巨大，种类众多，为海洋 天然产物的研究提供了可能。
[0003] 八十年代初用于海绵天然产物的活性研究的样品主要是萃取混合物，如刘锡金、 方振生等研究了一些海绵萃取液的生物活性。在其论文中所涉及的方法虽然对进一步分离 得到相关的活性物质有一定指导作用，但还是会忽略海绵中可能存在的其它活性物质。目 前已经从海绵中发现的天然产物包括留醇、萜类、脂肪醇甘油醚、生物碱和长链酰胺等。除 此之外，也在海绵中发现了大量具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性物质。但整体说来，我国对 海绵的研究还处于起步阶段，不但分离出来的生理活性物质较少，而且也还没有发现真正 能应用于临床的药物。
[0004] 血管紧张素转化酶（Angiotensin Converting Enzyme,简称ACE)，主要参与的是 肾素-血管紧张素-醛固酮系统的调节。ACE在催化血管紧张素 I (angiotensin I)转变 为具有强效升高血压作用的物质--血管紧张素 II (angiotensin II)。因此，寻找抑制 ACE活性的物质和组分是扩张外周血管、降低总外周阻力和降低血压的重要途径。
[0005] 心脑血管疾病是威胁当代人类健康的主要疾病，高血压是其中的分类体征之一， 面对高血压发病率的不断增长，越来越多的医药研究致力于血管紧张素转化酶抑制剂 (Angiotensinconverting enzyme inhibitor,简称ACEI)的发现与研发，而在此过程中实 现抑制剂降压效果体外检测的重要途径就是测试其对ACE活性的抑制作用。
【发明内容】
[0006] 本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种海绵细胞膜提取物，以 及该种海绵细胞膜提取物作为血管紧张素转化酶抑制剂的应用。
[0007] 本发明的技术解决方案是：一种海绵细胞膜提取物，其特征在于：所述的海绵细 胞膜提取物按照以下步骤制备获得： a、 用纯水清洗去冰冻的海绵组织表面的杂物，将海绵组织粉碎并匀浆，获得海绵匀浆， b、 将海绵匀浆与纯水按照1:1的体积比混合获得稀释海绵匀浆，向稀释海绵匀浆中加 入蛋白酶K溶液以获得混合溶液，使混合溶液中蛋白酶K的浓度范围在200. 0~270. 0 //g/ mL之间，在52~57°C的温度下使混合溶液酶解80~95min，获得海绵酶解浆液，对海绵酶解浆 液进行过滤，去除滤渣，获得海绵酶解液， c、 将海绵酶解液在6~12°C的温度下以600g离心4~8min，弃去上清液得到沉淀组分A1, 将A1用纯水溶解后，再一次在6~12°C的温度下以600g离心4~8min，弃去上清液得到沉淀 组分A2，将A2用纯水溶解后置入匀浆器中，以间隔30s的方式均质化120s，然后在6~12°C 的温度下以600g离心15min，弃去沉淀得到上清液B1，将上清液&在2~6°C的温度下以 15000g离心20~25min，弃去沉淀得到上清液B 2，将上清液氏在2~6°C的温度下以IOOOOOg 离心40~50min，弃去上清液得到沉淀组分A3，沉淀组分A3即为海绵细胞膜提取物。
[0008] -种如上所述的海绵细胞膜提取物，其特征在于：所述的海绵细胞膜提取物作为 血管紧张素转化酶抑制剂的应用。
[0009] 所述的海绵组织选用南海多皱软海绵的海绵组织。
[0010] 本发明同现有技术相比，具有如下优点： 本申请所公开的海绵细胞膜提取物的制备方法具有快速、提取效率高等特点，并且该 提取物来自于海洋中的天然产物一海绵，属于非经济类生物，其经济成本较低，容易获 得。另外，本提取物与其他同类的天然提取物相比，具有高ACE酶抑制活性，效果更好。综 上所述，本方法以及利用本方法制备的提取物具有多种优点，特别适合于在本领域中推广 应用，其市场前景十分广阔。
【附图说明】
[0011] 图1为本发明实施例的海绵细胞膜提取物在荧光显微镜下的图片。
[0012] 图2为不同浓度下的海绵细胞膜提取物与ACE酶抑制活性的关系曲线。
【具体实施方式】
[0013] 下面将结合【附图说明】本发明的【具体实施方式】。如图1、图2所示：一种海绵细胞膜 提取物，按照以下步骤制备获得：首先用纯水清洗去冰冻的海绵组织表面的杂物，将海绵组 织粉碎并匀浆，获得海绵匀浆；将海绵匀浆与纯水按照1:1的体积比混合，获得稀释海绵匀 浆，向稀释海绵匀浆中加入蛋白酶K溶液，并混合均匀，最终保证混合溶液中蛋白酶K的浓 度范围在200. 0~270. 0 //g/mL之间，并在52~57°C的温度下使混合溶液酶解80~95min，获 得海绵酶解浆液，对海绵酶解浆液进行过滤，去除滤渣，获得海绵酶解液；将海绵酶解液在 6~12°C的温度下以600g离心4~8min，弃去上清液得到沉淀组分A 1，将A1用纯水溶解后，再 一次在6~12°C的温度下以600g离心4~8min，弃去上清液得到沉淀组分A 2，将^用纯水溶 解后置入匀浆器中，以间隔30s的方式均质化120s，然后在6~12°C的温度下以600g离心 15min，弃去沉淀得到上清液B 1，将上清液&在2~6°C的温度下以15000g离心20~25min，弃 去沉淀得到上清液B2，将上清液氏在2~6°C的温度下以IOOOOOg离心40~50min，弃去上清 液得到沉淀组分A 3，沉淀组分A3即为海绵细胞膜提取物。
