知道如何识别负责酶活性的单 个或多个活性位点的氨基酸）。
[0041] 特别地，已经观察到AlM的细胞保护作用依赖于C34侧链的游离亚硫酰基 (thiolyl)基团并且由K92、K118和K130残基调节。因此，含有蛋白的这些部分和/或以 类似方式构造的AlM的类似物被认为具有与AlM相似的效果并且因此由本发明所涵盖。
[0042] 人AlM在三个位置上由低聚糖取代，二个唾液酸化的复合型，可能为二触角碳水 化（carbohydrated)的连接至Asnl7和Asn96,以及连接至Thr5的一个更简单的低聚糖。 尽管来自不同物种的AlM蛋白的碳水化合物含量变化很大，从非洲爪蟾完全没有糖基化到 不同的糖基化模式的范围。然而，对应于人Asn96的一个糖基化位点在哺乳动物中是保守 的，这表明该特定的碳水化合物可能是功能上重要的。
[0043] 当从血楽或尿中纯化时，AlM为黄棕色。颜色由共价结合至主要位于囊（pocket) 开口处的各种氨基酸侧基的异质化合物造成。这些修饰可能表示由体内AIM共价截留的有 机氧化剂氧化降解产物，例如血红素、犬尿氨酸和酪氨酰基团。
[0044] AlM也是电荷和大小异质的并且更深的棕色AlM分子携带更多负电荷。对于异质 的可能解释是不同的侧基被不同程度地修饰为具有不同的基团，并且该修饰改变了蛋白的 净电荷。共价连接的有色物质已经位于Cys34和Lys92、Lysll8和Lysl30,后者具有100 至300道尔顿之间的分子量。发现色氨酸代谢物犬尿氨酸共价连接到来自透化患者尿液的 AlM中的赖氨酰残基，并且在这种情况下表现为蛋白棕色源。合成的基团ABTS (2, 2' -联氮 基-二-(3-乙基苯并噻唑啉）-6-磺酸）的氧化片断结合至Y22和Y132的侧链。
[0045] C34是AlM的反应中心。它变得携带更多负电荷，这意味着它具有高电势以提供电 子，在1(69、1(92、1(118和1(130带正电的侧链附近，其诱导034硫醇基的去质子化。初步数据 表明C34是已知的负电性的基团之一。
[0046] 理论上，表征 A1M(C34、Y22、K92、K118、K130、Y132、L180、1181、P182、R183)的独 特的酶和非酶性质的氨基酸（将在下面更详细地描述）可以布置为另一个框架中的类似的 三维结构，例如，具有相同的球状折叠（另一脂质运送蛋白）或完全人工的有机或无机分子 如塑料聚合物、纳米颗粒或金属聚合物的蛋白。
[0047] 因此，包括含有如上所述的反应性中心及其环境的结构的同源物、片段或变体是 优选。
[0048] 可以在本公开的多肽的结构中做出修饰和改变并且仍得到具有与多肽（例如，保 守氨基酸取代）相似特征的分子。例如，在序列中，某些氨基酸可以取代为其他氨基酸而活 性没有明显的损失。因为是多肽的相互作用的能力以及性质限定了该多肽的生物功能活 性，在多肽序列中可以进行某些氨基酸序列取代，并且仍然获得具有相似性质的多肽。
[0049] 做出这样的改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。氨基酸亲水指数对赋予多肽相 互作用的生物功能的重要性通常是本领域可理解的。众所周知，某些氨基酸可以取代为具 有相似亲水指数或得分的其他氨基酸并且仍然产生具有类似生物活性的多肽。在其疏水 性和电荷特性的基础上，每个氨基酸已分配亲水指数。这些指数是：异亮氨酸（+4.5);缬 氨酸（+4.2);亮氨酸（+3.8);苯丙氨酸（+2.8);半胱氨酸/半胱氨酸（+2.5);甲硫氨酸 (+1. 9);丙氨酸（+1. 8);甘氨酸（-0. 4);苏氨酸（-0. 7);丝氨酸（-0. 8);色氨酸（-0. 9);酪 氨酸（-1.3);脯氨酸（-1.6);组氨酸（-3.2);谷氨酸（-3.5);谷氨酰胺（-3.5);天门冬氨 酸（-3. 5);天冬酰胺（-3. 5);赖氨酸（-3. 9);和精氨酸（-4. 5)。
