一种禽流感病毒h7n9神经氨酸酶抑制剂的用图
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物化学中的抗病毒药物技术领域，具体涉及一种黄芩苷具有抑制禽 流感病毒H7N9神经氨酸酶的用途。
【背景技术】：
[0002] H7N9亚型禽流感病毒是甲型流感病毒中的一种，可以引起的一种禽类烈性传染 病，属于正黏病毒科，RNA病毒。研宄揭示H7N9病毒可能来自于欧亚大陆迀徙至东南亚地 区的野鸟所携带的禽流感病毒与中国上海、浙江、江苏等地的鸭群和鸡群所携带的禽流感 病毒发生的基因重组。流感病毒的神经氨酸酶（NA)，是一种有酶活性的表面糖蛋白，在所有 A，B型流感病毒中均高度保守。
[0003] 常用的流感病毒神经氨酸酶抑制剂（扎那米韦、奥司他韦等）能够同时抑制A型 和B型流感病毒，在流感的预防和治疗中发挥了重要作用。但扎那米韦和奥司他韦在临床 上的使用有一定的局限性，如扎那米韦的口服利用度低，体内分布容积小，肾脏清除快，只 能作为局部用药。奥司他韦（商品名达菲）作为抗流感特效药，经受了禽流感和甲型HlNl 流感的双重考验，但由于价格较高，难以在发展中国家推广，同时临床上大量耐药病毒株的 出现也已被报道。
[0004] 黄芩苷是黄芩中提取的多酚羟基黄酮类中药单体，是黄芩的主要活性成分之一。 现代科学研宄结果证明黄芩苷有抑菌、抗炎、抗氧化作用，还具有抗病毒、抗肿瘤等作用。黄 芩苷的抗病毒谱较广，资源丰富，在黄芩中含量超过9%，易于提取分离，是一种具开发潜力 的抗病毒药物资源。
【发明内容】
[0005] 本发明中的黄芩苷具有抑制禽流感病毒H7N9神经氨酸酶的活性。研宄表明，黄芩 苷具有明显的抑制野生型及耐奥司他韦的禽流感病毒H7N9神经氨酸酶的活性，具有抗禽 流感病毒药物的用途。所述的病毒神经氨酸酶为在CHO-Kl细胞中重组表达的野生型及奥 司他韦耐药的禽流感病毒A/Anhui/1/2013 (H7N9)神经氨酸酶。
[0006] 黄芩苷具有制备抗禽流感病毒H7N9药物的用途。
【附图说明】
[0007] 图1是质粒pCDNA3. I (+) -N9的双酶切验证
[0008] 图2是质粒pCDNA3. I (+) -N9表达的RT-PCR验证
[0009] 图3是N9的活性验证
[0010] 图4是质粒pCDNA3. I (+) -N9-R294K的双酶切验证
[0011] 图 5 是质粒 pCDNA3. I (+) -N9-R294K 表达的 RT-PCR 验证
[0012] 图6是N9-R294K的活性验证
[0013] 图7是黄芩苷对N9活性的抑制作用
[0014] 图8是黄芩苷对N9-R294K活性的抑制作用
【具体实施方式】
[0015] 实施例1
[0016] 流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神经氨酸酶的表达
[0017] 从数据库 GISAID (Global Initiative on Sharing Avian Influenza Data)中 获得流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神经氨酸酶的基因序列（序列号：EPI439509)，对其 进行密码子优化，使其适合在CHO-Kl细胞内高水平表达。该基因序列由人工合成，命名为 N9,通过Hind III和Xho I酶切，酶切产物连接到用相同酶切的pcDNA 3.1(+)质粒中，连 接产物转化到T0P10感受态细胞后，涂布Amp ici 11 in抗性平板培养14~18h，挑取单个菌 落，该菌落经过摇瓶培养扩增后后提取质粒酶切鉴定后，并对克隆的神经氨酸酶基因进行 测序。重组质粒经双酶切鉴定后在CHO-Kl细胞中表达，并建立稳定细胞株。
