麸质相关病症的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关专利申请的夺叉引用
[0002] 本申请要求2012年6月18日提交的美国临时专利申请No. 61/661，105和2012 年11月13日提交的美国临时专利申请No. 61/725, 693的优先权益，为了可要求美国临时 专利申请No. 61/661，105和美国临时专利申请No. 61/725, 693的优先权益的任意美国专利 申请，上述在先提交的专利申请的全部内容在此以引用方式全文纳入本文。
技术领域
[0003] 本发明涉及益生菌有机体和含有由益生菌有机体产生的代谢产物的组合物。所述 组合物有益于或者可治疗麸质相关病症例如乳糜泻。
【背景技术】
[0004] 麸质和麸质相关的多肽发现于许多谷物例如小麦、黑麦和大麦中。对于具有麸质 相关病症例如乳糜泻和麸质敏感的个体，消耗含麸质的食物可产生严重并且持久的健康后 果。乳糜泻是在具有遗传倾向的人群中由麸质的消耗引发的小肠的自身免疫病症。麸质的 某些片段（"麦醇溶蛋白"）可刺激能够永久性损伤小肠并阻碍营养吸收的免疫应答。乳 糜泻可产生广泛的症状。最常见的包括腹泻、腹胀、体重减轻和发育迟缓（儿童）。乳糜泻 还可与缺铁性贫血、骨质疏松症、身材矮小症、关节炎、不育、周围神经病变和肝功能衰竭相 关。乳糜泻患者还具有增加的患某些种类肿瘤例如小肠癌和非霍奇金淋巴瘤的风险。欧洲 血统人群中乳糜泻的发病率据估计介于0.5%和1.5%之间。美国和欧洲以及亚洲发病率 的增加部分地是由于采用了欧化的膳食结构。乳糜泻通常于婴儿期或儿童期被诊断出，虽 然成年期被诊断出的数量也在上升。目前尚无法治愈乳糜泻，并且标准治疗是终生限定于 不含麸质饮食。
[0005] 麸质敏感与乳糜泻相比较少被很好地表征。其产生许多相同的症状，但不包括对 小肠的损伤。诊断倾向于基于排除标准作出，并且一旦给予受试者不含麸质饮食即可改善 症状。
[0006] 坚持不含麸质饮食需要严格避免小麦、黑麦和大麦制品。这会成为挑战，由于通常 缺乏对于食物中麸质含量的标志信息；食物加工和制备过程中可能的污染，特别是对于那 些在室外制备的食物；不含麸质制品的经济负担以及严格地坚持所需的意志力。也可通过 教育和咨询、家庭和社会支持以及心理因素影响顺应性。此外，严格坚持不含麸质饮食可导 致微量营养物缺乏。所述缺乏尤其是B族维生素（维生素 B6、维生素 B12和叶酸）以及某 些微量元素例如铁、锌和铜的缺乏，可潜在地导致显著的健康问题，尤其是儿童。持续地需 要治疗剂以治疗麸质相关的病症。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了组合物，其含有由副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei)CBA L74(国际保藏登记号LMG P-24778)产生的一种或多种代谢产物。所述代谢产物可减低 具有麸质相关的病症的受试者的麦醇溶蛋白肽毒性。所述代谢产物，其对于高于标准生理 温度的温度基本上稳定，可减少麦醇溶蛋白肽的细胞进入。所述麦醇溶蛋白肽可不同并且 可包括含有由T-细胞识别的一种或多种表位的肽例如P57-68和由先天免疫系统识别的 肽例如P31-43。示例性肽包括α-麦醇溶蛋白肽例如具有选自由LGQQQPFPPQQPY(SEQ ID N0:1)、QLQPFPQPQLPY(SEQ ID N0:2)、LGQQQPFPPQQPYPQPQPF(SEQ ID N0:3)和 LQLQPFPQP QLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ ID N0:4)组成的组的氨基酸序列的肽。在一些实施方 案中，所述代谢产物部分地或者基本上不含副干酪乳杆菌CBA L74(国际保藏登记号LMG P-24778)细胞。所述组合物还可包括生理上可接受的载体例如食物制品或药物载体。
[0008] 还提供了用于治疗具有麸质相关的病症的受试者的方法，所述方法包括鉴别需 要治疗的受试者并且施用有效量的含有由副干酪乳杆菌CBA L74(国际保藏登记号LMG P-24778)产生的代谢产物的组合物，其中所述代谢产物可减低麦醇溶蛋白肽毒性。所述方 法和组合物可用于治疗任意麸质相关病症包括乳糜泻包括多种亚型，例如典型乳糜泻、非 典型乳糜泻、潜伏乳糜泻和沉默乳糜泻、疱瘆样皮炎、麸质共济失调和麸质敏感。所述方法 和组合物可与麸质相关病症的普通治疗例如饮食治疗一起施用。
【附图说明】
[0009] 本发明的这些及其他特征和优点将通过对下述本发明优选实施方案的详细描述 更充分地公开或明显地展现，其应当与附图一起考虑，其中相同的数字表示相同的部分并 且进一步地其中：
[0010] 图1是副干酪乳杆菌菌株CBA L74对P31-43liss进入CaC〇2细胞的影响检测。
[0011] 图2是示出不同浓度的副干酪乳杆菌菌株CBA L74对P31-43liss进入CaC〇2细胞 的影响的检测结果柱状图。
[0012] 图3是示出不同浓度的副干酪乳杆菌菌株CBA L74对P57-68liss进入CaC〇2细胞 的影响的检测结果柱状图。
[0013] 图4是副干酪乳杆菌菌株CBA L74DNA对P31-43liss进入CaCo2细胞的影响检测。