[0050] 据认为氨基酸的相应亲水特征决定获得的多肽的二级结构，该二级结构进而限定 了多肽与其他分子（如酶、基质、受体、抗体、抗原等）的相互作用。本领域中众所周知的 是，氨基酸可以由具有类似亲水指数的另一氨基酸取代并仍然获得功能上等同的多肽。在 这种变化中，亲水指数在±2以内的氨基酸的取代是优选的，那些在±1的取代是特别优选 的，而那些在±0. 5以内的是甚至更特别优选的。也可以在亲水性的基础上特别是在由此 产生的生物功能上等价的多肽或肽旨在适用于在免疫学实施方式时进行相似的氨基酸的 取代。下列亲水性值已被指定给氨基酸残基：精氨酸（+3.0);赖氨酸（+3.0);天门冬氨酸 (3.0±1);谷氨酸（+3.0±1);丝氨酸（+0.3);天冬酰胺（+0.2);谷氨酰胺（glutamnine) (+0. 2);甘氨酸（0);脯氨酸（-0. 5±1);苏氨酸（-0. 4);丙氨酸（-0. 5);组氨酸（-0. 5);半 胱氨酸（-1.0);甲硫氨酸（-1.3);缴氨酸（-1.5);亮氨酸（-1.8);异亮氨酸（-1.8);酪氨 酸（-2. 3);苯丙氨酸（-2. 5);色氨酸（-3. 4)。应该理解氨基酸可以替换为另一具有相似亲 水性值的氨基酸，并且仍然获得具有生物等效，并且特别是免疫学等效的多肽。在这种变化 中，亲水性值在±2的氨基酸的取代是优选的，那些在±1的是特别优选的，而那些在±0. 5 以内的是甚至更特别优选的。
[0051] 如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相应的相似性，例如，它们的 疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑一个或多个上述特性的示例性取代是本领域技术人 员公知的技术，包括但不限于：（原始残基：示例性的取代）：(Ala:GIy, Ser)、（Arg:Lys)、 (AsniGIn1His) > (Asp:GIu, Cys, Ser)> (GIn:Asn)> (GIu:Asp)> (GIy:Ala)> (His:Asn, Gin)> (lie:Leu, VaI)、（Leu: lie, VaI)、(Lys:Arg)> (Met:Leu, Tyr)> (Ser:Thr)> (Thr:Ser)> (Trp:Tyr)、（Tyr:Trp,Phe)和（VaI:Lle,Leu)。因此本公开的实施方式考虑了如上所述的 多肽的功能性或生物学等价物。具体地，多肽的实施方式可以包括具有感兴趣的多肽的变 体的约50%、60%、70%、80%、90%、和95%的序列同一性。
[0052] 在本发明的上下文中，两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的同源性由参数 "同一'丨生"描述。可以使用完整的Smith-Waterman比对（alignment)进行序列比对和计算 同源性得分（这对于蛋白质和DNA比对都是有用的）。分别将默认得分矩阵BL0SUM50和同 一'丨生矩阵（单位矩阵，identity matrix)用于蛋白质和DNA序列比对。缺口中第一个残基 的罚分对于蛋白为-12,对于DNA为-16,而缺口中额外残基的罚分对于蛋白为-2,对于DNA 为-4。用FASTA打包版本v20u6可以进行比对。
[0053] 可以使用"ClustalW"进行蛋白序列的多重比对。使用该蛋白比对为模板、用来自 DNA序列的对应密码子取代氨基酸可以进行DNA序列的多重比对。
[0054] 可替换地，可以使用不同的软件用于比对氨基酸序列和DNA序列。例如，使用来自 EMBOSS包（http://emboss, org) 2. 8. 0版本的Needle程序来确定两个氨基酸序列的比对。 Needle程序执行在所描述的全局比对算法。所用的取代矩阵是BL0SUM62,缺口开放罚分是 10,以及缺口延伸罚分是〇. 5。
[0055] 氨基酸序列（例如SEQ ID NO :1)与不同氨基酸序列（例如SEQ ID NO :2)之间 的同一性的程度在两个序列的比对中计算为精确匹配的数目除以"SEQ ID NO :1"的长度或 "SEQ ID NO :2"长度（取最短的）。该结果以百分比同一性表示。
[0056] 当两个序列在重叠的相同位置中具有相同的氨基酸残基时发生精确匹配。
[0057] 如果相关，两个核苷酸序列之间的同一性的程度可以通过使用具有统一性表格和 以下多重比对参数确定：缺口罚分为10和缺口长度罚分为10的LASER-GENE? MEGALIGN?( DNASTAR, Inc.，Madison, Wl)的 Wilbur-Lipman 方法测定。逐对序列比对参数为 Ktuple = 3,缺口罚分=3,且窗口 = 20。
