浸渗有人脐带沃顿胶质干细胞的伤口敷料纳米筛的制作方法

文档序号:8343783阅读:278来源:国知局
浸渗有人脐带沃顿胶质干细胞的伤口敷料纳米筛的制作方法
【专利说明】浸渗有人脐带沃顿胶质干细胞的伤口敷料纳米筛
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2012年8月15日提交的美国临时申请No. 61/683,391的权益。上 面申请的整体教导通过引用并入本文。
[0003] 发明背景
[0004] 未愈合伤口是患有糖尿病、肾衰竭、烧伤和褥疮的患者中的慢性问题。糖尿病伤口 导致足溃疡,其最终落得下肢截肢(lower limb amputation)并且一些个体容易出现异常 的伤口愈合,导致称为瘢痕瘤(keloid)的难看瘢痕,这是美容损害和社会心理负担。目前 用来加速伤口愈合的方法仅取得了有限的成功,并且当治疗时,瘢痕瘤频繁复发。瘢痕瘤表 现得像良性肿瘤使得其治疗起来甚至更具挑战性。仅在美国,每年估计花费250亿美元来 治疗慢性伤口并且由于人口老龄化以及糖尿病和肥胖发生率的提高,所述问题日益成为全 世界性的。

【发明内容】

[0005] 本文示出的是具有可用于愈合伤口和抑制瘢痕(例如,瘢痕瘤抑制)之某些独特 性质的来自人脐带沃顿胶质干细胞(stem cell from human umbilical cord Wharton' s jelly,hWJSC)的用途。本文还示出的是WJSC/提取物(I)破坏致瘤性细胞的能力和(2) 促进细胞增殖的能力,将所述能力提供给包含WJSC/提取物(例如,浸渗(impregnate)有 WJSC/提取物的芦荟(aloe vera)-纳米纤维筛)的医用敷料(例如,伤口敷料贴剂),将其 施加到伤口以递送特定分子,从而导致瘢痕形成(例如瘢痕瘤形成)的抑制和/或伤口愈 合。
[0006] 因此,在一个方面中,本发明涉及在有此需要的个体中治疗伤口的方法,所述方法 包括将所述伤口与有效量的组合物接触,所述组合物包含(i)沃顿胶质干细胞(Wharton's jelly stem cell,WJSC),(ii)已经用 WJSC 调节(condition)的细胞培养基,(iii)WJSC 的裂解物,(iv)已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基,或 (V)其组合。
[0007] 在另一个方面中,本发明涉及在有此需要的个体中治疗伤口以抑制瘢痕形成的方 法,所述方法包括将所述伤口与有效量的组合物接触,所述组合物包含(i)沃顿胶质干细 胞(WJSC),(ii)已经用WJSC调节的细胞培养基,(iii)WJSC的裂解物,(iv)已经用暴露于 凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的WJSC调节的细胞培养基,或(V)其组合。
[0008] 在再一个方面中,本发明涉及医用敷料,其包含沃顿胶质干细胞(WJSC)、已经用 WJSC调节的细胞培养基、WJSC的裂解物、已经用暴露于凋亡的皮肤细胞和瘢痕瘤细胞的 WJSC调节的细胞培养基或其组合。
[0009] 在另一些方面中,本发明涉及药物组合物,其包含本文所述的医用敷料。
[0010] 沃顿胶质干细胞及其提取物相比其他干细胞来源具有若干优点并且是用于多种 基于细胞之治疗的有吸引力的干细胞。此外,hWJSC大量释放透明质酸(HA)和糖胺聚糖 (GAG),这些是用于组织修复的基本结构单元(building block)。
【附图说明】