[0014] 图5a是示出副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43liss进入CaC〇2细胞的影响 的检测结果柱状图；图5b是副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43liss进入CaC〇2细胞 的影响检测。
[0015] 图6a是示出副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P57-68liss进入CaCo2细胞的影响 的检测结果柱状图；图6b是副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P57-68liss进入CaC〇2细胞 的影响检测。
[0016] 图7a是示出热处理副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31_43liss进入CaCo2细胞 的影响的检测结果柱状图；图7b是热处理副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43liss进 入CaCo2细胞的影响检测。
[0017] 图8是来自发酵的稻的副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43liss进入CaC〇2 细胞的影响检测。
[0018] 图9是示出来自发酵的稻和发酵的燕麦的副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对 P31-43liss进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。
[0019] 图10是示出来自发酵的稻和发酵的燕麦的副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对葡 聚糖-得克萨斯红进入CaC〇2细胞的影响的检测结果柱状图。
[0020] 图11是示出副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对Alexa Fluor?偶联的EGF进入 CaC〇2细胞的影响的检测结果柱状图。
[0021] 图12是副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对Alexa Fluor?偶联的EGF进入CaCo2 细胞的影响检测。
[0022] 图13a、13b、13c和13d是副干酪乳杆菌菌株CBA L74对P31-43liss进入CaCo2细 胞的影响检测。图13a示出了未处理的对照细胞；图13b示出了用10 4cfu/ml副干酪乳杆 菌CBA L74处理的CaCo2细胞；图13c示出了用106cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理的 CaCo2细胞；图13d示出了用108cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理的CaCo2细胞。
[0023] 图14是示出不同浓度副干酪乳杆菌菌株CBA L74对P31-43liss进入CaC〇2细胞的 影响的检测结果柱状图。
[0024] 图15a、15b、15c和15d是副干酪乳杆菌菌株CBA L74对P57-68liss进入CaCo2细 胞的影响检测。图15a示出了未处理的对照细胞；图15b示出了用10 4cfu/ml副干酪乳杆 菌CBA L74处理的CaCo2细胞；图15c示出了用106cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理的 CaCo2细胞；图15d示出了用108cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74处理的CaCo2细胞。
[0025] 图16是示出不同浓度副干酪乳杆菌菌株CBA L74对P57-68liss进入CaCo2细胞的 影响的检测结果柱状图。
[0026] 图17是示出108cfu/ml副干酪乳杆菌菌株CBA L74对P31-43liss和P57-68 liss进 入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。
[0027] 图18a、18b和18c是副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43liss进入CaCo2细 胞的影响检测。图18a示出了未处理的对照细胞；图18b示出了用10 8cfu/ml副干酪乳杆 菌CBA L74处理的CaCo2细胞；图18c示出了用从108cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74收集 的上清处理的CaC〇2细胞。
[0028] 图19是示出副干酪乳杆菌菌株CBA L74细胞和副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清 对P31-43liss进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。
