抗分泌蛋白对于治疗间室综合症的应用
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2007年4月27日、申请号为"200780014998. 9"、发明名称为 "抗分泌蛋白对于治疗间室综合症的应用"的发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及间室综合症领域，并涉及与之相关的多种病症。更具体地说，本发明涉 及体内流体、盐和物质任选地为了正常化的目的在细胞与其他细胞外空间以及间室内血管 系统之间的传递，所述间室由组织、器官和/或限定结构组成。封闭的间室包括尺寸不同的 各种结构，范围从细胞、组织、解剖学定义的单位到体内器官。受到病理影响的结构可能因 为超负荷、损伤、毒剂、药物、出血、肿瘤、细菌和/或病毒之类的微生物感染而发生机能障 碍，导致间隙液的压力升高和/或导致其他疾病。本发明还涉及特定抗分泌蛋白在正常和 病理情况下对于间室综合症领域的应用。
【背景技术】
[0003] 在医疗实践中使用术语"间室综合症"表征这样一种病理状况，其特征是，封闭体 积（间室）内的压力发生不正常的升高，导致流过特定体积的血液和淋巴液减少或甚至阻 断。血管压力太高会使血液透过静脉、毛细管、甚至微动脉和动脉，改变细胞外环境中间隙 液的工作条件，导致所述空间内对细胞和组织的营养素和氧气的充分供应枯竭。一个同样 重要的因素是无法排出废物和代谢产物，这些废物和代谢产物通常为酸性，发生积聚时会 进一步加重对所述间室内细胞机能和代谢的影响。这种扰动的净效应是间室压力升高，并 最终接近全身动脉压力的水平。因此，通向间室的动脉血管系统入口处的实际血压构成主 要因素，决定了压力可能升高达到的最高水平。在无血管结构（例如软骨和椎间盘）中，充 足供应依赖于由细胞的离子和液体泵系统通过扩散和通过渗透压梯度降液体和其他成分 传递至某一区域或从该区域向外界传递，要求细胞正常地发挥机能。如果CP(间室压）持 续地剧烈升高，则会导致相关细胞、组织和器官发生严重损伤。所述间室中细胞和组织的出 血和肿胀会进一步加重伤害，随后发生局部缺血。保持CP升高的时间越长，受到的伤害就 越广泛越严重，最终变得不可逆转，然后发生坏死性细胞死亡。机械变形、移位和切断加重 伤害。凋亡性细胞死亡会随后加重最初的伤害。CS(间室综合症）产生临床警报，例如疼 痛、虚弱、肿胀、机能降低或甚至机能丧失，最终坏死。损伤的严重性取决于间室位置、相关 细胞和组织的种类、细胞外环境的性质、实际CP、代谢紊乱及其持续时间，以及对于结果和 长期后果非常重要的其他因素。
[0004] 体内的大部分间室都由致密结缔组织分隔，这些结缔组织通常专门地作为鞘、筋 膜、筋腱、韧带、关节囊或类似非依从性胶原膜，例如心包。另外，许多内分泌器官（例如甲 状腺）和外分泌腺都被结缔组织膜和鞘包围和分隔，从而形成间室。包围、封闭、硬质间室 的另一个例子是骨结构，例如肢干、头骨、腰椎和颜面骨。各种细胞和组织接触升高的CP时 都会产生自身特征的、对主流代谢和机械扰动的承受性。不过，在合理时间内降低CP至正 常水平能够减轻伤害。
[0005] 抗分泌蛋白是41kDa蛋白，最初描述为能防止腹泻和肠炎（综述参见Lange和 Lonnroth，2001)。已知抗分泌蛋白的序列，并且克隆了其cDNA。抗分泌活性似乎主要由位 于抗分泌蛋白序列上位置35和50之间的肽行使。免疫化学和免疫组织化学研宄显示，抗 分泌蛋白由体内大部分组织和器官表达，并且也可以由它们合成。已经表征了包含抗腹泻 序列的合成肽（W097/08202;W0 05/030246)。已经揭示抗分泌因子能够使病态的体液传输 和/或炎性反应正常化，例如用霍乱菌毒素激发之后在肠管和中枢神经系统的脉络丛中的 情况（W0 97/08202)。因此，在WO 97/08202中建议可以在食物和饲料中添加抗分泌因子来 治疗水肿、腹泻、脱水和炎症。WO 98/21978揭示具有酶活性的产物用于制造诱导抗分泌蛋 白形成的食物的应用。W000/038535进一步揭示富含这种抗分泌蛋白的食品。
[0006] 还显示，在治疗细胞损失和/或增益相关病症时，抗分泌蛋白及其片断能够改 善神经组织的修复以及干细胞和祖细胞及其衍生细胞的增殖、凋亡、分化和/或迀移（W0 05/030246)〇