[0011] 图1示出瘢痕瘤/伤口愈合的伤口敷料贴剂的图示。A :hWJSC ;B :hWJSC提取物;C : hWJSC-PCM ;D :芦荟-纳米纤维筛;E :浸渗有hWJSC的芦荟-纳米纤维筛;F :浸渗有hWJSC 提取物的芦荟纳米纤维筛;G :浸渗有hWJSC-PCM的芦荟-纳米纤维筛;H、I、J :最终的伤口 敷料贴剂;K :示出芦荟-纳米纤维和hWJSC交替层的伤口敷料贴剂截面;L :伤口敷料贴剂; M :将伤口敷料贴剂施加到瘢痕瘤上。
[0012] 图2示出PCL/芦荟纳米纤维膜的制造,a)旋转转鼓(rotating drum),b)具有 纳米纤维膜的旋转转鼓,c)PCL/芦荟的SEM图像(2500X),d)纳米纤维的更高放大倍率 (10000 X)。纤维直径为400nm至425nm,厚度为0. 5mm至Imm并且膜孔隙度为85 %至95 %。
[0013] 图3A至3C : (3A)暴露于hWJSC-CM (0小时至72小时)的C⑶成纤维细胞的划 痕-伤口测定(scratch-wound assay) (D0至D3)。a至d:在未调节的培养基KOSR培养基 (UCM)中生长的C⑶成纤维细胞(对照);e至h :在CXD-CM中生长的C⑶成纤维细胞(对 照);i至1 :在hWJSC-CM中生长的C⑶成纤维细胞(治疗)。在a、e和i中的白色箭头表 示在DO没有CCD成纤维细胞之单层中间的垂直划痕。在j、k和1中的黑色箭头示出与对照 相比,CXD迀移到hWJSC-CM臂(arm)中的划痕更快。在hWJSC-CM臂中的划痕到D2完全闭 合。(3B)在48小时和72小时,与两个对照相比,在hWJSC-CM臂中细胞侵入到划痕伤口的平 均土SEM数是显著更大的(* p < 0. 05)。(3C)在72小时,与两个对照相比,在hWJSC-CM 臂中的平均土SEM CXD生存力(MTT测定)是显著更大的(* p <0· 05)。
[0014] 图4A至4E : (4A、4B)与对照相比,在hWJSC-CM治疗臂中的胶原蛋白(Sircol测 定)和弹性蛋白(Fastin测定)的平均土SEM水平是显著更高的p < 0.05)。(4C 至4E) qRT-PCR分析示出,与对照相比,在hWJSC-CM臂中的(4C) I型胶原蛋白、(4D) III型 胶原蛋白和(4E)纤连蛋白的表达显著更高(* p < 0.05)。GAPDH是内对照。使用比较 Ct (Λ ACT)法进行了数据分析和相对定量。
[0015] 图5A至5C : (5A)小鼠切除伤口的数字化图像,其示出与对照(GFP-(XD、(XD-CM和 UCM)相比,在暴露于GFP-hWJSC和hWJSC-CM(治疗臂)(白色箭头)的SCID小鼠中到第14天 (D14)之更快的伤口闭合。(15B)在第7天,与对照相比,在治疗臂(GFP-hWJSC和hWJSC-CM) 中,SCID小鼠中切除伤口之平均土SEM百分比愈合率是显著更快的(* p < 0.05)。在第 14天,与对照相比,GFP-hWJSC治疗臂的平均土SEM百分比伤口闭合率是显著更快的(* p < 0. 05)。(5C)在第3天、第7天和第14天(D3、D7、D14)所采集的鼠伤口组织活检之苏 木精和伊红组织切片。与对照相比,在治疗组(GFP-hWJSC和hWJSC-CM)中的伤口表皮和真 皮示出更快的上皮再形成、复层鳞状上皮的形成、增加的细胞构成和脉管系统以及随时间 而增加的皮脂腺和毛囊数量。D :真皮;E :表皮;HF :毛囊;SG :皮脂腺;SSE :复层鳞状上皮。 比例尺=100 μ m。