[0029] 图20a、20b和20c是副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P57-68liss进入CaCo2细 胞的影响检测。图20a示出了未处理的对照细胞；图20b示出了用10 8cfu/ml副干酪乳杆 菌CBA L74处理的CaCo2细胞；图20c示出了用从108cfu/ml副干酪乳杆菌CBA L74收集 的上清处理的CaC〇2细胞。
[0030] 图21是示出副干酪乳杆菌菌株CBA L74细胞和副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清 对P57-68liss进入CaCo2细胞的影响的检测结果柱状图。
[0031] 图22a和22b是副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对EGF-Alexa 488进入CaCo2细 胞的影响检测。图20a示出了未处理的对照细胞；图20b示出了用从108cfu/ml当量的副 干酪乳杆菌CBA L74中收集的上清处理的CaC〇2细胞。
[0032] 图23是示出副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对EGF-Alexa 488进入CaCo2细胞 的影响的检测结果柱状图。
[0033] 图24&、2413和24(3是去除副干酪乳杆菌菌株084 1^4上清对？31-431&进入〇3(：〇2 细胞的影响检测。图20a示出了未处理的对照细胞；图20b示出了用副干酪乳杆菌CBA L74 上清处理的CaC〇2细胞；图20c示出了用被移除的副干酪乳杆菌CBA L74上清处理的CaC〇2 细胞。
[0034] 图25是示出副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清处理然后将其移除对P31-43liss进入 CaC〇2细胞的影响的检测结果柱状图。
[0035] 图26a、26b、26c和20d是热处理的副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43liss 进入CaCo2细胞的影响检测。图26a示出了未处理的对照细胞；图26b示出了用副干酪乳 杆菌CBA L74上清处理的CaC〇2细胞；图26c示出了用煮沸过的副干酪乳杆菌CBA L74上 清处理的CaC〇2细胞；图26d示出了用80°C加热过的副干酪乳杆菌CBA L74上清处理的 CaCo2细胞。
[0036] 图27是示出热处理的副干酪乳杆菌菌株CBA L74上清对P31-43liss进入CaCo2细 胞的影响的检测结果柱状图。
【具体实施方式】
[0037] 应结合附图来理解对优选实施方案的描述，附图应被认为是本发明整个说明书的 一部分。为清楚和简洁的目的，附图不一定按比例，并且本发明的某些特征可在比例上以夸 大的形式示出，或者某些特征可能是以略带示意性的形式示出的。本说明书中，相对性术语 例如"水平"、"垂直"、"上"、"下"、"顶部"和"底部"及其派生词（例如"水平地"、"向下地"、 "向上地"等）应被理解为涉及其后所描述的或者下文中附图所示的方向。这些相对性术 语是为描述方便并且通常不意图要求具体的方向。如果适当，包括"向内地"相对于"向外 地"、"纵向的"相对于"横向的"等术语应相对于彼此或相对于延长轴、旋转轴或旋转中心来 解释。除非另有说明，关于附接、联接及类似情形的术语，例如"连接的"和"互连的"，是指 其中的结构通过中间结构直接或间接地相互紧固到一起或附接在一起的关系，并且这些术 语还指活动的或刚性的附接或关系。术语"可操作地连接"是指能使相关结构根据其连接关 系按预定方式运行的附接、联接或连接。当仅示出单个装置时，术语"装置"也应包括单独地 或共同地执行一套（或多套）指令以实现本文所讨论的任何一种或多种方法的装置的任意 集合。权利要求书中，装置加功能的写法（如果使用的话）意在覆盖由说明书或附图描述、 暗示或由于说明书或附图而变得明显的用于执行所述功能的结构，这些结构不仅包括结构 等同物而且还包括等同的结构。
[0038] 本发明是部分地基于发明人发现益生菌有机体副干酪乳杆菌菌株CBA L74能够减 少麸质的某些组分进入人肠细胞。更具体地，发明人发现分离的副干酪乳杆菌CBA L74以 及来自副干酪乳杆菌CBA L74的培养物上清可减少α-麦醇溶蛋白肽进入培养的人肠上皮 细胞。此外，还检测到由副干酪乳杆菌CBA L74发酵的食物可减少肽进入。即使当培养物 上清热处理后也检测到对肽进入的影响。相应地，本发明特别描述了可缓解麦醇溶蛋白肽 的毒性效应的组合物。所述组合物可包括副干酪乳杆菌菌株CBA L74细胞、由副干酪乳杆 菌菌株CBA L74产生的代谢产物或者副干酪乳杆菌菌株CBA L74细胞和由副干酪乳杆菌菌 株CBAL74产生的代谢产物的组合。
[0039] 副干酪乳杆菌菌株CBA L74是由发明人分离并且根据国际承认用于专利程序的微 生物保存布达佩斯条约于2008年9月9日保藏在比利时、根特的比利时微生物协作保藏中 心（BCCM)微生物实验室（Laboratorium voor Microbiologie, LMG)。由所述国际保藏单 位提供的保藏登记号为LMG P-24778。为便于阅读，我们不会每次都重复短语"保藏登记号 LMG P-24778"。但是应理解的是当我们提及副干酪乳杆菌菌株CBA L74时，我们是指具有 保藏登记号LMG P-24778的保藏菌株。
[0040] 虽然我们认为我们