一种透明质酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米载药材料领域，特别涉及一种透明质酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用。
【背景技术】
[0002]在人类众多疾病发展过程中，存在着严重威胁人类生命健康的重大疾病一一肿瘤。在肿瘤的化学药物治疗过程中，影响其治疗效果的关键在于抗癌药物能否到达肿瘤细胞并具有一定的药物浓度，从而达到抑制癌瘤细胞的增殖甚至杀灭癌细胞的目的。然而，大量的药物分子因具有水溶性差、细胞膜渗透率低等缺陷使得治疗效果受到极大限制。因此，构建具有靶向药物输送功能的药物输送体系成为解决该难题的关键。
[0003]随着纳米技术的不断发展及大量新型纳米材料的出现，一些功能化纳米材料已经被用作药物传输载体并显示出极大的优势。在众多的抗癌药物载体体系中，以纳米粘土锂皂石作为平台的载药体系正成为目前的研宄热点。锂皂石(Laponite，LAP)是属于蒙皂石族的一种矿物，分散在水中能形成扁平状晶体。锂皂石具有特殊空间夹层结构并且表面带有大量的负电荷，可以有效地包载药物，在疏水性药物依曲康唑、抗肿瘤药物阿霉素等的负载与输送中体现了优势。但是，寻找合适的载体还远远不够，许多抗癌药物不能穿过细胞膜，即使药物载体将药物载至肿瘤细胞表面，仍缺乏有效的内化机制。随着对肿瘤细胞研宄的深入，研宄者发现肿瘤细胞具有一系列过量表达的受体，如果将与受体相关的配体或抗体连接在药物或药物载体表面，通过受体介导的内吞作用能够将所负载的药物靶向转运到特定的组织和肿瘤细胞，这个方法的特异性和对肿瘤细胞的亲和性都非常高，大大提高了药物的靶向性和转运效率。
[0004]透明质酸(HA)是由单位D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖，是脊椎动物体液和组织的重要成分，在一些生物过程如创伤修复、细胞增殖、细胞粘附以及细胞迀徙等中扮演重要角色。此外，HA也是一种常用的肿瘤靶向分子，它可以和一些肿瘤细胞表面高表达的CD44受体特异性的结合，被广泛的运用于基因治疗、分子成像以及药物传递等方面。与小分子叶酸等靶向试剂相比，透明质酸分子是一种具有良好水溶性的大分子，修饰到载体的表面不仅能够赋予载体对肿瘤细胞的革E向功能，还能提高载体的胶体稳定性和生物相容性，表现出独特的优势。
[0005]因此，利用LAP的自身结构特点负载抗肿瘤药物盐酸阿霉素，再通过表面修饰HA的方式赋予载体靶向性，将有望提高阿霉素的抗肿瘤效果、降低毒副作用，具有重要的理论意义和实用价值。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种透明质酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒及其制备和应用，该氨基化锂皂石纳米颗粒提高了纳米颗粒的稳定性和生物相容性，同时对CD44受体高表达的癌细胞具有特异性的靶向作用，可应用于靶向输送抗癌药物；制备方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景。
[0007]本发明的一种透明质酸修饰的氨基化锂阜石纳米颗粒，所述的氨基化锂阜石纳米颗粒为(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷修饰的锂皂石，纳米颗粒中透明质酸的质量分数为 17.17-19.09%。
[0008]本发明的一种透明质酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的制备方法，包括:
[0009](I)用溶剂溶解透明质酸HA，加入活化剂搅拌，活化羧基2_4h，得到HA溶液；