[0016] 图6A至6C : (6A)小鼠糖尿病伤口的数字化图像,其示出与对照(UCM)相比,在暴 露于GFP-hWJSC和hWJSC-CM(治疗臂)(白色箭头)的糖尿病小鼠中到第28天(D28)的更 快伤口闭合。(6B)与对照相比,在D7,在GFP-hWJSC治疗臂中和在D28,在hWJSC-CM治疗 臂中,糖尿病小鼠中糖尿病伤口之平均土SEM百分比愈合率是显著更快的(* p < 0.05)。 (6C)在第7天、第14天和第28天(D7、D14、D28)所采集的鼠糖尿病伤口组织活检之苏木 精和伊红组织切片。到D7,与对照相比,在治疗组(GFP-hWJSC和hWJSC-CM)中的伤口表皮 和真皮示出上皮细胞再形成、皮脂腺和一些毛囊的形成。到D14和D28,与对照相比,治疗 臂(GFP-hWJSC和hWJSC-CM)的伤口组织活检的表皮示出复层鳞状上皮的形成并且真皮示 出增加的细胞构成、脉管系统以及皮脂腺和毛囊数量。E :表皮;HF :毛囊;SG :皮脂腺;S :基 质;SSE :复层鳞状上皮。比例尺=100 μ m。
[0017] 图7 :在D14和D28的糖尿病小鼠伤口组织活检的荧光免疫组织化学图像,其示出 绿色荧光蛋白(GFP)标记的hWJSC(短细箭头)和阳性人角质形成细胞标志物(红色)(粗 长箭头)。a、d表示细胞角蛋白克隆AE1/AE3 ;b、e表示内披蛋白并且c、f表示聚丝蛋白 DAPI:蓝色。比例尺=50μηι。
[0018] 图8Α至8Β :在第3天至第28天(D3至D28),在(8Α)切除伤口组织活检和(8Β) 糖尿病伤口组织活检中使用TaqMan探针之小鼠 ICAM-1、HMP-1和VEGF-A的qRT-PCR mRNA 表达。(8A)在D3,在GFP-hWJSC治疗的切除伤口中的I CAM-1 mRNA水平显著高于对照 (CCD-CM和GFP-CCD) ( * p < 0. 05)。在D3,与对照相比,在GFP-hWJSC治疗的切除伤口中 ??ΜΡ-1表达也是显著上调的(* p < 0. 05)。在D3,与对照相比,在hWJSC-CM治疗的切除 伤口中,VEGF-A mRNA表达示出6倍的增加(* p < 0. 05)。在D7,与对照相比,GFP-hWJSC 和hWJSC-CM治疗的切除伤口臂示出显著更高的ICAM-1、??ΜΡ-1和VEGF-A表达水平(* p < 0. 05)。在D14,切除伤口的ICAM-I水平在组之间没有显著差异,但是,与对照相比,在 GFP-hWJSC和hWJSC-CM治疗的切除伤口中,VEGF-A水平是显著更高的(* p < 0. 05)。(8B) 对于糖尿病伤口,与对照相比,hWJSC-CM治疗臂示出在D7和D14显著更高水平的??ΜΡ-1以 及在D7和D28显著更高水平的VEGF-A。在D28, GFP-hWJSC臂的VEGF-A水平显著高于对 照(* P < 〇· 05) 〇
[0019] 图9 :示出伤口敷料贴剂制备的示意图。通过电纺丝来制备AV/PCL纳米支架并用 GFP-hWJSC 或 hWJSC-CM 浸渗。
[0020] 图IOA至IOF(IOAUOB)示出孔和小环境(niche)之AV/PCL随机排列的纳米纤 维的低和高放大倍率扫描电子显微照片(2500X ;15, 000X)。(IOC):示出hWJSC附着并 在纳米纤维上生长的扫描电子显微照片(2500X)。(IODUOE):在72小时之后,浸渗有 GFP-hWJSC的AV/PCL纳米支架之侧视图和表面视图的共聚焦荧光图像。注意到,GFP-hWJSC 生长到纳米支架中。(IOF):不同形状的最终实际伤口敷料贴剂。
[0021] 图 IlA 至 111 : (IlA)暴露于 hWJSC-CM+AV/PCL(治疗)、CCD-CM+AV/PCL(对照)和 UCM+AV/PCL (对照)的C⑶成纤维细胞(72小时;DO至D3)的划痕-伤口测定。a至i :注意 到,在D0,在治疗和对照测定中没有细胞(白色箭头)的空白(vacant)线性划痕(伤口)。 b至j :注意到,在Dl,C⑶从伤口边缘迀移到空白区域内,其中在hWJSC-CM+AV/PCL治疗组 (黑色箭头)中迀移最大。c至k和d至1 :注意到,与对照相比,在D2和D3,hWJSC-CM+AV/ PCL治疗组中的CXD的更快迀移,其中到D2和D3伤口完全覆盖。