[0018] 稳定细胞株的建立：使用Iipofectamine 2000将重组质粒pCDNA3. I (+)-N9及空 载体pcDNA3. 1 (+)分别转染到CHO-Kl细胞中，48h后将细胞按1 : 12传代并加入200 μ g/ ml G418进行克隆筛选。每3天换液，维持相同浓度的G418,直至单个稳定细胞克隆形成， 然后挑取单克隆。阳性克隆扩大培养冻存，并抽提重组细胞总RNA进行反转录，以反转率产 物为模板，设计基因 N9的上下游引物进行PCR，将得到的PCR产物进行凝胶电泳鉴定。
[0019] 神经氨酸酶的表达：24孔板中每孔接种稳定细胞株IX IO5个细胞，培养48h后用 抽提细胞总RNA，进行RT-PCR检测N9基因 mRNA的表达。
[0020] 神经氨酸酶活性的鉴定：24孔板中每孔接种IX IO5个稳定细胞，培养48h后 收取细胞，每孔用100 μ 1通用蛋白裂解抽提试剂裂解细胞。同时制备流感病毒A/ FM/l/47(HlNl)，A/Beijing/32/92(H3N2)鸡胚培养的尿囊培养液。实验使用96孔黑板，每 孔先加35 μ I MES缓冲液，加入30 μ 1重组表达的流感病毒A/Anhui/1/2013 (H7N9)神经氨 酸酶液，再加入10 μ 1的不同浓度的黄芩苷，置于37°C孵育5min，避光操作每孔加入25 μ 1 的神经氨酸酶特异性荧光底物MUNANA，置于37°C孵育20min，最后每孔加入100 μ 1加入终 止液150 μ I (14mm〇l/l的NaOH溶液，含83%的乙醇），用荧光酶标仪于激发波长360nm发 射波长440nm处测定荧光。计算黄芩苷对于神经氨酸酶活性的抑制率。实验同时设置不加 药的空白对照组。神经氨酸酶酶活抑制率=(空白对照组的荧光值-加药组的荧光值）/ 空白组的荧光值X 100%，IC5tl定义为神经氨酸酶酶活下降50%时黄芩苷的浓度。以流感 病毒A/FM/1/47 (HlNl)及A/Bei jing/32/92 (H3N2)鸡胚培养的尿囊培养液为阳性对照。
[0021] 结果见附图1，2,3,图1表明，提取重组质粒p⑶NA3. 1(+)-Ν9,用1%的琼脂糖 凝胶电泳检测，得到了大小为4. Ikb的质粒。用限制性内切酶Hind III和Xho I对质粒 PCDNA3. 1(+)-Ν9进行双酶切，得到了 1395bp的基因片段，将其进行测序，测序结果与基因 N9序列完全相符，说明重组质粒pCDNA3. 1(+)-Ν9构建成功。图2表明，将重组细胞进行 RT-PCR检测，得到大小为1395bp的基因片段，将其进行测序，测序结果与基因 N9序列完全 相符，说明目的基因 N9的mRNA在CHO-Kl细胞中进行了转录。图3表明，通过MUNANA荧光 底物法测得N9及阳性对照H1N1，H3N1的荧光强度均值分别为33864,41220, 59778,表明N9 具有神经氨酸酶活性。
[0022] 实施例2
[0023] 突变流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神经氨酸酶的表达
[0024] 在流感病毒A/Anhui/1/2013 (H7N9)神经氨酸酶基因序列中的294位精氨酸突变 为赖氨酸，将该基因命名为N9-R294K。构建重组表达质粒pCDNA3. l(+)-N9-R294K，并构建 稳定细胞株，制备重组神经氨酸酶N9-R294K。方法同上。
