用于治疗线粒体相关的疾病的α1-微球蛋白的制作方法_5

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放大图)。
[0189] 图7.人原代角质化细胞用(A)仅培养基,⑶250 μ M H2O2或(C) 250 μ M H202+0. 25mg/ml AIM在室温下培养20小时。用箭号突出线粒体结构并且显示细节(放大 图片)。如在材料和方法中所描述的制备并观察样品。比例尺指明为2 μ m(概观)以及 0. 5μπι(放大图)。
[0190] 图8. AlM保护线粒体功能。通过测量暴露于血红素或H2O2的纯化的线粒体的ATP 生产研究AlM对线粒体功能的影响。(A)在有或没有0. 25mg/ml AlM的情况下用1-20 μ M 血红素或⑶在有或没有0. 25mg/mlAlM的情况下用20-250 μ M H2O2孵育线粒体30分钟。 通过离心收集线粒体以及用发光检测试剂盒测定ATP生产。ATP水平标准化为相应的样本 蛋白。每个点代表三次测定的平均值土SEM。使用Student's t检验进行组之间的统计学 比较。*P < 0· 05。
[0191] 图9. AIM的序列表
[0192] 图10.温和和应激的条件下视网膜培养期间,线粒体rRNA(A)和细胞AIM,HOl和 SOD的mRNA⑶的实时PCR定量。每个Λ Λ t-值对应于相对于温和的条件下的RNA量的应 激条件下的RNA的量,通过实时PCR测定,并且标准化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶。每个标尺 是三次重复培养的重复测量的平均值。
【具体实施方式】
[0193] 实验
[0194] 实施例1
[0195] 材料与方法
[0196] 蛋白和抗体
[0197] 如先前所述,通过抗AlM亲和层析和Sephacryl S-300凝胶层析分离人单体 血浆AIM (坚)。从感染杆状病毒的昆虫细胞培养基中纯化含有N-末端H i s标签的重组 人AlM(M),或在大肠杆菌中表达,以及如描述的,用加入的离子交换层析纯化步骤(超) 纯化并且折叠(迦)。人血清Ct 1-酸糖蛋白(AGP)和卵白蛋白购自Sigma-Aldrich公 司(St. Louis, MO, USA)以及牛血清白蛋白(BSA)购自 Roche Diagnostics Scandinavia AB (Bromma, Sweden)。血红素(氯化高铁血红素 IX)购自 Porphyrin Products, Inc. (Logan, UT),以及IOmM的储备溶液通过溶解于二甲亚砜中现制备(DMS0 ;Sigma-Aldrich公 司)。H2O2来自Acros Organics (Geel, Belgium)。如上面描述培养抗人AlM的单克隆抗体 (BN11. 3)(避)。通过用在感染杆状病毒的昆虫细胞中表达的His标记的小鼠 AlM免疫兔 制备兔多克隆抗小鼠 AlM 抗体(Sven ;IgG_fraction) (41)。由 Dr. Rikard Holmdahl, Lund University友好提供仓鼠抗小鼠 CD3抗体145. 2C11。异硫氰酸酯突光素结合的羊抗鼠免疫 球蛋白(GAM-FITC)和藻红蛋白结合的链霉素(SAPE)购自DAKO A/S(Glostrup,Denmark), 7-氨基放线菌素 D (7AAD)来自Sigma-Aldrich公司以及膜联蛋白V-FITC来自Trevigen Inc. (Gaithersburg, MD, USA)〇
[0198] 细胞培养
[0199] 使用小鼠 CD4+T细胞杂交瘤细胞系(HCQ. 4)、小鼠前B细胞系(70Z/3)、人红细胞 系(K562)和人原代角质化细胞(Cambrex Biologies, Karlskoga, Sweden)用于研究AlM结 合至细胞和线粒体。如之前描述的培养细胞(迫,趣,五),并如下所述处理和分析。
[0200] 诱导细胞凋亡
[0201] 在T细胞杂交瘤中通过三种不同处理诱导凋亡:在抗⑶3抗体涂覆的塑料板 (4 μ g/ml)上孵育细胞(M),或在补充有5%乙醇或10% DMSO的培养基中孵育(M)。细胞 在37°C在CO2培养箱中孵育不同的时间。通过琼脂糖-凝胶电泳(以下描述)将凋亡检测 为DNA碎片以及通过台盼蓝排除法测量细胞活性。在前B细胞系70Z/3中,如上所述(迎), 通过苯甲酰胺-药物地氯普胺(3-CPA, Oxigene Inc.)诱导细胞凋亡。