(IlB)示出与对照相比, 在hWJSC-CM+AV/PCL治疗组中,平均土 SEM伤口闭合百分比显著更高(p <0. 05)的直方图。 (11C、11D、11E、11F)示出与对照相比,在hWJSC-CM+AV/PCL治疗组中,划痕-伤口测定中的 细胞生存力、总胶原蛋白、弹性蛋白和SOD浓度显著更高(p< 0.05)的直方图。(11G、11H、 111)是这样的直方图,其示出与对照相比,在hWJSC-CM+AV/PCL治疗组中,划痕-伤口测定 中胶原蛋白III和纤连蛋白的qRT-PCR cDNA表达水平显著更高(p < 0. 05)而MMP-I尽管 更高但是与对照没有显著差异。
[0022] 图12A至12C : (12A)与所有其他臂相比,在GFP-hWJSC+AV/PCL治疗臂中,到第7 天,在SCID小鼠中的切除伤口的数字化图像示出更快的伤口闭合。(12B)在第7天,与对 照相比,在GFP-hWJSC+AV/PCL臂中,SCID小鼠中的平均土 SEM百分比伤口闭合率是显著更 快的(P < 〇. 05)。在第 14 天,与对照相比,在 GFP-hWJSC+AV/PCL 和 hWJSC-CM+AV/PCL 臂 中,伤口闭合率是显著更高的(P < 0.05)。(12C)在第3天、第7天和第14天采集的切除 伤口组织活检的代表性苏木精和伊红组织切片。(对于每组,检查4个至7个组织切片)。 a至e :在第3天,在GFP-hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL治疗组中的伤口组织活检示出 增加的肉芽形成(granu I at i on)、上皮细胞再形成以及少量皮脂腺和毛囊的出现,而对照则 示出断裂的上皮和覆盖有血液、纤维蛋白和渗出物的伤口表面。f至j和k至〇 :在第7和 14天,与对照相比,在治疗臂(GFP-hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL)中的伤口的表皮示 出复层鳞状上皮的形成、增加数量的皮脂腺和毛囊以及更多的细胞构成和脉管系统。D :真 皮;E :表皮;HF :毛囊;K ;角蛋白;SG :皮脂腺;SSE :复层鳞状上皮。比例尺=100 μm。
[0023] 图 13A 至 13D : (13A)到第 28 天,与对照相比,在 GFP-hWJSC+AV/PCL 和 hWJSC-CM+AV/PCL治疗臂中,db/db小鼠中之糖尿病伤口的数字化图像示出完全的伤口闭 合。(13B)在第7天,糖尿病伤口的GFP-hWJSC+AV/PCL治疗臂之平均土SEM百分比伤口 闭合率显著高于对照,而在第14天,hWJSC-CM+AV/PCL治疗组的平均土SEM百分比伤口闭 合率显著高于对照(p < 0. 05)。(13C)在第7天,与对照相比,在GFP-hWJSC+AV/PCL和 hWJSC-CM+AV/PCL治疗组中,糖尿病伤口组织活检的组织学检查示出上皮细胞再形成、皮脂 腺和毛囊。在第14天和第28天,与对照相比,相同的治疗组示出复层鳞状上皮的形成、增 加的细胞构成和脉管系统以及增加的皮脂腺和毛囊数量。在第28天,没有接受任何治疗的 对照的糖尿病伤口没有复层鳞状上皮,仅有少量的皮脂腺和毛囊并且没有表现出典型的正 常皮肤表型。D :真皮;E :表皮;HF :毛囊;SG :皮脂腺;S :基质;SSE :复层鳞状上皮。比例尺: 100 μ m。(13D) a、d :在糖尿病伤口中,在第14天和第28天出现人细胞角蛋白的阳性染色, 而在第14天,人内披蛋白明显并且在第28天出现人聚丝蛋白。长箭头:在糖尿病伤口组织 活检中活的GFP-hWJSC。短箭头:阳性人角质形成细胞标志物(细胞角蛋白、内披蛋白和聚 丝蛋白)。
