54_Dm_24646993(gi:NP_650424. 2、gi :62484298)、gcy-32_Ce_13539160, gcy-36_ Ce_17568391(gi:32566352、gi:86564713)、gcy-35_Ce-17507861(gi:71990146)、gcy-37_ Ce_17540904(gi: 71985505)、GCYl a 3_Hs_20535603、GCYl a 2-Hs_899477 或 GYCa -99B_ Dm_729270 (gi:68067738) (Lakshminarayan et al. (2003) ^Ancient conserved domains shared by animal soluble guanylyl cyclases and bacterial signaling proteins," BMG Genomics 4:5-13)。这些名称中使用的物种缩写包括：Ana -鱼腥藻 (Anabaena Sp) ;Ccr_ 新月柄杆菌（Caulobacter crescentus) ;Cac_ 丙酮丁 醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum) ；Dde -脱硫脱硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans)； Mcsp -趋磁细菌某种（Magnetococcus sp.) ;Mde_ Microbulbifer degradans;Npu_ 点形念珠藻（Nostoc punctiforme) ;Rhsp_ 球形红细菌（Rhodobacter sphaeroides); Sone -沙雷氏菌（Shewanella oneidensis) ;Tte -腾冲嗜热厌氧菌（Thermoanaerobacter tengcongensis) ;Vch_ 霍乱弧菌（Vibrio cholerae) ;Ce_ 线虫；Dm-黑腹果幡；Hpul-马奠海胆（Hemicentrotus pulcherrimus) ;Hs -智人。在该方法的一些实施方式中，所 述H-NOX蛋白不是以下H-NOX蛋白的任何一种，所述H-NOX蛋白按照它们的生物体名称和 Pfam数据库登录号列出（例如从2006年5月21日、2006年5月22日、2007年5月21日、 2007年5月22日起可用的以下蛋白序列）：线虫种（Caenorhabditis briggsae)Q622M5_ CAEBR、线虫种 Q61P44_CAEBR、线虫种 Q61R54_CAEBR、线虫种 Q61V90_CAEBR、线虫种 Q61A94_ CAEBR、线虫种 Q60TP4_CAEBR、线虫种 Q60M10_CAEBR、线虫（Caenorhabditis elegans) GCY37_CAEEL、线虫 GCY31_CAEEL、线虫 GCY36_CAEEL、线虫 GCY32_CAEEL、线虫 GCY35_CAEEL、 线虫 GCY34_CAEEL、线虫 GCY33_CAEEL、弓背青鏘（Oryzias curvinotus)Q7T040_0RYCU、弓 背青鏘 Q75WF0_0RYCU、青鏘（Oryzias latipes)P79998_0RYLA、青鏘 Q7ZSZ5_0RYLA、黑青 斑河豚（Tetraodon nigroviridis)Q4SW38_TETNG、黑青斑河豚 Q4RZ94_TETNG、黑青斑河豚 Q4S6K5_TETNG、红鳍东方飩（Fugu rubripes)Q90VY5_FUGRU、非洲爪蟾（Xenopus Iaevis) Q6INK9_XENLA、智人 Q5T8J7_HUMAN、智人 GCYA2_HUMAN、智人 GCYB2_HUMAN、智人 GCYB1_ HUMAN、大猩猩（Gorilla gorilla)Q9N193_9PRIM、猩猩（Pongo pygmaeus)Q5RAN8_P0NPY、 黑猩猩（Pan troglodytes)Q9N192_PANTR、猕猴（Macaca mulatta)Q9N194_MACMU、白掌长 臂猿（Hylobates lar)Q9N191_HYLLA、小鼠 （Mus musculus)Q8BXH3_M0USE、小鼠 GCYB1_ MOUSE、小鼠 Q3UTI4_M0USE、小鼠 Q3UH83_M0USE、小鼠 Q6XE41_M0USE、小鼠 Q80YP4_M0USE、 褐鼠 Q80WX7_RAT、褐鼠 Q80WX8_RAT、褐鼠 Q920Q1_RAT、褐鼠 Q54A43_RAT、褐鼠 Q80WY0_ RAT、褐鼠 Q80WY4_RAT、褐鼠 Q8CH85_RAT、褐鼠 Q80WY5_RAT、褐鼠 GCYB1_RAT、褐鼠 Q8CH90_ RAT、褐鼠 Q91XJ7_RAT、褐鼠 