[0202] 琼脂糖凝胶电泳
[0203] 为了检测DNA破碎,裂解约IX IO6个细胞,用蛋白酶K和RNA酶A处理,并通过琼 脂电泳进行分析。
[0204] 标记 AlM
[0205] 为了分析AlM结合至细胞,生物素化AIM、FITC结合或1251放射性标记。用长 臂生物素 N 羟基玻拍醜亚胺(Vector Laboratories Inc. ,Burlingame, CA, USA)生物素 化A1M(9)并且稀释到浓度为0. 2mg/ml。如之前描述的,通过吸附在娃藻土(Calbiochem Corp,San Diego, CA, USA)上的FITC,AlM是FITC结合的(垃)。使用氯胺T法用125I标记 AlMO^)。获得的比放射性活度是约0. 1-0. 2MBq/ μ g。
[0206] 流式细胞术
[0207] 通过流式细胞术分析AIM结合至细胞。对于以三种不同的方式之一的AIM-结 合,分析大约IX IO6个细胞=1.将细胞用lmg/ml的血浆或重组昆虫细胞AlM孵育,随后是 10 μ g/ml的单克隆小鼠抗AIM (BN 11.3)和GAM-FITC (稀释20倍)。2.将细胞用10 μ g/ml 的生物素化AIM孵育,随后是SAPE (根据制造商的建议稀释)。3.将细胞用0.1mg/ml FITC 结合的AIM孵育。所有孵育在室温PBS+lmg/ml的BSA中孵育10分钟。孵育期间,用PBS洗 涤细胞2-3次。为检测泄漏的细胞,将细胞用碘化丙啶(PI ;Invitr〇gen Inc.)或7AAD (根 据制造商的说明书)孵育。为了检测凋亡的70Z/3细胞,还在含钙离子的缓冲液(根据制造 商的说明书)将细胞用FITC结合的膜联蛋白V孵育。所有分析均使用Becton Dickinson FACSorter 和 Cell Quest 软件包进行。
[0208] 荧光和共聚焦显微镜检查
[0209] 洗涤K562细胞并且在培养基中再悬浮至0. 5-4. OX IO6个细胞/ml,并且如附图 说明书所指出的用AlM或不用AlM孵育。然后将细胞用Mito-Tracker (Invitrogen Inc.) 在37°C下孵育15分钟,并在新鲜培养基中洗涤(图3A)或直接在新鲜培养基中(图1C)。 洗涤后,通过在冰冷的钠培养基(5. 4mM KCl ;1. 2mM KH2P04;0. 8mM MgSO4干燥;5. 6mM D-葡 萄糖;127mMNaCl;10mM H印es;L8mM CaCl2;pH 7.3)中再悬浮进行细胞染色;用1%的 BD CellFIX在冰上15分钟以及室温45分钟定色。在阻断溶液中洗涤细胞(钠-培养 基;I % BSA ;5 %山羊血清),随后在0.02 %的Triton-X中透化并且在I % BSA、5 %山羊 血清、0.2 %吐温-20中室温阻断1小时。然后将细胞在4°C用5 μ g/ml的单克隆小鼠抗 A1M(BN11.3)过夜染色。接着,在室温下应用羊抗鼠 IgG F(ab')2片段(Alexa F丨u〇r?594 ; Invitrogen Inc.) 1小时。使用利用DAPI的ProLong Gold抗淬灭试剂制作细胞标本。对 于荧光显微镜检查,使用装有Hamamatsu C4742-95冷却的C⑶照相机的Nikon Eclipse TE300的倒置荧光显微镜,使用Plan Apochromat IOOx物镜进行目视检查和图像记录。对 于共聚焦显微镜,使用落射荧光显微镜(Nikon Eclipse TE300)和共聚焦激光扫描显微镜 (Zeiss LSM 510元)进行细胞和荧光标记物的分析。落射荧光显微镜配备适当的过滤器 组合以选择性地可视化使用的突光团。使用Plan Apochromat IOOx透镜进行分析,并且用 Hamamatsu C4742-95C⑶照像机收集该图像数据。为分析细胞内标记和亚细胞结构中的共 标记,记录通过细胞的共焦扫描的光学切片。