[0014] 利用上述方法所获得的海绵细胞膜提取物，可以作为血管紧张素转化酶(ACE酶） 的抑制剂而应用。下面利用上述的海绵细胞膜提取物进行血管紧张素转化酶(ACE酶)的抑 制活性实验： 称取适量的细胞膜提取物，加入浓度为1%的甲醇水溶液，配制成一定浓度的细胞膜提 取物溶液。然后分别移取5//L细胞膜提取物溶液于离心管中，并置于37°C水浴中。接着 加入ACE缓冲液15//L，37°C条件下震荡反应5分钟后加入25//L HHL溶液(马尿酰-组胺 酰-亮氨酸的浓度为7. 6mmol/L，pH=8. 3)，震荡反应30分钟。然后加入5 //L的10%三氟 乙酸终止反应，得到反应液样品。将上述反应液在4°C条件下以6745Xg离心20min,取上 清液直接进行HPLC分析。由ACE作用底物得到的马尿酸通过HPLC进行定量分析。同时作 空白试验,除加等量1%甲醇水溶液替代样品外,其他操作相同。
[0015] 实验结果表明：海绵细胞膜提取物对ACE酶的抑制活性是随着其浓度的增加而增 长的。且在浓度达到30mg/mL时抑制率达到最大，约为93. 58%。随后，随着细胞膜提取物浓 度的增加，抑制率保持不变，约为93. 06%。
[0016] 实验例1 :配制海绵细胞膜样品浓度梯度为20. 00、30. 00、40. 00、50. 00、60. 00、 70. 00、80. 00mg/mL，测定此系列样品及空白对照组中马尿酸的峰面积，具体数据如表1所 示。从表中可知，该梯度浓度系列的海绵细胞膜样品对ACE的抑制率都高达90%以上，并且 在该系列浓度梯度范围内并没有体现出明显的抑制活性的变化。
[0017] 实验例2 :配制海绵细胞膜提取物梯度浓度为0· 50、L 25、2· 50、5· 00、10· OOmg/ mL，测定其相应的ACE酶抑制率，其结果如表2所示。表中的数值明确显示：样品浓度为0. 5 mg/mL时，对ACE酶没有抑制率；可随着浓度的升高，抑制率随之增加，且浓度在1. 25 mg/mL 和2. 5 mg/mL后ACE抑制率产生激增的现象，最高抑制率达到了 88. 07%。
[0018] 表1是实验例1中海绵细胞膜提取物浓度与对ACE酶活性抑制后所得的实验数 据。
【主权项】
1. 一种海绵细胞膜提取物，其特征在于：所述的海绵细胞膜提取物按照以下步骤制备 获得： a、 用纯水清洗去冰冻的海绵组织表面的杂物，将海绵组织粉碎并匀浆，获得海绵匀浆， b、 将海绵匀浆与纯水按照1:1的体积比混合获得稀释海绵匀浆，向稀释海绵匀浆中加 入蛋白酶K溶液以获得混合溶液，使混合溶液中蛋白酶K的浓度范围在200. 0~270. O //g/ mL之间，在52~57°C的温度下使混合溶液酶解80~95min，获得海绵酶解浆液，对海绵酶解浆 液进行过滤，去除滤渣，获得海绵酶解液， c、 将海绵酶解液在6~12°C的温度下以600g离心4~8min，弃去上清液得到沉淀组分A1, 将A 1用纯水溶解后，再一次在6~12°C的温度下以600g离心4~8min，弃去上清液得到沉淀 组分A2，将A 2用纯水溶解后置入匀浆器中，以间隔30s的方式均质化120s，然后在6~12°C 的温度下以600g离心15min，弃去沉淀得到上清液B1，将上清液&在2~6°C的温度下以 15000g离心20~25min，弃去沉淀得到上清液B 2，将上清液氏在2~6°C的温度下以IOOOOOg 离心40~50min，弃去上清液得到沉淀组分A3，沉淀组分A3即为海绵细胞膜提取物。
2. -种如权利要求1所述的海绵细胞膜提取物，其特征在于：所述的海绵细胞膜提取 物作为血管紧张素转化酶抑制剂的应用。
3. 根据权利要求1所述的海绵细胞膜提取物，其特征在于：所述的海绵组织选用南海 多皱软海绵的海绵组织。
【专利摘要】本发明公开一种对ACE酶具有抑制活性的海绵细胞膜提取物的制备方法。该海绵细胞膜提取物主采用差速离心的方法，先后经过5次离心制备得到纯度较高的细胞膜提取物。并将此细胞膜提取物进行了ACE酶抑制活性实验。实验结果表明：海绵细胞膜提取物对ACE酶的抑制活性是随着其浓度的增加而增长的。且在浓度达到30mg/mL时抑制率达到最大，约为93.58%。因此，可以根据本制备方法得到的海绵细胞膜提取物研发具有降血压活性的药物和保健品等。
【IPC分类】A61K35-618, A61P9-12
【公开号】CN104546920
【申请号】CN201410840767
【发明人】孔亮, 刘琪, 李伟, 谭成玉
【申请人】大连海洋大学, 孔亮
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月29日