miR-1236在制备抑制肝癌细胞生长药物的用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及ー种药物的用途，特别是涉及rniR-1236在制备抑制肝癌细胞生长药 物的用途。
【背景技术】
[0002] 肝细胞癌（HCC)是ー种世界范围内多发且常见的的恶性肿瘤，预后较差。AFP被 认为是HCC诊断中的经典标志物，汤华在前期研究发现AFP可以通过加速细胞周期Gl到S 期的进程从而促进HCC细胞在体内和体外的生长[1]，但是AFP在HCC中上调的机制尚不能 确定。之前有研究表明p53、P-catenin和ZBTB20可以在转录水平抑制AFP的表达，然而 AFP是否在转录后水平被microRNA抑制还不是很清楚。
[0003]MicroRNA(miRNA)是长度为22nt的小非编码RNA，它通过抑制蛋白质的翻译或促 进靶mRNA的降解来调控基因的表达[2]。据估计，60%以上的蛋白编码的基因都受miRNA 调控[3]。越来越多的证据表明miRNA的失调和许多人类疾病的发生发展有关，也包括癌 症。MiRNA可以通过扮演癌基因或者抑癌基因的角色来调控细胞的増殖、凋亡、迁移、侵 袭和血管形成[4' 5'6]。近期，我们实验室也发现ー些miRNA了，如miR-10a、miR-490-3p和 miR-371-5p，都通过调控不同的靶基因从而參与HCC的发展[7'8'9]。然而是否有miRNA直接 调控AFP的表达尚不清楚。
[0004] 參考文献：
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【发明内容】
[0014] 本发明的目的是提供miR-1236在制备抑制肝癌细胞生长药物的用途。
[0015] 本发明的技术方案概述如下：
[0016] miR-1236在制备抑制肝癌细胞生长药物的用途。
[0017] 采用miRNA生物信息学网站预测的方法，首次发现miR-1236是AFP的上游调控分 子，且在肝癌组织及与癌旁正常肝组织中的AFPmRNA和miR-1236的表达水平呈负相关。我 们利用荧光报告载体实验验证了miR-1236能够通过与靶基因AFP的3'非编码区的作用抑 制其表达，并且能够影响其mRNA和蛋白水平的表达，并通过实验证明miR-1236可以通过调 控AFP抑制肝癌的生长。
【附图说明】
[0018] 图1为miR-1236在肝癌细胞中下调AFP的表达。
[0019] 图2为miR-1236对肝癌生长的影响。
【具体实施方式】
[0020] 下面通过具体实施例对本发明作进ー步的说明。
[0021] 实施例1
[0022] 1 ?细胞培养
[0023] 肝癌细胞系HepG2、QGY-7703(ATCCCellLines，http://www.atcc.org/en/ Products/Cells_and_Microorganisms/Cell_Lines.aspx)。HepG2 细胞培养基为MEM-a， 并加入胎牛血清、青霉素和链霉素，使胎牛血清的体积浓度为10%，青霉素的浓度为 100yg/ml，链霉素的浓度为100iig/ml。QGY-7703细胞培养基为RPMI1640并加入胎牛血 清、青霉素和链霉素，使胎牛血清的体积浓度为10%，青霉素的浓度为IOOug/ml,链霉素 的浓度为IOOug/ml。分别置于37°C，5% 0)2的孵箱中生长。2-3天传代一次。
[0024] 2?细胞转染
[0025] IfepG2和QGY-7703细胞铺于细胞培养板（培养基同步骤（1)的培养基），待细胞 生长至70% -80%成片时（约18-24h后）开始转染，转染所用试剂为Lipofectamine2000 (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)，參照说明书进行转染。甲氧基寡核苷酸由上海吉玛公司 化学合成，寡核苷酸和siRNA的工作浓度200nm/L。
[0026] 转染所用核苷酸序列：
[0027] miR-1236 序列 5, -CCUCUUCCCCUU⑶CUCUCCAG-3'（SEQIDNO. 1)
[0028]antisensemiR-12365'-CUGGAGAGACAAGGGGAAGAGG-3'（SEQIDNO. 2)
[0029]antisensecontrol5,-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3,(SEQIDNO. 3)
[0030]AFPtargetingsiRNA5'-ACUAGUAGCGGCCGCCAGUGUGCUG-3'（SEQIDNO. 4)
[0031] 5,-CUCCGGAUCCUAGGUGACACUAUAGAAUAGG-3,(SEQIDNO. 5)
[0032]controlsiRNA5,UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3,（SEQIDNO. 6)
[0033] 3,TTAAGAGGCUUGCACAGUGCA5，（SEQIDNO. 7)
[0034] 3?靶定AFP的miRNA的预测
[0035] 我们通过生物信息学方法，使用生物信息学网站预测（miRbase，TargetScan, PicTar)以AFP为靶基因的miRNA，最终我们选择了miR-1236进行研究。
[0036] 4.载体构建
[0037] 1)构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP)报告载体：以pEGFP-N2(Clontech，Mountain View，CA,USA)为模板，通过PCR扩增克隆得到全长719bp的EGFP片段，所用上游引物序列：
[0038]5，-gcagccaagcttgccaccatgtgtagcaagggc-3，（SEQIDN0.8)，下游引物序列：
[0039]5' -cgcggatcctttacttgtacagctcgtcc-3'（SEQIDN0. 9)，扩增的片段通过 HindIII、BamHI克隆到pcDNA3载体上，形成pcDNA3/EGFP表达载体。
[0040] 2)含靶基因作用位点的EGFP报告载体的构建：PCR扩增AFP的3'UTR片段（含 预测的miR-1236 结合位点，5'auuacuucAGGGGAAGAGa3'）（SEQIDN0. 10)，扩增的片段 通过BamHI、EcoRI插入到pcDNA3/EGFP