来源于缺乏任何功能性α1,3半乳糖基转移酶表达的动物的组织产品的制作方法
【专利说明】来源于缺乏任何功能性α 1,3半乳糖基转移酶表达的动物 的组织产品
[0001] 本申请是申请日为2005年3月17日的中国专利申请200580015470. 4"来源于缺 乏任何功能性α 1，3半乳糖基转移酶表达的动物的组织产品"的分案申请。
[0002] 本申请要求2004年3月17日提交的美国临时专利申请No. 60/553,895和2004 年4月6日提交的美国临时专利申请No. 60/559,816的优先权。
技术领域
[0003] 本发明提供了来源于缺乏任何功能性α 1，3半乳糖基转移酶（α 1，3GT)表达的动 物的组织。所述组织可以用于异种移植领域，如整形外科重建和修复、皮肤修复和内部组织 修复，或用作医学设备。
【背景技术】
[0004] 反刍动物，如猪、羊和牛被认为很可能是异种移植器官和组织的来源。猪异种移植 物得到了最多的关注，因为猪的供应是充足的，繁殖程序已经确立，并且它们的大小和生理 与人类相容。其它反刍动物来源，如牛或羊也已经被建议作为硬和软组织异种移植物的来 源。但是，必须克服一些障碍，才能将这些器官或组织成功转移到人体中。最重要的是免疫 排斥。第一种免疫障碍是"超急性排斥"（HAR)。HAR是由高滴度的预先形成的与外来组织 结合的天然抗体的普遍存在而确定的。认为这些天然抗体与供体组织内皮上靶表位的结合 是HAR的起始事件。在受体血灌注到供体组织的数分钟内发生该结合，随后是补体激活、血 小板和纤维蛋白沉积，最后是间质水肿和供体器官内出血，所有这些都导致受体中组织的 排斥（Strahan et al. (1996)Frontiers in Bioscience l,e34_41)〇
[0005] 最常移植到人体中的组织是骨（J. M. Lane et al. Current Approaches to Experimental Bone Grafting,180rthopedic Clinics ofNorth America(2)213(1987)) 〇 仅仅在美国，每年进行超过100, 〇〇〇次骨移植或植入程序，以修复或替代创伤、感染、先天 畸形或恶性肿瘤导致的骨缺损。人类的骨是硬结缔组织，由包埋在矿质化的基质和胶原 纤维中的细胞组成（Stedman' s Medical Dictionary，Williams&Wilkins，Baltimore, Md. (1995))。
[0006] 骨移植物和植入物通常由自体骨形成。但是，通常不能提供用于大的缺损的可移 植自体骨组织，特别在儿童中更是如此。此外，自体骨移植可能导致术后疾病，如供体部位 的疼痛、出血、伤口问题、美观问题、感染或神经破坏。此外，从移植的自体骨组织制造需要 的功能形状是困难的，会导致骨缺损的填充不能达到最佳效果。
[0007] 也常常将软组织，如腱、韧带、软骨、皮肤、心脏组织和瓣膜、以及粘膜下组织移植 到人体中。通过使用异种移植材料，最初组织的许多结构和许多特性可以保留在移植物中。 如果可以经过加工而安全移植到人体，异种移植物组织代表了可获得的材料的无限供应。
[0008] -旦植入到个体中，异种移植物激发了免疫反应，如异种移植物的慢性和超急性 排斥。由于该排斥，骨异种移植物表现出骨折、重吸收和不愈合的比例增加。采用动物组织， 如猪、牛或羊组织作为人类植入物的主要免疫障碍是天然的抗半乳糖α 1，3-半乳糖抗体， 其包含大约1 %的人和猴抗体。
[0009] 除了古代猴、猿和人，大多数哺乳动物在它们的细胞表面携带含有半乳糖α 1， 3-半乳糖表位的糖蛋白（Galili et al.，J. Biol. Chem. 263 :17755-17762,1988)。相反， 在其它哺乳动物，如猪的细胞上发现含有半乳糖α?，3-半乳糖的糖蛋白。人、猿和古代猴 不具有半乳糖α?，3-半乳糖，并且具有大量产生的天然存在的抗半乳糖α?，3-半乳糖抗 体（Cooper et al.，Lancet 342:682-683,1993)。它与携带al，3_半乳糖的糖蛋白和糖 脂特异性结合。
[0010] 哺乳动物中"a-l，3GT表位"和抗Gal抗体（即与携带半乳糖α 1，3-半乳糖的 糖蛋白和糖脂结合的抗体）的不同分布是进化过程的结果，该进化过程在祖先的古代灵长 类动物和人类中选择具有灭活的（即，突变的）α-1，3_半乳糖基转移酶的物种。因此，人 类是a-l，3_GT "天然敲除体"。该事件的直接结果是异种移植物的排斥，如最初通过HAR 导致的移植到人体中的猪器官的排斥。
[0011] 已经实施了多种策略来去除或调节猪异种移植导致的抗Gal体液应答，包括具有 α-半乳糖苷酶的表位的酶促去除（Stone et al·，Transplantation 63:640-645,1997)、 特异性抗 gal 抗体去除（Ye et al·，Transplantation 58 :330-337,1994)、用其它碳水 化合物部分给表位加帽，这些策略没能去除a-l，3_GT表达（Tanemura et al.，J.Biol. Chem. 27321 :16421-16425,1998 和 Koike et al·, Xenotransplantation 4:147-153, 1997)，所述策略还包括补体抑制蛋白的导入（Dalmasso et al.，Clin. Exp. Immunol. 86 : 31-35,1991,Dalmasso et al.Transplantation 52:530-533(1991))。Costa 等人（FASEB J 13,1762(1999))报道了 H-转移酶转基因猪中a-l，3-GT的竞争性抑制仅仅导致了表位 数目的部分减少。类似地，Miyagawa等人（J Biol. Chem 276,39310(2001))报道了尝试阻 断N-乙酰基葡糖氨基转移酶III转基因猪的gal表位表达也仅仅导致了 gal表位数目的 部分减少，并且不能显著延长灵长类受体中的移植物存活。