Q80WX9_RAT、褐鼠 GCYB2_RAT、褐鼠 GCYA2_RAT、家犬（Canis familiaris)Q4ZHR9_CANFA、西藏黄牛（Bos taurus)GCYBl_BOVIN、野猪（Sus scrofa) Q4ZHR7_PIG、双斑峨（Gryllus bimaculatus)Q59HN5_GRYBI、烟草天蛾（Manduca sexta) 077106_MANSE、烟草天蛾 076340_MANSE、意大利蜂（Ap i s me 11 i f era) QSUAi7C^AP ME、意大利 蜂 Q5FAN0_APIME、意大利蜂 Q6L5L6_APIME、闪比亚症蚊 str PEST (Anopheles gambiae str PEST) Q7PYK9_AN0GA、冈比亚疟蚊 str PESTQ7Q9W6_AN0GA、冈比亚疟蚊 str PEST Q7QF31_ ANOGA、冈比亚疟蚊 str PESTQ7PS01_AN0GA、冈比亚疟蚊 str PEST Q7PFY2_AN0GA、冈比 亚疟蚊Q7KQ93_AN0GA、黑腹果蝇Q24086_DR0ME、黑腹果蝇GCYH_DR0ME、黑腹果蝇GCY8E_ DR0ME、黑腹果蝇GCYDA_DR0ME、黑腹果蝇GCYDB_DR0ME、黑腹果蝇Q9VA09_DR0ME、拟暗果蝇 (Drosophila pseudoobscura)Q29CEl_DR0PS、拟暗果蝇 Q296C7_DR0PS、拟暗果蝇 Q296C8_ DROPS、拟暗果蝇 Q29BU7_DR0PS、海蜗牛（Aplysia californica)Q7YWK7_APLCA、马粪海胆 Q95NK5_HEMPU、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii) Q5YLC2_CHLRE、鱼腥藻 Q8YUQ7_ ANASP、黄杆菌 BBFL7 (Flavobacteria bacterium BBFL7)Q26GR8_9BACT、Psychroflexus torquis ATCC 700755Q1VQE5_9FLA0、海洋 γ 蛋白菌（marine gamma proteobacterium) HTCC2207Q1YPJ5_9GAMM、海洋 γ 蛋白菌 HTCC2207Q1YTK4_9GAMM、新月柄杆菌 Q9A451_ 〇八此1?、隐藏嗜酸菌开-5仏(^(1丨口11丨1丨11111(^7口加111开-5)〇20660_4(：10￥、球形红细菌〇31(^9_ RH0S4、Silicibacter pomeroyi Q5LPV1_SILP0、脱氮副球菌（Paracoccus denitrificans) PD1222Q3PC67_PARDE、Silicibacter sp TM1040Q3QNY2_9RH0B、Jannaschia sp Q28ML8_ JANSC、Magnetococcus sp MC_1Q3XT27_9PR0T、嗜肺军团菌（Legionella pneumophila) Q5WXP0_LEGPL、嗜肺军团菌 Q5WTZ5_LEGPL、嗜肺军团菌 Q5X268_LEGPA、嗜肺军团菌 Q5X2R2_ LEGPA、嗜肺军团菌嗜肺亚种（Legionella pneumophila subsp pneumophila)Q5ZWM9_ LEGPH、嗜肺军团菌嗜肺亚种 Q5ZSQ8_LEGPH、嗜冷细菌（Colwellia psychrerythraea) Q47Y43_C0LP3、Pseudoalteromonas atlantica T6c Q3CSZ5_ALTAT、沙雷氏菌 Q8EF49_ SHEON、 Saccharophagus degradans Q21E20_SACD2、 Saccharophagus degradans Q21ER7_SACD2、Vibrio angustum S14Q1ZWE5_9VIBR、创伤弧菌（Vibriovulnificus) Q8DAE2_VIBVU、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus)12G01QlVCP6_VIBAL、弧菌（Vibrio sp)DAT722Q2FA22_9VIBR、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus)Q87NJl_VIBPA、 费氏弧菌（Vibrio fischeri)Q5ElF5_VIBFl、创伤弧菌 Q7MJS8_VIBVY、发光细菌 (Photobacterium sp)SKA：MQ2C6Z5_9GAMM、Hahella chejuensis Q2SFY7_HAHCH、海洋螺 旋菌某种（Oceanospirillum sp)MED92Q2BKV0_9GAMM、海洋杆菌某种（Oceanobacter