[0025] 结果见附图4,5,6,图4表明，提取重组质粒pCDNA3. l(+)-N9-R294K，用1%的琼脂 糖凝胶电泳检测，得到了大小为4. Ikb的质粒。用限制性内切酶Hind III和Xho I对质粒 PCDNA3. l(+)-N9-R294K进行双酶切，得到了 1395bp的基因片段，将其进行测序，测序结果 与基因 N9-R294K序列完全相符，说明重组质粒pCDNA3. l(+)-N9-R294K构建成功。图5表 明，将重组细胞进行RT-PCR检测，得到大小为1395bp的基因片段，将其进行测序，测序结果 与基因 N9-R294K序列完全相符，说明目的基因 N9-R294K的mRNA在CHO-Kl细胞中进行了 转录。图6表明，通过MUNANA荧光底物法测得N9-R294K及阳性对照HlNl，H3N2的荧光强 度均值分别为15196,41220, 59778,表明N9-R294K具有神经氨酸酶活性，其神经氨酸酶活 性比N9有所降低。
[0026] 实施例3
[0027] 黄芩苷对N9神经氨酸酶活性的抑制作用
[0028] 实验使用96孔黑板，黄芩苷用PBS溶解并倍比稀释至500、250、125、62.5μΜ。每 孔先加35 μ I MES缓冲液，加入30 μ 1重组表达的流感病毒A/Anhui/1/2013 (Η7Ν9)神经氨 酸酶液，再加入10 μ 1的不同浓度的黄芩苷，置于37°C孵育5min，避光操作每孔加入25 μ 1 的神经氨酸酶特异性荧光底物MUNANA，置于37°C孵育20min，最后每孔加入100 μ 1的终止 液150 μ I (14mm〇l/l的NaOH溶液，含83 %的乙醇），用荧光酶标仪于激发波长360nm发射 波长440nm处测定荧光。计算黄芩苷对于神经氨酸酶活性的抑制率。实验同时设置不加药 的空白对照组。神经氨酸酶酶活抑制率=(空白对照组的荧光值-加药组的荧光值）/空 白组的荧光值X100%，IC 5tl定义为神经氨酸酶酶活下降50%时黄芩苷的浓度。以奥司他 韦羧酸盐和扎那米韦作为阳性对照药。
[0029] 实验结果见附图7,图7表明，黄芩苷对N9的神经氨酸酶活性均有明显的剂量依 赖的抑制作用，随着黄芩苷浓度升高，神经氨酸酶活性下降越明显。黄芩苷对N9的IC 5tl是 211. 8 μ M，证明了黄芩苷是一种流感病毒A/Anhui/1/2013 (H7N9)神经氨酸酶的有效抑制 剂。黄芩苷对N9及流感病毒HlNl及H3N2的神经氨酸酶的IC5tl值如表1所示。
[0030] 表1药物对各流感病毒神经氨酸酶活性抑制作用的IC5tl值
[0031]
【主权项】
1. 黄芩苷作为一种禽流感病毒H7N9神经氨酸酶抑制剂的用途。
2. 黄芩苷作为一种对奥司他韦耐药的禽流感病毒H7N9神经氨酸酶抑制剂的用途。
3. 黄芩苷用于治疗和/或预防禽流感病毒H7N9感染的药物的用途。
4. 黄芩苷用于临床治疗人和/或动物禽流感病毒感染的药物的用途。
【专利摘要】本发明属于天然活性物质中的抗病毒药物技术领域，具体涉及一种黄芩苷具有抑制禽流感病毒H7N9神经氨酸酶活性的用途。本发明中的黄芩苷具有抑制禽流感病毒H7N9神经氨酸酶的活性。研究表明，黄芩苷具有明显的抑制野生型及耐奥司他韦的禽流感病毒H7N9神经氨酸酶的活性，具有抗禽流感病毒药物的用途。所述的病毒神经氨酸酶为在CHO-K1细胞中重组表达的野生型及奥司他韦耐药的禽流感病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)神经氨酸酶。研究结果表明，黄芩苷具有制备抗禽流感病毒H7N9药物的用途。
【IPC分类】A61P31-16, A61K31-7048
【公开号】CN104666324
【申请号】CN201510096401
【发明人】周长林, 窦洁, 王婷婷, 郁洁, 王慧, 靳京
【申请人】中国药科大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月4日