[0058] 在具体的实施方式中，多肽的氨基酸序列与或对于SEQ ID NO :1的氨基酸的同 一性的百分比通过以下测定：i)使用具有缺口开放罚分为10,和缺口延伸罚分0.5的 BL0SUM62取代矩阵的Needle程序比对两个氨基酸序列；ii )计数比对中精确匹配的数目； iii)将精确匹配的数除以两个氨基酸序列中最短的长度，以及iv)将iii)中除得的结果换 算成百分比。用相似方法计算与本发明的其他序列的同一性的百分比。
[0059] 例如，多肽序列可以与参考序列一致，即100%相同，或者相比于参考序列它可包 括多达一定整数的氨基酸改变，使得同一性百分比小于100%。这样的改变选自：至少一个 氨基酸缺失、取代（包括保守和非保守取代）或者插入，并且其中，所述改变可以在参考多 肽序列的氨基或羧基末端位置或那些末端位置之间的任何地方发生或者在参考序列中或 者在参照序列中的一个或多个连续的基团中的氨基酸中单独穿插。
[0060] 保守氨基酸变体还可以包括非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括 但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2, 4-甲醇基脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟脯氨 酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟基-乙基半胱氨酸、羟基-乙基高半胱氨酸、 硝基-谷氨酰胺、高谷氨酰胺（homoglutamine)、2_哌啶酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-甲 基脯氨酸和4-甲基脯氨酸、3, 3-二甲基脯氨酸、叔亮氨酸（tert-leucine)、正缬氨酸、2-氮 杂苯基丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。在本领域已知一些方 法用于将非天然存在的氨基酸残基结合至蛋白中。例如，可以采用体外系统，其中，使用化 学氨基酰化抑制剂tRNA抑制无义突变。用于合成氨基酸和氨基酰化tRNA的方法是在本领 域是已知的。含有无义突变的质粒的转录和翻译是在包括大肠杆菌S30提取物和商购的酶 以及其他试剂的无细胞系统中进行。通过色谱法纯化蛋白。在第二种方法中，在非洲爪蟾 卵中通过显微注射突变的mRNA和化学氨基酰化抑制剂tRNA进行翻译。第三种方法中，在 不存在天然氨基酸（待替换的）（例如，苯丙氨酸），并在所希望的非天然产生的氨基酸（例 如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸、或4-氟苯丙氨酸）存在的情况下 培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸结合至蛋白以代替其天然副本。可以通过体外 化学修饰将天然存在的氨基酸残基转化成非天然存在的种类。化学修饰可以与定点诱变进 行组合以进一步扩展取代的范围。提供足以支持AlM抗氧化性的3维结构的可替换的化学 结构可以通过其它技术例如人工支架，氨基酸取代等提供。此外，如上面列出的模仿AlM的 活性部位的结构以及在图3和图6中所描绘的结构设想为具有与AlM相同的功能。
[0061] 用于特定线粒体相关疾病中的AlM
[0062] 更具体地，本发明涉及用于治疗选自以下的线粒体相关疾病的AlM :
[0063] ?阿尔佩斯病（进行性婴儿脑灰质营养不良）
[0064] ?巴特综合症（致死性婴幼儿心肌病）
[0065] · β_氧化缺陷
[0066] ?心肌病
[0067] ?肉碱-酰基肉碱缺乏
[0068] ?肉碱缺乏
[0069] ?肌酸缺乏综合症（脑肌酸缺乏综合症（CXDS)，包括：乙酸胍甲基转移酶缺乏 (GAMT缺乏）、L-精氨酸：甘氨酸脒基转移酶缺乏（AGAT缺乏），和SLC6A8相关肌酸转运蛋 白缺乏（SLC6A8缺乏）。
[0070] ?辅酶QlO缺乏
[0071] ?复合物I缺乏（NADH脱氢酶（NADH-辅酶Q还原酶）缺乏）
[0072] ?复合物II缺乏（琥珀酸脱氢酶缺乏）
[0073] ?复合物III缺乏（泛醌细胞色素 C氧化还原酶缺乏）
[0074] ?复合物IV缺乏/COX缺乏（由呼吸链复合物IV的缺陷造成的细胞色素 C氧化酶 缺乏）
[0075] ?复合物V缺乏（ATP合成酶缺乏）
[0076] · COX 缺乏
[0077]