[0007] 对于已发生CS的情况，目前没有药物能够明确阻止压力升高并且使其回到正常 水平，也不能在威胁性或进行性CS情况下防止损害的发展。目前对患有ICP(颅内压）升 高的病人使用尿素或甘露醇之类的高渗溶液，但是这种效果是瞬时的，只能持续几个小时， 这取决于解剖定位和实际治疗程序。还使用皮质类固醇来对抗ICP升高，但是可能经常产 生严重的副作用。还提出了其他药物，但是主要是抑制产生的综合症。人们认为降低体中 心温度并结合巴比妥酸盐麻醉是有益的。但是对于例如肌肉、关节和神经中产生的CS，目前 没有可靠的药物治疗方法。外科介入是一种常用的治疗方式，但是其固有缺点是加重额外 伤害和不适感，并且有发生并发症的风险。
[0008] 即使对于有经验的内科医生而言，可靠地诊断即发性、进行性或已发性CS也是困 难的。已经使用基于例如超声波和磁共振成像（MRI)的辅助诊断，目前通常结合计算机程 序。在本申请文本中，通过借助位于光导玻璃纤维尖端的非常小的传感器测量实际压力，确 定待研宄间室中间隙液的压力。探针直径为〇. 4毫米，柔软玻璃纤维的直径仅为0. 3毫米， 意味着测量装置引起的伤害不会很重要，几乎不会对压力水平增加任何注意得到的影响。 因此，必须认为使用的装置能给出间室内主要压力的可靠值，这些压力值包括细胞外液，在 某些情况下还包括相邻细胞和/或细胞集合体中的细胞内液。
[0009] 抗分泌因子（AF)(如WO 97/08202中详细描述的特定蛋白质和肽）能有效解除肠 管中的高分泌性病症和疾病（如腹泻）。涉及AF对高分泌性病症的效果的其他例子有，例 如炎性肠病、脑水肿、青光眼、颅内压升高、Meniere病症和乳房炎。人们还认为AF能够治 疗青光眼（W0 97/08202)。
【发明内容】
[0010] 本发明涉及包含抗分泌蛋白、其具有抗分泌活性的同系物、衍生物和/或片断、和 /或其药物学可接受盐的药物合成物对于制造用于治疗和/或防止间室综合症的药物合成 物和/或医疗食物的应用。本发明还涉及与间室综合症相关的各种病症的治疗和/或防 止，这些病症例如是细胞和组织肿胀、细菌和/或病毒之类的微生物感染、和/或形成压塞， 例如在心、脏、肾脏、睾丸、卵巢、骨、关节、腺体、免疫淋巴结构、神经、脑、脊髓、皮肤、肌肉和/ 或血管壁处。
[0011] 而且，本发明涉及治疗和/或防止如上所述的间室综合症的方法，所述方法包括 给予需要的哺乳动物治疗有效量的药物合成物和/或医疗食物，所述药物合成物和/或医 疗食物包含抗分泌蛋白、其具有抗分泌活性的衍生物、同系物和/或片段、和/或其药物学 可接受盐。
[0012] 本发明还涉及适合于预期治疗目的以及病人年龄、性别、状况等的各种给药剂量 和途径。
[0013] 根据本发明的治疗可能最适合于有发生间室综合症风险和/或已患有间室综合 症的病人，和/或已经发生病原物质摄取和/或排放的病人。另外，这种治疗也有利于特征 性地表现为封闭间室的液体和离子不正常的其他病症，例如间室压力不正常。
[0014] 附图简要说明
[0015] 图1 :图1显示根据本发明SEQ ID NO 6的抗分泌蛋白氨基酸序列。该序列对应 于 US 6344440 的 SEQ ID NO 2。
[0016] 图2a_2c :用植入侧脑室区域大脑皮质中的光导光纤探针测得的大鼠 ICP。图2a 证明HSV-I感染在第5天导致ICP增大至超过40。相反，每天用AF对受到HSV-I感染的大 鼠处理两次，如图2b中所示，几乎使ICP回到正常水平。图2c显示正常、未接受处理、为受 感染的大鼠具有低ICP。探针相对于环境气压进行校准。
[0017] 图3 :通过在第0天在右鼻孔给予病毒溶液，受到HSV-I感染的大鼠的存活率。一 半数量的大鼠（η= 15)每天用1微克AF-16(上方的线）处理两次，而另一半数量的大鼠 只在HSV-I感染之后接受载剂（下方的线）。在只经过载剂处理的大鼠中，到第14天只有 10%存活，而经过AF-16处理的大鼠有60%存活。因此，对于HSV脑炎，AF-16显著提高了 存活率。
[0018] 图4a_4d :在啮齿类动物的右鼻孔点滴病毒溶液感染HSV之后的脑切片低倍放大 (图4a，图4b)和高倍放大（图4c，图4d)照片。细胞质中含有HSV蛋白的神经细胞清楚 地染成深色。丘脑中的胶质细胞（图4d)因为细胞质中HSV蛋白充裕而清楚地显示出来。 注意到许多神经细胞是无反应的（未染色）。在经过AF-16处理或只用载剂处理的动物之 间，HSV-I阳性脑细胞的出现频率或分布没有区别。
