一种叶酸和细菌纤维素共同修饰的羧化石墨烯氧化物及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于抗癌药物靶向传递技术领域，具体涉及一种叶酸和细菌纤维素共同修饰的石墨烯氧化物及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]目前癌症已成为威胁人类健康的头号杀手，其诊断与治疗方法引起了医学和生物界的广泛关注。治疗癌症的方法主要是采用化学药物治疗，但是化疗药物在遏制了肿瘤组织生长的同时，对周围正常组织会产生严重的毒副作用，给病患带来极大的痛苦。因此，医学界探索出一种定向给药的载体系统，克服了传统化学药物治疗对正常组织产生严重毒副作用，且对肿瘤靶向治疗效果不明显的缺点。其中，非共价药物载体具有良好的缓释效果、能够降低药物的毒副作用、不会破坏药物结构等优点，而成为靶向给药的优良载体。非共价药物载体包括脂质体、无机纳米粒子、囊泡以及碳纳米材料等。石墨稀氧化物一种碳纳米材料，由于其材料成本低、合成方便、与含共轭基团药物非共价作用力强、载药量大以及生物相容性好、低毒性等优点成为当前研宄的热门载体材料。
[0003]但是，石墨烯氧化物用于生物医药领域仍旧存在一定的细胞毒性，因此需对其进行生物相容性修饰以进一步降低潜在的细胞毒性。目前用于生物相容性修饰的材料有很多，无机化合物包括金、银、钯、铜、铂等金属纳米粒，氧化锌、四氧化三铁、二氧化锡、氧化钴、氧化锰、氧化铜等金属氧化物纳米粒，硅、介孔生物活性玻璃等非金属纳米粒子，有机化合物包括聚乳酸-羟基乙酸纳米微球、聚乳酸纳米微球、脂质体、明胶纳米球、微凝胶聚乙二醇胺、聚多巴胺、纤维素等有机高分子纳米粒。
【发明内容】
[0004]本发明需要解决的技术问题是提供一种叶酸和细菌纤维素共同修饰的羧化石墨烯氧化物。
[0005]本发明还要解决的技术问题是提供上述叶酸和细菌纤维素共同修饰的羧化石墨烯氧化物的制备方法。
[0006]本发明最后要解决的技术问题是提供上述叶酸和细菌纤维素共同修饰的羧化石墨烯氧化物作为药物载体在制备抗癌纳米复合物中的应用。
[0007]为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案:
[0008]一种叶酸和细菌纤维素共同修饰的羧化石墨烯氧化物的制备方法，该方法包括以下步骤:
[0009](I)细菌纤维素修饰的羧化石墨烯氧化物的制备:
[0010](Ia)将羧化石墨烯氧化物溶解于水中，超声处理，得到纳米羧化石墨烯氧化物的分散液；
[0011](Ib)将步骤(Ia)得到的纳米羧化石墨烯氧化物的分散液与细菌纤维素发酵培养基以体积比1:5?10比例混合，得到含有纳米羧化石墨烯氧化物的细菌纤维素发酵培养基;
[0012](Ic)将细菌纤维素生产菌接种到步骤(Ib)得到的含有纳米羧化石墨烯氧化物的细菌纤维素发酵培养基中，然后发酵，发酵结束后，离心收集上清，再对上清超滤处理，得到纯净的细菌纤维素修饰的石墨烯氧化物溶液；
[0013](2)叶酸和细菌纤维素共同修饰的石墨烯氧化物的制备:
[0014](2a)向步骤(Ic)得到的细菌纤维素修饰的石墨烯氧化物水溶液中加入叶酸溶液，其中，叶酸溶液与细菌纤维素修饰的石墨烯氧化物水溶液的比例为10?200:1，搅拌均匀，得到混合体系a;
[0015](2b)向步骤(2a)得到的混合体系a中加入1-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，再超声处理，得到混合体系b ;
[0016](2c)向步骤(2b)得到的混合体系b中加入N-羟基磺酰基琥珀酰亚胺钠盐，得到混合体系C，用浓盐酸溶液调节pH为7.0?8.0，在室温下避光搅拌，得到叶酸和细菌纤维素共同修饰的石墨烯氧化物粗品；
[0017](2d)将步骤(2c)得到的叶酸和细菌纤维素共同修饰的石墨烯氧化物粗品过滤，然后水洗，得到叶酸和细菌纤维素共同修饰的石墨烯氧化物纯品。
[0018]其中，步骤(Ia)中，所述的纳米羧化石墨烯氧化物的分散液，其中纳米羧化石墨稀氧化物的浓度为0.1?1.0mg/ml，优选为0.5?1.0mg/ml，最优选为lmg/ml。
[0019]步骤(Ia)所述的超声处理，其超声条件为300?600W超声0.5?2小时。
[0020]其中，步骤(Ib)中，所述的细菌纤维素发酵培养基的配方为:甘露醇50?10g/L、大豆蛋白胨5?9g/L、十二水磷酸氢二钠4?8g/L及醋酸3?5g/L，溶剂为水，pH为
5?8ο
[0021]其中，步骤(Ic)中，所述的细菌纤维素生产菌为木葡糖醋酸杆菌。
[0022]其中，步骤(Ic)中，所述的发酵，其发酵条件为温度25?30°C，优选28?30°C，发酵时间为I?12h，优选I?3h。
[0023]其中，步骤(Ic)中，所述的细菌纤维素修饰的石墨烯氧化物水溶液，其中细菌纤维素修饰的石墨稀氧化物的浓度为0.1?1.0mg/ml，优选为0.5?1.0mg/ml。
