一种对肝癌细胞具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种对肝癌细胞具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法。
【背景技术】
[0002]癌症(恶性肿瘤)已成为当前威胁人类健康的最主要疾病之一，并且其发病率保持逐年上升的趋势。目前，化学疗法仍然是最重要的治疗手段。传统的化疗方法，由于抗癌药物不能特异识别靶细胞，药物进入体内后分布在体内的各个器官中，对病变部位的特异性分布较少。这些药物的细胞毒性较大，能杀伤肿瘤细胞的同时也能破坏正常的组织细胞，具有严重的副作用，给患者带来极大的痛苦。因此，构建新型的智能响应控制释放体系，使其不仅能特异性的识别靶向细胞，还能定时、定量的将药物导入病变部位，提高药物的利用率，减少毒副作用，具有重要的作用。
[0003]近年来一系列环境响应性的新型细胞靶向控释体系被构建，他们通过靶向部位的特殊环境刺激，药物系统产生响应性将药物可控释放到靶向部位起到治疗作用。这一新型靶向药物体系在体内循环系统中能够稳定的存在，而在靶向部位由于环境的改变，载药系统随机产生响应性，一般通过载体解离，键断裂，降解等方法使药物释放到靶向部位。
[0004]目前，介孔硅以其优异的性能在智能药物控释体系中被广泛应用为药物载体，但介孔硅作为药物载体难以降解，而且介孔硅载体的过度使用可能引起一些副作用，像细胞突变、慢性支气管炎甚至肺癌，因此，构建新型的药物载体仍然是一个大的挑战。
【发明内容】
[0005]本发明是为了解决当前药物载体毒副作用大，难以降解的问题，而提供了一种对肝癌细胞具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法。
[0006]本发明的一种对肝癌细胞具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备方法按以下步骤进行:
[0007]一、模板剂的准备:将模板剂F127和泛酸钙单水合物溶解在去离子水中，在搅拌速度为250r/min?400r/min下搅拌至得到清晰乳状液，得到F127-泛酸钙混合液，即得到丰旲板剂;
[0008]步骤一中所述的模板剂F127与泛酸钙单水合物的质量比为1: (4?8);步骤一中所述的模板剂F127与去离子水的质量比为1: (30?100)；
[0009]二、介孔羟基磷灰石纳米粒子的制备^fK2HPO4.3H20溶解在去离子水中，得到K2HPO4溶液，然后用NH 3 -H2O调解K2HPO4溶液的pH值至pH值为10?14，再将pH值为10?14的K2HPO4溶液以滴加速度为1.0g/min?3.0g/min滴加到F127-泛酸钙混合液中，搅拌均匀后采用水浴回流的方式进行加热，控制水浴加热温度为80?100°C，回流时间为24h?48h，完成水浴回流反应，将水浴回流反应后的溶液过滤，收集白色沉淀物，将白色沉淀物在温度为80?150°C的真空条件下干燥12h?24h，得到干燥后的白色沉淀物，然后将干燥后的白色沉淀物在温度为200?300°C下预烧2h?6h，再在马弗炉中煅烧，控制煅烧温度为500?600°C，煅烧时间为6h?10h，得到介孔轻基磷灰石纳米粒子；
[0010]步骤二中所述的K2HPO4.3H20与去离子水的质量比为1: (10?13);步骤二中所述的PH值为10?14的K2HPO4S液中的K 2ΗΡ04.3H20质量与F127-泛酸钙混合液中F127的质量比为(2?5):1 ；
[0011]三、介孔羟基磷灰石的氨基化:将步骤二得到的介孔羟基磷灰石纳米粒子均匀分散在甲苯溶液中，在搅拌速度为300r/min?600r/min下搅拌1min?30min后，加入3-氨丙基三甲氧基硅烷，然后置于温度为60?80°C的水浴锅中回流24h?48h，离心冷冻干燥后得到氨基化的介孔磷灰石；
[0012]步骤三中所述的介孔羟基磷灰石纳米粒子的质量与甲苯溶液的体积的比为Ig:(50?100)mL ;步骤三中所述的甲苯溶液与3-氨丙基三甲氧基硅烷的体积比为(8?12):I ;
[0013]四、介孔磷灰石的羧基化:将步骤三得到的氨基化的介孔磷灰石均匀分散在丙酮溶液中，然后在室温下以搅拌速度为400r/min?600r/min搅拌5.5h?6.5h，得到氨基化的介孔磷灰石分散液，再将丁二酸酐逐滴加入到氨基化的介孔磷灰石分散液中，然后在室温下继续以搅拌速度为300r/min?500r/min搅拌24h?48h，然后依次用蒸饱水和无水乙醇洗涤并离心10?20次，最后冷冻干燥，得到羧基化的介孔磷灰石；
[0014]步骤四中所述的氨基化的介孔磷灰石的质量与丙酮溶液的体积的比为Ig: (65?85)mL ;步骤四中所述的氨基化的介孔磷灰石与丁二酸酐的质量比为1: (5.5?8.5);
[0015]五、二硫键功能化的介孔磷灰石的制备:将步骤四得到的羧基化的介孔磷灰石、1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶解在PBS缓冲溶液中，在搅拌速度为300r/min?600r/min条件下搅拌3.5h?4.5h，得到混合溶液A，然后将胱胺盐酸盐加入到混合溶液A中，在室温下以搅拌速度为200r/min?500r/min搅拌24h?48h，然后依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤并离心10?20次，再真空干燥，得到二硫键功能化的介孔磷灰石；