对于荧光团的激发,使用405nm的激光波长用 于DAPI (二极管激光器405-30),对于Alexa Fluor488 (氩激光)使用488nm激光波长以 及对于Mito-Tracker (DPSS 561-10)使用561nm的激光波长。使用以下过滤器检测各个荧 光团发射波长:对于DAPI带通420_480nm,对于Alexa Fluor488带通505_550nm以及用于 Mitotracker长通575nm。设置用于Alexa Fluor 488(488nm激发)检测的针孔以对应于 1( 一)个Airy单元(Airy unit)并且随后调整用于其他检测通道的针孔以得到相同的厚 度的光层(光学切面,optical section),即,确保对应的共聚焦体积的比较。优化用于单 个通道的激光功率以及检测设置(增益和偏移),产生从较大结构的高度饱和像素到小结 构的非饱和像素的检测范围。顺序地扫描不同的荧光团,即,在512X512或1024X 1024帧 长(框大小,frame size),在每个通道中使用用于一个荧光团的最佳设置。为了确定细胞 的形态,使用405nm的激光作为透射光获得微分干涉差(DIC)图像。Alexa Fluor 488荧 光(绿)和Mito-Tracker荧光(红)之间的空间关系是通过来自单个扫描通道的光层的 融合测定的(当共定位时是黄色),使用LSM Zen软件经由融合的图像分析确认("剖面", 未显示数据)。
[0210] 酵母双杂交系统
[0211] 使用基于GAL4的酵母双杂交系统寻找AlM相互作用的细胞蛋白。通过使用 pCR-Script 构造(pCR-Script construct)作为模板的 PCR 扩增编码 AlM-bikunin 基因 (AMBP)的AlM部分(氨基酸1-183)的DNA。该片段进行完全测序,并且构建至酵母2-杂 交载体的PBD-GAL4Cam噬菌粒载体中(Stratagene,La Jolla, CA, USA)。然后将重组载体转 染进入酿酒酵母的酵母宿主菌株YRG-2 (Stratagene)。使用如Stratagene和http://www. umanitoba. ca/faculties/medicine/units/biochem/gietz/推荐的标准方案讲行酵母菌 株的生长和维护以及2-杂交测定。用15-20 μ g人白细胞MATCHMAKER cDNA文库(Clontech Laboratories, Inc.,Palo Alto, CA, USA)转染携带诱傅质粒 PBD-GAL4-A1M 的约 7. 5 X IO8 个YRG-2。将所得的约2X IO6转化体通过组氨酸质子移变检测(prototrophy assay)和 β-半乳糖甘酶(β-gal)集落挖掘法进行分析。分离来自His+LacZ+转化体的重组文库 质粒并与AlM诱饵质粒以及编码不相关蛋白的诱饵质粒一起在直接2-杂交测试中再次测 试。认为导致报告基因活化的质粒与AlM编码的诱饵质粒一起是真阳性,而不是与编码不 相关蛋白的诱馆质粒一起。使用该载体的引物:pAD5' :5'_tccagattacgctagcttgggtggtca tatg-3' 和 pAD3' :5'-gtgaacttgcggggtttttcagtatctacga_3' 测定插入物的 DNA 序列。插 入物中的一个由Innovagen AB(Lund, Sweden)完全测序。
[0212] 制备来自小鼠肝组织的线粒体
[0213] 在冰冷分离缓冲液中(320mM蔗糖,IOmM的羟基丁三醇碱,2mM的EGTA)收集小鼠 肝组织,并随后在2ml匀浆缓冲液(补加有1% BSA分离缓冲液)中匀化。通过包括19% Percoll的密度纯化的顺序离心从匀楽中制备线粒体。使用NanoDrop确定线粒体制备体的 蛋白浓度并且不需要冰冻就可使用分离的线粒体。
[0214] 竞争性细胞结合试验和线粒体结合试验。
[0215] 如上面描述的,AlM结合至细胞和线粒体的特异性通过竞争性细胞结合试验研究 Q,迎)。通过抗⑶3交联15-18小时在HCQ. 4细胞中诱导凋亡。收获细胞,并且在结合试 验中将其与正常细胞对比。使用数据的斯卡查德图计算用于结合的亲和常数。
[0216] 复合物I的免疫捕获
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