sp) RED65Q1N035_9GAMM、脱硫脱硫弧菌（Desulfovibrio desulfuricans) Q310U7_DESDG、奥 氏嗜热盐丝菌（Halothermothrix orenii)H 168Q2AIW5_9FIRM、腾冲嗜热厌氧菌 Q8RBX6_ THETN、Caldicellulosiruptor saccharolyticus DSM 8903Q2ZH17_CALSA、丙酮丁醇梭 菌 Q97E73_CL0AB、Alkaliphilus metalliredigenes QYMF Q3C763_9CL0T、破伤风梭菌 (Clostridium tetani)Q899J9_CL0TE 和拜氏梭菌 NCIMB 8052 (Clostridium beijerincki NCMB 8052)Q2WVN0_CL0BE。在该方法的一些实施方式中，H-NOX蛋白不是褐鼠 sGC0 IH-NOX C78S或褐鼠 sGC|3 1H-N0X C78E。在该方法的一些实施方式中，所述H-NOX蛋白在Y-S-R基 序中不具有突变，所述基序包括人H-NOX的Tyrl35、Serl37和Argl39。
[0034] 除非上下文另外明确说明或规定，本文所述的所有野生型和突变蛋白及所有药物 组合物可被用在本文所述的输送氧的任何方法中。H-NOX蛋白可具有或可不具有血红素和 /或结合氧，并且可共价结合于或可不共价结合于另一个分子或部分，如聚乙二醇。在一些 实施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX结构域域和另一蛋白如白蛋白（如人血 清白蛋白）的部分或全部。
[0035] 一方面，本发明以包括一种或多种H-NOX蛋白的试剂盒为特征。在一些实施方式 中，本发明提供了试剂盒，其包括H-NOX蛋白和使用该试剂盒向个体输送氧的说明书。在一 些实施方式中，H-NOX蛋白的O 2解离常数在20°C在约InM到约ImM之间，并且H-NOX蛋白 的勵反应性在20°〇小于70(^1(如，在20°〇小于约6008'5008'1008'2(^ 1或1.88-1)。 在一些实施方式中，H-NOX蛋白的02解离常数在血红蛋白的O 2解离常数的2个数量级以 内，并且H-NOX蛋白的NO反应性比血红蛋白的NO反应性低至少10倍。在一些实施方式 中，H-NOX蛋白的O 2解离常数在20°C在约InM到约ImM之间，并且H-NOX蛋白的NO反应性 在20°0小于70〇84(如，在20°0小于约60〇8'50〇8'10〇8'2〇8 4或1.884)。在一些实施 方式中，H-NOX蛋白不是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX Y140H。除非上下文另外明确说明或规定， 本文所述的所有野生型和突变蛋白及所有药物组合物可被用在本文所述的任何试剂盒中。 H-NOX蛋白可具有或可不具有血红素和/或结合氧，并且可共价结合于或可不共价结合于 另一个分子或部分，如聚乙二醇。在一些实施方式中，H-NOX蛋白是融合蛋白，其包括H-NOX 结构域和另一蛋白如白蛋白（如人血清白蛋白）的部分或全部。
[0036] 一方面，本发明的特征在于用作药物的H-NOX蛋白（例如本文所述的任何野生 型或突变蛋白）。在一些实施方式中，本发明的特征在于在向个体输送氧的方法中使用的 H-NOX蛋白。在一些实施方式中，H-NOX蛋白被用于治疗任何输送02对其有益的症状，例如 心血管疾病、神经疾病、肿瘤缺氧、失血或受伤。
[0037] 在一些实施方式中，本发明的特征在于H-NOX蛋白（例如本文所述的任何野生型 或突变蛋白）在药物--例如向个体输送氧的药物--的制备中的用途。在一些实施方式 中，本发明以H-NOX蛋白在向个体输送氧中的用途为特征。在一些实施方式中，H-NOX蛋白 被用于治疗任何输送〇 2对其有益的症状，例如心血管疾病、神经疾病、肿瘤缺氧、失血或受 伤。 附图简述
[0038] 图IA是NO结合H-NOX蛋白和O2结合H-NOX蛋白的远侧袋残基三维结构图（血 红素之上）。NO结合H-NOX蛋白和O 2结合H-NOX蛋白的血红素配位残基也被显示（血红 素之下）。图 IA 是基于由 Pellicena，P.等人（2004 年8 月 31 日），"Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases, " Proc Natl. Acad Sci USA 101 (35) :12854-12859报道的腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的三维结构。