[0010](2)配置锂皂石LAP分散液，取(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷加入到LAP分散液中，然后50?60°C静置14-18h，透析，制得氨基化锂皂石LM溶液；
[0011](3)取(I)中所得的HA溶液，加入步骤⑵所得LM溶液中，搅拌反应70_74h后，透析，最后得到透明质酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-HA。
[0012]所述步骤⑴中的溶剂为超纯水；HA溶液的浓度为25-27mg/mL。
[0013]所述步骤⑴中的活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC和N-羟基丁二酰亚胺NHS，EDC、NHS与羧酸的摩尔比为5:5:1。
[0014]所述步骤(2)中的LAP分散液的浓度为8-10mg/mL，LAP和(3-氨基丙基)二甲基乙氧基硅烷的质量比为2-3:1。
[0015]所述步骤(3)中的LM与HA的摩尔比为1:1.25-1:1.5。
[0016]所述步骤(I)和(3)中的搅拌为磁力搅拌，搅拌速度为100-150r/min。
[0017]所述步骤⑵和步骤(3)中的透析为蒸馏水透析，透析袋截留分子量为8000-14000，透析时间为3d。
[0018]本发明的一种透明质酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒的应用，将阿霉素DOX水溶液加入透明质酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒水溶液中，搅拌，离心，洗涤并分散，得到负载阿霉素的透明质酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒LM-HA/DOX ;其中，阿霉素DOX水溶液的浓度为l_2mg/mL，透明质酸修饰的氨基化锂皂石纳米颗粒和阿霉素的质量比为4:1_2:1。
[0019]所述搅拌为磁力搅拌，搅拌时间为12-24h，搅拌速度为100-150r/min ;所述离心速率为5000r/min，离心时间为lOmin。
[0020]所得到的LM-HA/DOX中，LM-HA纳米颗粒对DOX的负载效率为67.2%。
[0021 ] 本发明采用硅烷偶联剂修饰LAP表面得到氨基化锂皂石，再通过化学键合HA得到了透明质酸修饰的氨基化锂皂石LM-HA。这一载体不仅可以通过透明质酸的靶向作用被肿瘤细胞主动摄取，同时可以延长载体在体内循环时间，改善药物释放特性。本发明的LM-HA载体用于抗肿瘤药物负载，对CD44受体高表达的肿瘤细胞具有良好的靶向效果，可作为理想的靶向纳米载体，实现药物、基因或诊断分子探针的负载与靶向输送。
[0022]本发明使用热重分析、红外分析等方法表征本发明制备的LM-HA纳米颗粒，紫外-可见光谱测试可以验证药物的成功负载。同时用MTT细胞毒性法、流式细胞术分析和激光共聚焦显微镜来检验本发明的LM-HA/DOX对表面CD44受体高表达的子宫颈癌细胞(Hela细胞)的毒性与靶向性。具体测试结果如下:
[0023](I)热重分析
[0024]在附图1可以看出，在200-600°C范围内，修饰前纳米颗粒(LAP)的失重量为
5.09%。修饰后，LM和LM-HA的失重量分别是10.59%和22.93。这一温度范围内的失重主要源于有机分子的热分解，因此LM与LM-HA的失重增加证明硅烷偶联剂分子与透明质酸分子均成功修饰到锂皂石表面。
[0025](2)红外分析
[0026]在附图2所示的红外测试结果中，1260CHT1处为LM中S1-O键的伸缩振动，证明LAP成功氨基化。LM-HA的FT-1R图谱，HA的特征峰出现在1615cm—1 (氨基化合物I振动峰)，1413CHT1 (羧基的对称拉伸振动峰)，1152CHT1 (乙缩醛的骨架振动峰)和1043CHT1 (C-0拉伸振动峰)，证明HA成功地连接在LM上。
[0027](3)紫外-可见光谱测试
