一种海马胰蛋白酶酶解液及其作为抗氧化剂的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种蛋白酶酶解液，以及该种酶解液作为抗氧化剂的应用。
【背景技术】
[0002] 海马在全世界共有20多种，多数生活在近海，水藻和海草茂盛、风浪不使很大大 的海域。我国海马资源丰富，东南沿海均产海马，以南海较多。另外，海马作为一种著名中 药，在很多地方药房均有销售，为海马的研宄提供了可能。
[0003] 海马有很多对人类有益的功能，如温肾壮阳、缓解前列腺增生、耐缺氧、抗氧化、抗 疲劳、延缓衰老、抗肿瘤等，所以是珍贵的海洋生物资源，具有很重要的研宄和开发价值。根 据已有报道，目前科研人员对海马组分的研宄主要集中在氨基酸、微量元素、留体类和磷脂 等化学成分，但对海马蛋白质及酶解液的研宄报道非常少。
[0004] 现代医学研宄表明，过量的自由基会在有机体中引起一系列生物学反应，导致组 织细胞、亚细胞核分子结构的破坏，并随着破坏层次逐渐扩展造成功能损伤，引起心血管疾 病、癌症和衰老等，它是构成很多疾病的病理学基础。因此抗氧化剂的研宄对有效预防和治 疗某些疾病十分重要。而人工合成的抗氧化剂往往具有一定的毒副作用，使得它们早使用 时受到严格的控制。而天然抗氧化剂副作用小，安全性高，有利于产品的进一步应用。
【发明内容】
[0005] 本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种成本低廉、获得容易的 海马胰蛋白酶酶解液，以及该种海马胰蛋白酶酶解液作为抗氧化剂的应用。
[0006] 本发明的技术解决方案是：一种海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马 胰蛋白酶酶解液按照以下步骤制备获得： 将质量比为100:5的海马粉末和胰蛋白酶置于烧杯中，并向烧杯中加入pH=8.0的PBS 缓冲溶液获得混合溶液，且海马粉末与PBS缓冲溶液的质量体积比为1:200,将混合溶液在 50-60°C的条件下恒温水浴酶解6-8h，然后将混合溶液在100°C的条件下水浴至少lOmin， 之后对混合溶液进行离心处理并取上清液，将上清液经0. 45 的滤膜过滤，滤后的液体 即为海马胰蛋白酶酶解液。
[0007] 所述的海马粉末为雄海马粉末。
[0008] 一种如上所述的海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马胰蛋白酶酶解液 作为抗氧化剂的应用。
[0009] 所述的海马胰蛋白酶酶解液对DPPH自由基进行清除的应用。
[0010] 所述的海马胰蛋白酶酶解液对羟基自由基进行清除的应用。
[0011] 所述的海马胰蛋白酶酶解液对超氧阴离子自由基进行清除的应用。
[0012] 本发明同现有技术相比，具有如下优点： 本发明公开一种海马胰蛋白酶酶解液，同时经过试验表明，该种海马胰蛋白酶酶解液 具有较好的抗氧化活性，对DPPH自由基（DPPH ·)、羟基自由基（· OH)和超氧阴离子自由基 (0厂·）都有较好的清除效果，因此这种海马胰蛋白酶酶解液可以作为抗氧化活性的药物和 保健品的原料进行生产，同时该种海马胰蛋白酶酶解液获得容易，成本低廉，因此可以说它 具有多种优点，特别适合于在本领域中推广应用，其市场前景十分广阔。
【具体实施方式】
[0013] 下面将结合说明本发明的【具体实施方式】。一种海马胰蛋白酶酶解液，按照以下步 骤制备获得： 将质量比为100:5的海马粉末和胰蛋白酶置于烧杯中，并向烧杯中加入pH=8. 0的 PBS缓冲溶液，获得混合溶液，且海马粉末与PBS缓冲溶液的质量体积比为1:200,将混合 溶液在50-60°C的条件下恒温水浴酶解6-8h，然后将混合溶液在100°C的条件下水浴至少 lOmin，灭酶活，之后对混合溶液进行离心处理并取上清液，将上清液经0. 45 的滤膜过 滤，经过滤膜过滤后的液体即为海马胰蛋白酶酶解液；这里的海马粉末优选雄性海马制成 的粉末。
[0014] 通过上述方法所获得的海马胰蛋白酶酶解液，可以作为抗氧化剂应用。
[0015] 对经过上述方法获得的海马蛋白酶酶解液进行抗氧化活性研宄实验，具体步骤如 下： a.清除DPPH自由基（DPPH ·):吸光度值测定，准确移取2. OmL海马酶解液，然后 加入2. OmL配制好的DPPH溶液，混合均匀于25°C水浴中反应30min，反应结束后移入比色 皿中测其吸光度值Ai;吸光度值A」的测定，准确移取2. OmL酶解液，加入2. OmL乙醇，在25°C 水浴中反应30min后，测定其吸光度值Aj;吸光度值A ^的测定，准确移取2. OmL的DPPH，加 入2. OmL的乙醇，于25°C水浴中反应30min后测定的吸光度值为Atl。
[0016] b.清除羟基自由基（· OH):吸光度Ai的测定，准确移取海马酶解液2. OmL，先后加 入2. OmL的？6304溶液（3_317^)、2· OmL的水杨酸一乙醇溶液（6mmoL/L)，最后加入2. OmL 质量分数为3. 75%的双氧水启动反应，在37°C水浴中反应30min，以蒸馏水为参比，在510nm 下测定吸光度值Ai;吸光度值A」的测定，准确移取蒸馏水2. OmL，先后加入2. OmL的FeSO4溶 液（3mmoL/L)，2. OmL的水杨酸一乙醇溶液（6mmoL/L)和2. OmL的酶解液，同样条件下测定本 底吸收值Aj;吸光度值A ^的测定，移取蒸馏水2. OmL，先后加入2. OmL的FeSO 4溶液（3mm〇L/ L)、2. OmL的水杨酸一乙醇溶液（6mm〇L/L)，最后加入2. OmL质量分数为3. 75%的双氧水启 动反应，在37°C下反应30min，然后测定其吸光度值Ap