[0024]其中，步骤(2a)中，所述的叶酸溶液为叶酸与钠离子的混合水溶液，其中，叶酸浓度为3_6mg/ml，优选为5.5-6.0mg/ml ;钠离子的浓度为0.1?0.5mol/L，优选为0.1?0.2mol/L ;所述的钠离子来源于氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠中的任意一种，优选氢氧化钠。
[0025]其中，步骤(2b)中，所述的混合体系b，其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的浓度为2?5mg/ml，优选为3?4mg/ml ；
[0026]其中，步骤(2c)中，所述的混合体系c，其N-羟基磺酰基琥珀酰亚胺钠盐的浓度为0.5 ?1.5mg/ml，优选为 0.5 ?lmg/ml。
[0027]上述方法制备得到的叶酸和细菌纤维素共同修饰的羧化石墨烯氧化物在本发明的保护范围之内。
[0028]上述叶酸和细菌纤维素共同修饰的羧化石墨烯氧化物作为药物载体在制备抗癌纳米复合药物中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0029]有益效果:
[0030]本发明与现有技术相比，具有以下优势:
[0031](I)利用叶酸和细菌纤维素共同修饰羧化石墨烯氧化物，降低了石墨烯氧化物对正常细胞的细胞毒性，，也提高了药物对肿瘤细胞的细胞毒性。
[0032](2)利用本发明提供的叶酸和细菌纤维素共同修饰羧化石墨烯氧化物作为药物载体，负载抗肿瘤药物紫杉醇，能明显降低毒副作用，增强药物水溶性，提高药物疗效。
[0033](3)本发明还具有制备过程简单、材料成本低等优点，在癌症定向治疗方法应用上有很大前景。
【附图说明】
[0034]图1石墨烯氧化物的原子力显微镜图。
[0035]图2石墨烯氧化物的透射电子显微镜图。
[0036]图3药物对卵巢癌细胞A2780的抑制效果图。
[0037]图4载体药物靶向卵巢癌细胞A2780的效率图。
[0038]图5空白载体对正常细胞的抑制效果图。
[0039]图6叶酸和细菌纤维素共修饰载体药物对卵巢癌细胞A2780的抑制效果图。
【具体实施方式】
[0040]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0041]实施例1:石墨烯氧化物的制备。
[0042]石墨稀氧化物采用改善过的Hummer’s方法合成。
[0043]首先称取1.0g石墨加入250mL两颈圆底烧瓶中，再向其中加入23mL浓硫酸，以磁搅拌使二者充分混合；将此两颈圆底烧瓶移入冰水浴中继续搅拌，待混合液温度降到10°C以下后，采用少量多次的办法开始缓慢的向体系中加入固体高锰酸钾3g，通过控制加入速度使混合液的温度始终保持在20°C以下，加入完毕后，继续于冰水浴中搅拌30min ;将反应体系升温到35°C再反应30min至2小时；向圆底烧瓶中加入46ml蒸馏水后反应体系温度迅速升高，将反应体系移入95°C油浴中反应温度恒温至95°C;在加入蒸馏水并恒温30min后，再向体系中倾入140mL蒸馏水并加2.5mL双氧水；将反应液过滤，收集固体物质，先以5%的盐酸溶液多次洗涤后，再以蒸馏水反复洗至溶液中性，最后以纯净水渗析一周，所得溶液自然干燥或冷冻干燥得到氧化石墨；将得到的石墨烯氧化物以磁搅拌分散于水中后，超声4小时或更长时间，得到石墨烯氧化物的水溶液。
[0044]实施例2:羧化石墨烯氧化物的制备。
[0045]将得到的石墨烯氧化物50mg置于50ml水中，在500?600W条件下超声2?3小时，得到纳米石墨烯氧化物的水悬浮液；向该纳米石墨烯氧化物的水悬浮液中加入氢氧化钠1.2g、一氯乙酸钠浓度为1.0mg/ml的水溶液，在500W条件下超声3?4小时，得到羧化石墨烯氧化物粗产品；再将该粗产品反复漂洗过滤纯化得到纯净的羧化石墨烯氧化物。
[0046]实施例3:细菌纤维素修饰载体。
[0047](I)配制细菌纤维素发酵培养基
[0048]取50mg羧化石墨稀氧化物加入50ml无菌水中，于500?600W超声0.2?I小时得到纳米羧化石墨烯氧化物分散液。
[0049]配制含甘露醇100g/L、大豆蛋白胨9g/L、十二水磷酸氢二钠8g/L及醋酸5g/L的细菌纤维素发酵培养基。
[0050]将两者以体积比为1:5?10比例混合，即得含羧化石墨烯氧化物的细菌纤维素发酵培养基。
[0051](2)制备细菌纤维素修饰的羧化石墨烯氧化物。
[0052]将新活化木葡糖醋酸杆菌(购自ATCC，该菌的编号为ATCC 23769)按照体积比5-10%转接到上述含羧化石墨烯氧化物的细菌纤维素发酵培养基中，30°C条件下，以150rpm，发酵培养I?12h，发酵结束后离心收集上清，然后将上清超滤，即得到纯净的细菌纤维素修饰的羧化