[0024] 图14A至14B : (14A)在第7天,用GFP-hWJSC+AV/PCL治疗之小鼠的切除伤口中 的ICAM-I mRNA水平显著高于对照,而在第14天,hWJSC-CM+AV/PCL治疗臂的??ΜΡ-1和 VEGF-A表达显著高于所有其他组(p < 0. 05)。(14B)对于糖尿病伤口,在第14天,与其 他组相比,两个治疗组(GFP-hWJSC+AV/PCL和hWJSC-CM+AV/PCL)的??ΜΡ-1水平均显著更 高,而在第14天,与其他组相比,仅GFP-hWJSC+AV/PCL治疗组的VEGF-A表达显著更高(p < 0· 05) 〇
[0025] 图15A至15D : (15A)对附着至塑料的人瘢痕瘤细胞之倒置相衬光学 (phase-contrast inverted optical)图像,并且其示出在贴壁培养条件下的纺锤状成纤 维细胞样细胞形态。(15B)在此培养条件下,瘢痕瘤细胞在混悬液中聚簇成球体。(15C)在 贴壁培养以及(15D)球体培养中的瘢痕瘤细胞之CD标志物的FACS分析。数据来自三次独 立实验并且各等值线图表示对于每个⑶标志物,FITC阳性细胞相对未染色对照的百分比。
[0026] 图16A至16B : (16A)暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL的人瘢痕瘤细胞之形态学变化 的相衬图像。a至c:注意到,对照(未治疗的、(XD-CM、(XD-CL)的瘢痕瘤细胞在72小时形 成完全的汇合单层,具有其典型的成纤维细胞形态和若干圆形有丝分裂细胞(白色箭头)。 d、e :暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL的瘢痕瘤细胞具有减少的细胞数、无有丝分裂细胞并且 早经历细胞死亡。(16B)在对照(未治疗的、(XDCM、(XD-CL)中,瘢痕瘤细胞之⑶标志物 (CD29、CD44、CD73、CD90、CD 105)的表达仍然很高,而治疗组(hWJSC-CM 和 hWJSC-CL)的那 些降低。
[0027] 图17A至17F : (17A)示出与对照(未治疗的、CCD-CM、CCD-CL)相比,在72小时, 暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL的人瘢痕瘤细胞的细胞增殖(MTT测定)显著降低的直方图。 所有值均是来自三次不同重复的平均值土SEM。* p < 0. 05。(17B至17F)细胞周期分析 (流式细胞术-PI)示出与对照(未治疗、CCD-CM、CCD-CL)相比,暴露于治疗(hWJSC-CM和 hWJSC-CL)的人瘢痕瘤细胞增加了亚-Gl (细箭头)和G2/M(粗箭头)。
[0028] 图18A至18B : (18A)人瘢痕瘤细胞的等值线图(膜联蛋白V-FITC流式细胞术), 其示出与对照相比,当暴露于hWJSC-CM和hWJSC-CL时,显著更多的阳性细胞。值是来自 三次不同重复的平均值土SEM。(18B)与对照(未治疗、(XD-CM、(XD-CL)相比,当暴露于 hWJSC-CM和hWJSC-CL时,TUNEL阳性人瘢痕瘤细胞的图像。将DNA酶处理的细胞用作阳性 对照(PC)。
[0029] 图19A至19C :(19A)划痕-伤口测定的相衬图像,其示出在对照中(未治疗、 CCD-CM、CCD-CL)中,人瘢痕瘤细胞从划痕的边缘迀移到空白区域,其中空白区域到48小时 完全闭合,而治疗(hWJSC-CM和hWJSC-CL)的瘢痕瘤细胞停止其迀移并且空白区域在48小 时时没有被覆盖(箭头)。(19B)人瘢痕瘤细胞的免疫细胞化学图像,其示出阳性的角质形 成细胞相关的标
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