[0017] c.清除超氧阴离子自由基（0厂·）：测吸光度值Ai的测定，准确移取海马酶解液 1.0 mL，然后加入4. 5mL pH为8. 2的tris-HCl缓冲溶液（0. 05mol/L)，在25°C水浴中保温 20min后，加入0. 5mL邻苯三酚（25mmol/L)，混匀后，在25°C水浴中反应5min，用1.0 mL的 HCl溶液（8mmol/L)终止反应，在320nm下以蒸馏水作为空白对照测吸光度值Atl和Ai;吸 光度值A j的测定，准确移取海马酶解液1.0 mL，然后加入4. 5mL pH为8. 2的tris-HCl缓冲 溶液（0. 05mo 1/L)，在25°C水浴中保温20min后，加入0. 5mL的水，混匀后，在25°C水浴中反 应5min，用1.0 mL的HCl溶液（8mmol/L)终止反应，在320nm下测吸光度值A」。
[0018] 实验结果表明：海马胰蛋白酶酶解液对DPPH自由基（DPPH ·)的清除率为：雄海马 53. 5%，雌海马45. 8%。对羟基自由基（· 0H)的清除率为：雄海马88. 35%，雌海马82. 49%。 对超氧阴离子自由基（〇厂·）的清除率为：雄海马34. 7%，雌海马51. 5%。所以在进行海马 胰蛋白酶酶解液的制备时，优选雄海马粉末作为原料。
[0019] 通过比较与中性蛋白酶酶解液的数据进行比较可以看出，海马的胰蛋白酶酶解液 对DPPH ·的清除率要好于中性蛋白酶酶解液，雄海马酶解液对DPPH ·的清除率要好于雌海 马。如表1所示。
[0020] 通过比较与中性蛋白酶酶解液的数据进行比较可以看出，海马胰蛋白酶酶解液 对·ΟΗ有显著的清除效果。其中，雄海马酶解液对·ΟΗ的清除率要好于雌海马。如表2所 不O
[0021] 通过比较与中性蛋白酶酶解液的数据进行比较可以看出，海马的胰蛋白酶酶解液 对O厂·的清除率要好于中性蛋白酶酶解液，雄海马酶解液对O厂?的清除率要好于雌海马。 如表3所示。
【主权项】
1. 一种海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马胰蛋白酶酶解液按照以下步骤 制备获得： 将质量比为100:5的海马粉末和胰蛋白酶置于烧杯中，并向烧杯中加入pH=8.O的PBS缓冲溶液获得混合溶液，且海马粉末与PBS缓冲溶液的质量体积比为1:200,将混合溶液在 50-60°C的条件下恒温水浴酶解6-8h，然后将混合溶液在100°C的条件下水浴至少lOmin， 之后对混合溶液进行离心处理并取上清液，将上清液经0. 45 的滤膜过滤，滤后的液体 即为海马胰蛋白酶酶解液。
2. 根据权利要求1所述的海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马粉末为雄海 马粉末。
3. -种如权利要求1所述的海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马胰蛋白酶 酶解液作为抗氧化剂的应用。
4. 根据权利要求3所述的海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马胰蛋白酶酶 解液对DPPH自由基进行清除的应用。
5. 根据权利要求3所述的海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马胰蛋白酶酶 解液对羟基自由基进行清除的应用。
6. 根据权利要求3所述的海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马胰蛋白酶酶 解液对超氧阴离子自由基进行清除的应用。
【专利摘要】本发明公开一种海马胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海马胰蛋白酶酶解液按照以下步骤制备获得：将质量比为100:5的海马粉末和胰蛋白酶置于烧杯中，并向烧杯中加入pH=8.0的PBS缓冲溶液获得混合溶液，且海马粉末与PBS缓冲溶液的质量体积比为1:200，将混合溶液在50-60℃的条件下恒温水浴酶解6-8h，然后将混合溶液在100℃的条件下水浴至少10min，之后对混合溶液进行离心处理并取上清液，将上清液经0.45μm的滤膜过滤，滤后的液体即为海马胰蛋白酶酶解液。这是一种成本低廉、获得容易的海马胰蛋白酶酶解液，以及该种海马胰蛋白酶酶解液作为抗氧化剂的应用。
【IPC分类】C12P21-06, A23L1-305, A61P39-06, A61K38-01
【公开号】CN104689294
【申请号】CN201510067879
【发明人】李敏晶, 王旭莹, 孔亮, 李伟, 靳艳
【申请人】大连海洋大学, 中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月10日