温度敏感性脂肽、含该脂肽的脂质体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于物理化学领域，具体涉及合成的温度敏感性脂肽及其在脂质体中的应用。
【背景技术】
[0002]脂质体是一种新型药物制剂，是利用磷脂双分子膜所形成的囊泡包裹药物分子。由于生物体质膜的基本结构也是磷脂双分子膜，脂质体具有与生物体细胞相类似的结构，因此有很好的生物相容性。
[0003]在研宄的各种新型脂质体中，温度敏感脂质体是一个很有发展前途的分支，它有效利用了脂质体和热疗的双重优势来提高治疗效果，降低毒副作用。普通的温度敏感性脂质体一般是由磷脂和胆固醇组成，每一种磷脂都具有特定的相转变温度，利用磷脂具有一定的相转变温度，将不同的磷脂和胆固醇按照不同的配比混合，得到的脂质体的相变温度也不一样。如Gerben A.Koning[1]、David他6(11^111[2]等在文献中曾提到利用各种磷脂的相转变温度上的差异，靠磷脂的组成比例来调节脂质体的相转变温度Tm，虽然在其Tm以上有一定的增加释放量的效果，但是在低于Tm温度时，其药物的泄漏量也会相应提高，使得药物副作用增强，于是，有文献还报道合成了温敏性嵌段共聚物[3]，将其插入到脂质体双层膜中，这样的脂质体的温控释药效果确实有所提高，却又有高分子聚合物的体内降解问题。
[0004]本发明基于以上脂质体的优缺点，设计合成了具有温敏性多肽的两亲型分子，将其与磷脂混合自组装形成混合脂质体，该温敏性脂质体用以药物载体，在外界高温刺激下，完成迅速释放内含物质的目的。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种具有温度敏感性的脂肽。
[0006]本发明的进一步目的在于提供一种具有温度敏感性的脂肽-脂质体。
[0007]本发明的更进一步目的在于提供所述温度敏感性脂肽-脂质体在制备靶向药物上的用途。
[0008]本发明者设计了一种具有温度敏感性的脂肽，其分子结构为CH3- (CH2)n-(VXXLXXX)m，其中n:4?10，m:3?5，V:缬氨酸；L:亮氨酸，X:除缬氨酸和亮氨酸外的亲水性氨基酸。
[0009]本发明者设计的这种具有温度敏感性的脂肽委托南京艾特生物科技有限公司合成。
[0010]本发明提供的这种具有温度敏感性的脂肽由碳链和多肽构成，具有两亲性，一端为亲水性肽链，另一端是疏水性碳链。
[0011]本发明还提供一种具有温度敏感性的脂肽-脂质体，由分子结构为CH3-(CH2)n-(VXXLXXX)m(其中n:4?10，m:3?5，V:缬氨酸；L:亮氨酸，X:除缬氨酸和亮氨酸外的亲水性氨基酸)的温度敏感性脂肽与磷脂以I?50:200的摩尔比自组装构成。
[0012]本发明的温度敏感性脂肽-脂质体中，磷脂选自HSPC、DOPC、DPPE、DPPC和DSPG。
[0013]所述脂肽-脂质体由脂肽嵌入脂质体双层膜中而形成。
[0014]本发明提供了这种脂肽-脂质体的制备方法。
[0015]本发明的脂肽-脂质体可以是不包药的脂质体，其由如下方法制得:
[0016]I)将脂肽和磷脂分别溶于选自选自氯仿、无水甲醇和乙醇的有机溶剂，所得溶液充分混合后于30-60°C悬蒸30-60min，得到脂肽-脂质体膜；
[0017]2)真空蒸发除去溶剂，脂肽-脂质体沉积瓶壁后继续抽干，用tris-HCl溶液溶解脂肽-脂质体膜，30-60°C超声分散10-30min，得到脂肽-脂质体溶液；
[0018]3)用过滤器将步骤2)所得的脂肽-脂质体溶液用滤膜直径200nm的挤出器过滤。
[0019]优选地，所述脂肽和磷脂混合时还加入溶于有机溶剂的胆固醇一起混合，更优选的是采用阳离子胆固醇。
[0020]选择阳离子胆固醇使脂质体带正电荷，这样制成的脂质体比不带电荷的脂质体更加稳定。
[0021]本发明提供的脂肽-脂质体溶液经滤膜直径200nm的挤出器过滤后，脂质体的粒径控制在200nm左右。
[0022]在一个优选实施方案中，包括如下步骤:
[0023]I)在一个圆底烧瓶中，加入摩尔比4:1的磷脂和阳离子胆固醇，用有机溶剂溶解，加入另外用有机溶剂溶解的脂肽，脂肽与磷脂的比例为I?50:200，充分混合，30-60°C旋蒸45min以上待用；
[0024]2)将步骤I所得的脂肽-脂质体膜抽真空，待溶剂完全挥发，脂肽-脂质体沉积瓶壁后继续抽干，然后用tris溶液溶解，30-60°C超声分散10-30min，得到脂肽-脂质体溶液；
[0025]3)用过滤器将步骤2)所得的脂肽-脂质体溶液用挤出器(滤膜直径200nm)过滤，控制脂质体的粒径在200nm附近。
[0026]本发明提供的脂肽-脂质体更实用的是包药的脂质体，其由薄膜分散水化法制得，包括如下步骤:
[0027]I)将脂肽和磷脂分别溶于选自选自氯仿、无水甲醇和乙醇的有机溶剂，所得溶液充分混合后于30-60°C悬蒸30-60min，得到脂肽-脂质体膜；