[0039] 图IB是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX三维结构的立体侧视图，显示了 H-NOX结构域的 结构特征。该蛋白折叠由带状图（ribbon diagram)表示。血红素、双氧配体和近端组氨 酸以球棒模型显示。α-螺旋根据图5B所示的命名法被标记为A-G。β-折叠被标记为 1-4。图 IB 来自 Pellicena，P.et al. (2004年 8 月 31 日）· "Crystal Structure of An Oxygen-Binding Heme Domain Related to Soluble Guanylate Cyclases, " Proc Natl. Acad Sci USA 101 (35):12854-12859。
[0040] 图1C-1H是腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的三维结构图，显示了腾冲嗜热厌氧菌H-NOX 中的示例性远侧袋残基。图1C-1H中所示的以下残基是组成H-NOX远侧袋的主要残基： Thr4、Ile5、Thr8、Trp9、Trp67、Asn74、Ile75、Phe78、Phe82、TyrHO 和 Leul44,它们被包含 在螺旋 A、D、E 和 G 中。图 1C-1H使用 PYMOL(DeLano Scientific, LLP)创建。
[0041] 图2是结合或被预测结合O2和NO的下列H-NOX蛋白的序列对比：多数（Majority) (SEQ ID N0:1), Ce. gcy-31(SEQ ID NO: 2), Ce. gcy-33 (SEQ ID NO: 3), Ce. gcy-35 (SEQ ID N0:4)、Dm.CG14885HN0X(SEQ ID N0:5)、Dm.CG4154HN0X(SEQ ID N0:6)、Ms.Beta3HN0X(SEQ ID NO: 7)、Tt HNOX(SEQ ID NO:8)和 Ca HNOX(SEQ ID NO:9)。预测这些 H-NOX 蛋白结合 O2 以及N0,因为它们在对应于腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Y140的位置上具有酪氨酸。图2中使 用的氨基酸编号以H-NOX结构域或全长蛋白中的第一个氨基酸起始，作为第1个残基。在 MegAlign程序中使用默认参数产生该对比。图2中使用的缩写在下文关于图4A-4D进行描 述。
[0042] 图3A-3D是结合或被预测结合NO而非O2的下列H-NOX蛋白的序列对比：多 数（Majority)(SEQIDN0:10)、Dm·sGCβl蛋白（SEQIDN0:ll)、sGCβl蛋白（SEQID N0:12)、hs. sGC0 1 蛋白（SEQ ID N0:13)、hs. β2 蛋白（SEQ ID N0:14)、Ms. sGC0 1 蛋白 (SEQIDN0:15)、Mm·sGCβl蛋白（SEQIDN0:16)、Np·βlHD样（SEQIDN0:17)、Tr·sGCβl 蛋白（SEQ ID N0:18)、冈比亚按蚊（Anopheles_gambiae)|XP_310919(SEQ ID N0:19)、蜜 蜂（Apis_mellifera)|NP_001011632(SEQ ID NO:2O)、Bt.sGC0 1 蛋白（SEQ ID N0:21)、 莱茵衣藻（Chlamydomonas_reinhardtii)|AAR02(SEQ ID N0:22)、弓背青鎌（0ryzias_ curvinotus)|BAC98396(SEQIDN0:23)、中华青鏘（0ryzias_latipes)|BAA76691(SEQID N0:24)、紫球海胆（Strongylocentrotus_purpuratus)|X(SEQ ID N0:25)和野猪（Sus scrofa)0 I |NP_001018042+(SEQ ID N0:26)。该对比使用 MegAlign 程序中的默认参数产 生。图3A-3D中使用的缩写在下文中关于图4进行描述。
[0043] 图4A-4D是来自图2和图3A-3D的H-NOX蛋白的序列对比：多数（Majority) (SEQ ID NO:27)、Dm.sGC0 1 蛋白（SEQ ID NO:ll)、sGC0 1 蛋白（SEQ ID NO:12)、hs.sGC0 1 蛋白（SEQ ID NO: 13)、hs. β 2 蛋白（SEQ ID NO: 14)、Mm. sGC0 I 蛋白（SEQ ID NO: 16)、 Np·βlHD样（SEQIDN0:17)、Tr·sGCβl蛋白（SEQIDN0:18)、莱茵衣藻（Chlamydomonas_ reinhardtii) |AAR02(SEQ ID N0:22)、弓背青鎌（0ryzias_curvinotus) |BAC98396(SEQ ID N0:23)、紫球海胆（Strongylocentrotus_purpuratus)|X(SEQ ID N0:25)、野猪（Sus scrofa) β I |NP_001018042(SEQ ID NO: 26), gcy-31a (SEQ ID NO: 2), gcy-33 (SEQ ID NO:3)、Ca. HNOX(SEQ ID NO:9)、Τ· β IHD样（SEQ ID NO:8)、Ms.sGc0 3蛋白（SEQ ID NO:7)、 CG14885 (SEQ ID NO:5)和Dm. sGC短变体（SEQ ID NO: 6)。