[0019] 图5 :对来自通过右鼻孔感染HSV-I的大鼠的脑组织进行的定量PCR。脑样本在 右鼻孔接种病毒5-14天之后获得。这些结果证明在经过载剂处理和经过AF处理的组群之 间，HSV-IDNA的量没有任何区别。因此，与只用载剂进行处理的情况（图2a)相比，AF-16 并没有显著影响HSV-I的产生，但是AF-16处理显著提高了存活率（图2b)。
[0020] 图6a_6b :切过筛状板的切片，筛状板是分隔脑和鼻的骨结构，筛状板中有嗅神经 穿过。在左图（图6a)中，HSV-I感染后第5天，染料-蛋白质络合物（Evans蓝-白蛋白， EBA)融合进蛛网膜下腔中。动物患中度脑炎。注意到筛状板中没有红色EBA，鼻中也没有， 因为脑和鼻腔之间的通道被阻断。在右图（图6b)中，EBA融合进未感染的正常大鼠的蛛 网膜下腔中。注意遍布筛状板的浓重红色染迹，显示出从脑（上方）至鼻腔（下方）的CSF 通道。用AF-16处理受到HSV-I感染的动物，打开CSF通过筛状板的通道，从而产生看上去 与图6b中所示正常、未感染动物相同的照片。
[0021] 定义和缩写
[0022] 缩写
[0023] ICP :颜内压；CSF :脑脊液；CNS :中枢神经系统，即大脑和脊髓；IFP :间隙液压； HSV :单纯性疱瘆病毒；PBS :磷酸盐缓冲盐水；CP :间室压；CC :封闭间室；CS :间室综合 症；AF :抗分泌因子；AF-16 :由氨基酸VCHSKTRSNPENNVGL构成的肽；八肽IVCHSKTR ;七肽 VCHSKTR ;六肽 CHSKTR ;五肽 HSKTR。
[0024] 定义
[0025] 在本文中，"间室综合症"定义为压力升高导致代谢扰动，最终在耐压结构分隔的 细胞、组织、限定结构和/或器官中的限定空间内造成伤害。术语"间室综合症"在医疗实 践中用于表征这样一种病理状况，其特征是，封闭体积（即间室）内的压力发生不正常的增 大，导致流过特指体积的例如血液和/或淋巴液减少或甚至受到阻断。间室综合症还可能 由各种病症引起，例如本文所述的病毒和微生物感染，肿瘤、出血、局部缺血、外伤、机能或 负荷过多和/或异常等。在本申请文本中，术语"封闭间室"指耐压结构分隔的细胞、组织、 器官和/或解剖结构中的限定空间。
[0026] 蛋白（质）是由氨基酸残基通过肽键连接在一起构成的生物大分子。蛋白（质） (作为氨基酸的线形聚合物）也称为多肽。蛋白（质）通常具有50-800个氨基酸残基，因 此分子量约为6000至几十万道尔顿或以上。小型的蛋白（质）称为肽或寡肽。在本申请 文本中，术语"蛋白（质）"和"肽"可以交换使用。
[0027] 在本申请文本中，"药物合成物"指包含治疗活性量的抗分泌蛋白、任选组合有药 物学活性赋形剂（例如载剂或载体）的合成物。所述药物合成物为适当的给药途径配制， 给药途径根据病人情况以及其他因素（如年龄或优选选项）变化。包含抗分泌蛋白的药物 合成物作为药物递送系统发挥作用。给予的药物合成物为病人或动物体提供活性物质。所 述药物合成物可以为例如片剂、丸剂、锭剂、胶囊、栓剂（stool pill)、凝胶等，但是并不限 于此。
[0028] 术语"药物学活性盐"指抗分泌蛋白的盐，其可以为基于所谓Hofmeiser系列的、 由抗分泌蛋白衍生的任何盐。"药物学活性盐"的其他例子包括三氟乙酸盐、乙酸盐和赖氨 酸盐酸（lysine chloride)盐，但是本发明并不限于此。
[0029] 在本申请文本中，术语"抗分泌"指抑制或减少分泌，特别是肠道分泌。因此，术语 "抗分泌蛋白"指能够抑制或减少体内分泌的蛋白质。
[0030] 在本申请文本中，"医疗食物"指使用根据本发明的含有抗分泌蛋白的合成物制造 的食物。所述食物可以为流体或固体形式的任何合适的食物，例如是液体或粉末，或任何其 他合适的食物。这些物质的例子参见WO 0038535。
[0031] 在本申请文本中，"抗分泌蛋白"或其同系物、衍生物和/或片段可以与术语"抗分 泌因子"或专利WO 97/08202中定义的"抗分泌因子蛋白"交换使用，是指抗分泌蛋白或肽 或其具有抗分泌活性的同系物、衍生物和/或片段。因此可以理解，本申请文本中的"抗分 泌因子"、"抗分泌因子蛋白"、"抗分泌肽"、"抗分泌片段"或"抗分泌蛋白"也可以指其衍生 物、同系物和/或片段。这些术语都可以在本发明的申请文本中交换使用。而且，在本申请 文本中，术语"抗分泌因子"可以缩写成"AF"。在本申请文本中，"抗分泌蛋白"还指先前如 WO 97/08202和WO 00/3853