[0028]2)真空蒸发除去溶剂，脂肽-脂质体沉积瓶壁后继续抽干，加入5ml (NH4) 2S04溶液水化脂肽-脂质体膜，30-60°C超声分散10-30min，得到脂肽-脂质体溶液；
[0029]3)用过滤器将步骤2)所得的脂肽-脂质体溶液用滤膜直径200nm的挤出器过滤。
[0030]优选地，所述脂肽和磷脂混合时还加入溶于有机溶剂的胆固醇一起混合，更优选的是采用阳离子胆固醇。
[0031]本发明提供的脂肽-脂质体溶液经滤膜直径200nm的挤出器过滤后，脂质体的粒径控制在200nm左右。
[0032]一个具体的实施方案包括如下步骤:
[0033]I)在一个圆底烧瓶中，加入比例4:1的磷脂和阳离子胆固醇，用有机溶剂溶解，加入另外用有机溶剂溶解的脂肽，脂肽与磷脂的比例为XX，于45°c恒温水浴中旋转蒸发除去有机溶剂，脂质体沉积瓶壁后继续抽干；
[0034]2)取下圆底烧瓶后，放入60°C水浴中超声预热，在瓶中加入5ml (NH4)2SO4溶液水化脂质体，超声分散30min ；
[0035]3)用过滤器将所得的脂肽-脂质体溶液用滤膜直径200nm的挤出器过滤，控制脂质体的粒径在200nm附近。
[0036]本发明提供的脂肽-脂质体的载药方法可以是主动或被动载药法。
[0037]本发明提供的包裹药物的载药脂质体由如下方法制得:
[0038]I)将包药的脂质体经透析后，置于60°C水浴中，以药物:脂质体=1:20的比例滴加药物溶液，滴加完成后在水浴中孵化30min，每隔1min震荡混合一次；
[0039]2)通过葡聚糖微型凝胶柱分离掉未包封的药物。
[0040]本发明的一个优选实施方案，用薄膜超声水化法制成载药纳米脂质体，其制备方法中，真空蒸发除去溶剂是在45°C恒温水浴中旋转蒸发，加入(NH4)2SO4S液水化前先在60°C水浴中超声预热，所述超声分散进行30min。
[0041]附图的简要说明
[0042]图1是6°C?92°C下纯脂肽的圆二色谱(⑶)图。
[0043]图2是6°C?92°C下脂肽_脂质体的圆二色谱(CD)图。
[0044]图3是脂质体的透射电子显微镜(TEM)图。
[0045]图4是脂肽-脂质体在45°C和37°C下的药物释放图。
[0046]本发明基于拉链结构亮氨酸的特性，设计合成了一种具有温度敏感性的脂肽。所述脂肽由碳链和多肽构成，具有两亲性，一端为亲水性肽链，另一端是疏水性碳链。肽链端每7个氨基酸为一组，其中的第4个氨基酸是亮氨酸，多肽在水溶液中形成α -螺旋结构，每7个氨基酸为I个螺旋，这样亮氨酸正好排列在螺旋的一侧，由于亮氨酸是疏水性氨基酸，使得a-螺旋通过疏水作用两两结合。当2个氨基酸链平行排列时，就形成二聚体，随着温度上升，a-螺旋结构被破坏，二聚体解散，称之为具有“拉链”的功能。从图1可见，纯的脂肽在192nm、208nm以及222nm处都有特征峰，说明脂肽在tris溶液中具有α螺旋结构。当温度升高时，特征峰减小，螺旋结构被破坏。用软件处理，得到脂肽的相转变温度为48.0±0.I。。。
[0047]将具有温度敏感性的脂肽插入到脂质体膜中，形成的脂肽-脂质体作为药物载体具有一定的温度敏感性，当温度低于脂肽-脂质体的转变温度时，药物不泄漏；当温度高于脂肽-脂质体的转变温度时，由于二聚体解散，药物得以释放。从图2可见，当将脂肽插入到脂质体中时，脂肽的特征峰仍然存在，说明脂肽在脂质体膜中依旧保持着α螺旋结构。用软件处理，脂肽-脂质体的相转变温度为45.0±0.1°C。
[0048]从图3的透过电子显微镜图可见脂肽-脂质体的粒径大约在200?300nm之间。
[0049]本发明的脂肽-脂质体由于脂肽和磷脂的相互作用，在温度稍低于脂肽的转变温度时脂肽就可以打开形成孔道，药物从中释放出来。实验结果表明这样的结构设计使得药物的释放速率和释放量都比一般温度敏感性脂质体高。从图4可见各类脂质体24小时药物释放量，环境温度为37°C时，脂质体的药物释放量仅24.8%，脂肽-脂质体的也只是25.5%;在45°C时候，脂质体的药物释放量略有提高，约37.8%，脂肽-脂质体达到了 70%。结果表明，插入脂肽后，脂质体的持药稳定性增加，当环境温度超过脂肽相转变温度时，释药量大大增加。
[0050]将不同磷脂以及不同比例的磷脂混合，制成的脂质体也具有不同的相转变温度。
[0051]由于不同的组织(尤其是肿瘤细胞和正常细胞)之间因代谢速率不同组织温度略有差异，通过选择不同磷脂及调控磷脂比例，以及采用不同的脂肽及调控脂肽和磷脂的比例，可得到具有不同相转变温度的脂质体，从而达到靶向给药的目的。
[0052]因此，本发明还提供脂肽-脂质体在制备靶向药物上的用途。
[0053]本发明提供的温度敏感性脂质体在药物释放方面具有优良表现。
【具体实施方式】
[0054]以下用实施例对本发明作更详细的描述。这些实施例仅仅是对本发明最佳实