该对比使用 MegAlign程序中的默 认参数产生。对于图2-4D，"Dm. sGC0 1蛋白"表示黑腹果蝇β 1H-N0X ;"sGC0 1蛋白"表示 褐鼠 β 1H-N0X ;"hs. sGC0 1蛋白"表示智人β 1H-N0X ;"hs. β 2蛋白"表示智人β 2H-N0X ; "Mm. sGC0 1蛋白"表示小鼠 β 1Η-Ν0Χ ;"Νρ. β IHD样"表示球形念珠藻H-NOX ;"Tr. sGC0 1 蛋白"表示红鳍东方飩β 1H-N0X;"冈比亚按蚊（Anopheles_gambiae) |XP_310919"表示冈 比亚按蚊 β IH-NOX 蜜蜂（Apis_mellifera) |NP_001011632" 表示蜜蜂 β IH-NOX ;"Bt. sGC0 1 蛋白"表不西藏黄牛 β 1H-N0X 莱茵衣藻（Chlamydomonas_reinhardtii) |AAR02" 表示莱茵衣藻β 1H-N0X 弓背青鏘（0ryzias_curvinotus)|BAC98396表示弓背青鏘 β 1H-N0X 青鏘（Oryzias_latipes) |BAA76691" 表示中华青鏘 β 1H-N0X 紫球海胆 (Strongylocentrotus_purpuratus)|X" 表不紫球海胆 β1Η_Ν0Χ;"野猪（Sus scrofa) β l|NP_001018042+" 表示野猪 β 1H-N0X ;"gcy-31a" 表示线虫 Gcy-31a H-NOX ;"gcy-33" 表示线虫 Gcy-33H-N0X ;"gcy-35" 表示线虫 Gcy-35H-N0X ;"Ca. ΗΝ0Χ" 表示丙酮丁醇 梭菌H-NOX ;"Τ. β IHD样"表示腾冲嗜热厌氧菌H-NOX ;"Ms. sGc β 3蛋白"表示烟草天 蛾β 3Η-Ν0Χ ;"CG14885"表示黑腹果蝇CG14885H-N0X ;"Dm. sGC短变体"表示黑腹果蝇 Gcy-88-E-S H-NOX 并且 "Dm. CG4154HN0X" 表示黑腹果蝇 CG4154H-N0X。
[0044] 图5A是H-NOX家族成员的序列对比。序列编号为腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的编 号。突变残基由"V"示出，极高保守残基由"s"示出。腾冲嗜热厌氧菌H-NOX的Y140由 "H"示出。在其它H-NOX蛋白中可稳定Fe 11-O2复合体的预测的远侧袋酪氨酸残基：对于线 虫GCY-35是位置70 ;在黑腹果蝇CG14885-PA中是位置140 ;线虫GCY-35的位置138 ;丙酮 丁醇梭菌的位置140;根据腾冲嗜热厌氧菌编号。登录号为：智人M[gi:2746083](SEQ IDN0:28)、褐鼠 βl[gi:27127318](SEQIDN0:29)、黑腹果蝇βl[gi:861203](SEQID NO: 30)、黑腹果蝇 CG14885-PA[gi :23171476] (SEQ ID NO: 31)、线虫 GCY-35 [gi :52782806] (SEQ ID N0:32)、点形念珠藻[gi:23129606](SEQ ID N0:33)、新月柄杆菌[gi:16127222] (SEQ ID NO: 34)、沙雷氏菌[gi :24373702] (SEQ ID NO: 35)、嗜肺军团菌（0RF 2) [CUCGC_272624](SEQIDN0:36)、丙酮丁醇梭菌[gi:15896488](SEQIDN0:37)和腾冲嗜 热厌氧菌[gi:20807169](SEQ ID N0:38)。使用程序MegAlign, Lasergene, DNA Star (参见 万维网"dnastar. com/products/megalign.php"）产生对比。Clustal-W默认参数被使用。
[0045] 图5B是示例性H-NOX结构域的序列对比。该对比顶部的二级结构注释和编 号对应于腾冲嗜热厌氧菌的H-NOX结构域。α-螺旋由螺旋表示，而β-折叠由箭头 表示。远侧袋由α-螺旋aA、aD、αΕ和aG界定。Pubmed/NCBI登录号如下：Ther_ tengcongensis gi |20807169| (SEQ ID NO:39) λ Clos_ac