[0016]步骤五中所述的羧基化的介孔磷灰石与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐的质量比为(1.5?2.5):1 ;步骤五中所述的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1: (3?5);步骤五中所述的羧基化的介孔磷灰石的质量与PBS缓冲溶液的体积的比为Ig: (50?150)mL ;步骤五中所述的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.005mol/L?0.02mol/L ;步骤五中所述的羧基化的介孔磷灰石与胱胺盐酸盐的质量比为1: (5?20)；
[0017]六、具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体的制备:将异氰酸荧光素和步骤五得到的二硫键功能化的介孔磷灰石溶解于PBS缓冲溶液中，在室温下以搅拌速度为200r/min?500r/min搅拌2.5h?3.5h，得到混合溶液B，然后将胶原蛋白、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加入到混合溶液B中，继续以搅拌速度为300r/min?500r/min搅拌24h?48h，得到混合溶液C，再将乳糖酸加入到混合溶液C中，继续以搅拌速度为300r/min?600r/min搅拌12h?36h，然后用PBS缓冲液离心洗涤10?20次，再冷冻干燥，得到介孔磷灰石纳米药物载体；
[0018]步骤六中所述的异氰酸荧光素与二硫键功能化的介孔磷灰石的质量比为1: (3?10);步骤六中所述的异氰酸荧光素的质量与PBS缓冲溶液的体积的比为Ig: (400?800)mL ;步骤六中所述的PBS缓冲溶液的摩尔浓度为0.005mol/L?0.02mol/L ;步骤六中所述的异氰酸荧光素与胶原蛋白的质量比为(I?3):1 ;步骤六中所述的异氰酸荧光素与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐的质量比为(1.5?4):1 ;步骤六中所述的异氰酸荧光素与N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1: (12?18);步骤六中所述的异氰酸荧光素与乳糖酸的质量比为1: (1.2?2.5)。
[0019]本发明的有益效果:
[0020]本发明的还原响应性靶向药物输送体系是一类极具前景的智能药物传递体系。在正常组织细胞内，还原响应性酶(谷胱甘肽)的含量较低，但在肝癌细胞，其细胞内谷胱甘肽含量较高，是正常组织的10倍。因此，可以利用谷胱甘肽含量的不同设计智能药物载体，实现药物对肝癌细胞的响应性释放。同时，肝癌细胞表面的大量受体(ASGP-R)，为药物载体的靶向选择提供了条件。因此，还原响应性智能药物体系在药物传递和释放领域的应用可以极大地提高肿瘤治疗的有效性。
[0021]羟基磷灰石做为人体骨骼和牙齿的重要组成，因其优异的生物相容性、生物活性和无毒性是一种重要的生物材料。通过模板法制备的介孔羟基磷灰石纳米粒子具有优异的比表面积、大的孔容积和良好的生物相容性和生物降解性，药物负载能力好，同时在体内其降解产物能被人体完全吸收，没有毒副作用，同时其尺寸小于lOOnm，能被细胞有效地吞噬，有效地提高药物分子对细胞的摄入效率。将乳糖酸分子修饰的胶原蛋白固定在介孔磷灰石表面，乳糖酸分子能够特异性识别肝癌细胞表面的受体(ASGP-R)，从而实现靶向治疗的目的。因此，该体系同时具有细胞靶向和还原响应性，能够有效的控制药物释放，减少毒副作用，达到治愈的目的，本发明的方法具有以下优点:
[0022]1、本发明的具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体能与肝癌细胞表面的配体发生特异型反应，能靶向识别肝癌细胞，减少了正常组织对药物的摄取，降低了药物在体内的毒副作用。
[0023]2、本发明的具有还原响应性和细胞革El向的介孔磷灰石纳米药物载体能在还原响应性酶的作用下实现定向释放药物分子，定时、定量的将药物导入病变组织，有效地提高了药物的利用率。
[0024]3、本发明的具有还原响应性和细胞靶向的介孔磷灰石纳米药物载体具有良好的生物相容性和生物降解性，细胞毒性较小，降解产物能被人体完全吸收。
[0025]4、本发明的方法操作简单，成本低廉，实用性强。
【附图说明】
[0026]图1为验证试验(一)中介孔磷灰石纳米颗粒的TEM照片；
[0027]图2为验证试验(一)中试验一得到的负载异氰酸荧光素的乳糖酸-胶原/介孔磷灰石的TEM照片；
[0028]图3为验证试验(二)中在DTT刺激下试验一得到的负载异氰酸荧光素的乳糖酸-胶原/介孔磷灰石中的模型药物FITC的累积释放曲线图；其中a为没