[0028]在附图3所示的紫外-可见光谱测试结果中，载药前，LM-HA在200到800nm波长范围内均没有明显的吸收峰。在负载DOX之后，材料在480nm附近显示出一个明显的吸收峰。根据文献报道，这个吸收峰为DOX的紫外特征吸收峰。因此，表面修饰的锂皂石纳米颗粒仍然能够负载抗肿瘤药物D0X。通过紫外定量分析，在投料比为LM-HA = DOX = 3:1的条件下，LM-HA的载药效率为67.2%。
[0029](4)体外释放试验
[0030]附图4为LM-HA/D0X的体外累积释放曲线。在168小时中，DOX在pH = 5.4的弱酸性环境中从LM-HA/D0X中累计释放比在pH = 7.4的中性环境中累计释放量高。这说明基于锂皂石的载药体系均具有PH响应性，即在与肿瘤组织类似的弱酸性环境中的释放速度快，累积释放率高，而在正常组织的中性环境中释放速度慢，累积释放率低，说明这一体系可以有效减少DOX在体内循环过程中在正常组织处的释放，将药物集中在肿瘤组织部位释放，减少了 DOX对正常组织的毒性，提高对肿瘤细胞恶性增殖的抑制效果。
[0031](5)生物相容性和抗肿瘤效果评价
[0032]为评价载体的生物相容性，选择CD44受体高表达的子宫颈癌细胞Hela细胞作为模型，通过MTT比色法测定Hela细胞与不同浓度的LM-HA纳米颗粒共培养后的细胞活力，如图5a。与PBS对照组相比，LM-HA在实验浓度1.5到96 μ g/mL范围内对细胞的存活率没有显著性差异(细胞存活率均在88%以上)，表明材料具有良好的生物相容性。为了验证载药纳米颗粒的抗肿瘤效果，通过MTT比色法测定了与不同浓度的单纯DOX和LM-HA/D0X共培养24h的Hela细胞的活力，如图5b。在相同的药物浓度条件下，经LM-HA/D0X处理的Hela的细胞活性明显低于纯药DOX处理的Hela的细胞活性。这一结果表明本发明所述的靶向材料LM-HA/D0X具有良好的生物相容性和优于裸药的抗肿瘤效果。
[0033](6)细胞吞噬实验
[0034]以CD44受体高表达的子宫颈癌细胞Hela细胞为模型细胞评价制备的纳米颗粒的靶向性，同时与浓度为ImM的纯HA共培养2h的Hela细胞作为对照。
[0035]Hela 细胞分别经 LM-HA/DOX，HA treated+LM-HA/DOX 以及 PBS 和纯 DOX 处理后的共聚焦显微镜观察，如图6。其中细胞核经染色显示蓝色荧光，DOX具有红色荧光。对比纯DOX和LM-HA/D0X处理的Hela细胞发现，LM-HA/D0X处理的Hela细胞具有更强的红色荧光，表明经载体包裹的药物更容易被细胞摄取。同时，与HA treated+LM-HA/DOX处理的Hela细胞相比，LM-HA/D0X处理的Hela细胞具有更强的红色荧光，表明LM-HA/D0X更容易被 CD44 表达的 Hela细胞摄取。Hela细胞经 LM_HA/D0X，HA treated+LM-HA/DOX 以及 PBS 和纯DOX处理后的流式细胞仪检测，如图7。与纯DOX处理的Hela细胞相比(图7b)，LM_HA/DOX处理的Hela细胞(图7d)具有显著增强的荧光值，说明经载体包裹的药物更容易被细胞摄取。经游离透明质酸共培养后的Hela细胞与LM-HA/D0X培养(图7c)，则细胞中的荧光强度明显降低。这说明细胞对载药微粒的摄取明显降低，LM-HA/D0X进入细胞的途径主要是借助Hela细胞表面高表达的CD44受体与载体表面的透明质酸直接的特异性的识别作用。共聚焦显微镜观察图片和流式细胞仪数据充分说明透明质酸修饰的载体材料显著提高药物输送体系的特异性结合能力，促进癌细胞对载药复合物的摄取，赋予了载药体系主动靶向肿瘤的特性。
[0036]有益效果
[0037]本发明提高了纳米颗粒的稳定性和生物相容性，同时对CD44受体高表达的癌细胞具有特异性的靶向作用，可应用于靶向输送抗癌药物；制备方法简单，反应条件温和，易于操作，具有产业化实施的前景。
【附图说明】