[0012] Badylak等开发了从猪小肠分离粘膜下组织的方法，用于多种组织移植物，包括结 缔组织移植物，以修复关节韧带（前交叉韧带）和修复肩转子套（rotator cuff)。用化学和 酶促步骤处理小肠粘膜下（SIS)材料，以剥离存活细胞的组织，留下促进宿主细胞向内生 长和组织再生的无细胞的细胞外基质（参见，例如，美国专利Nos. 4, 902, 508,4, 956, 178和 5, 372, 821)。该方法目前用于人类组织移植。但是，尽管采用了化学处理步骤，半乳糖α 1， 3半乳糖残基保持包膜在移植物中，并且导致人类患者中的免疫激活和炎症（Allman et al. 2001,Transplantation 71,1631-1640 ;Mcpherson et al. ,2000,Tissue Engineering 6(3) ,233-239) 〇
[0013] Stone等开发了在移植前处理猪软组织和骨组织以去除细胞材料，然后用α半乳 糖基酶处理以去除半乳糖a 1，3_半乳糖的方法（Stone et al.Transplantation 1997: 63 :646-651 ;Stone et al.Transplantation 1998:65:1577-83)。该方法是许多患者应 用的目标，其讨论了将所述组织用于多种应用，如前交叉韧带修复、半月板修复、关节软 骨异种移植物、粘膜下异种移植物和骨基质异种移植物、心脏瓣膜置换和软组织异种移 植物，参见例如美国专利 Nos. 5, 865, 849, 5, 913, 900, 5, 984, 858,6, 093, 204,6, 267, 786， 6, 455, 309,6, 683, 732, 5, 944, 755,6, 110, 206，6, 402, 783 和 5, 902, 338 ;美国专利申 请 Nos. 2002/0087211，2001/0051828,2001/0039459,2003/0039678,2003/0023304 和 2003/0097179 ;以及 PCT 公开 Nos. W000/47131，TO 00/47132，W099/44533, TO 02/076337， W099/51170,TO 99/47080，W0 03/097809，W0 02/089711，W001/91671 和 TO 03/105737。
[0014] 因此，本领域需要提供不导致对人类的有害作用的组织移植物。
[0015] Costa等人（FASEB(2003) 17 :109-111)报道了通过软骨中α 1，2_岩藻糖基转移 酶的转基因表达（HT转基因）减少了移植到野生型和α-1，3_半乳糖基转移酶敲除小鼠中 的猪软骨的迟发排斥。
[0016] 已经报道了猪细胞和活动物中a-l，3_GT基因座的单等位基因敲除。Denning等 人（Nature Biotechnology 19 :559-562,2001)报道了绵羊中 a-l，3-GT 基因的一个等 位基因的祀定的基因缺失。Harrison 等人（Transgenics Research 11:143_150,2002) 报道了杂合的a-l，3_GT敲除的猪胚胎成纤维细胞体细胞的产生。在2002年，Lai等人 (Science 295:1089-1092,2002)和 Dai 等人（Nature Biotechnology 20:251-255,2002) 报道了 a-l，3_GT基因的一个等位基因被成功灭活的猪的产生。Ramsoondar等人（Biol of R印roduc 69,437-445(2003))报道了杂合的a-l，3-GT敲除的猪的产生，该猪表达HT 和a-l，3_GT表位，也表达人类a-l，2_岩藻糖基转移酶（HT)。
[0017] Austin 研究所的 PCT 公开 No. TO 94/21799 和美国专利 No. 5, 821，117 ;Bresatec 的 PCT 公开 No. W095/20661 ;以及 BioTransplant，Inc 和 The General Hospital Corporation 的 PCT 公开 No. TO95/28412,美国专利 No. 6, 153, 428,美国专利 No. 6, 413, 769 和美国公开No. 2003/0014770提供了基于a-1，3-GT基因的cDNA的了解（不了解基因组 组构或序列）而产生a-l，3_GT阴性猪细胞的讨论。但是，在这些申请的申请日之前没有 证据表明所述细胞确实产生，并且实施例都是预言性的。
[0018] 成功产生杂合的α -1，3-GT阴性猪细胞的第一次公开发生在1999年7月的Lake Tahoe 转基因动物会议上（David Ayares，PPL Therapeutics，Inc.，" Gene Targeting in Livestock" , Transgenic Animal Research Conference, July 1999, Abstract, pg.20 ； Ayares，IBS News R印ort，Nov. 1999 :5-6)。直到最近，还没有发表或公开杂合的a 1，3GT 阴性猪细胞的产生。此外，由于目前还不能获得猪胚胎干细胞，目前仍然不能使用a-1， 3-GT杂合胚胎干细胞来试图制备活的纯合a 1，3GT敲除猪。
[0019] 在 2〇〇3 年 2 月 27 日，Sharma 等人（Transplantation 75 :43〇-436 (2〇〇3)发表了 一篇报道，其中证明了成功产生了纯合的a-l，3_GT基因敲除的猪胚胎成纤维细胞。
[0020] PPL Therapeutics的PCT公开No. WO 00/51424描述了用于核转移的体细胞的遗 传修饰。该专利申请公开了猪体细胞中a-l，3_GT基因的遗传破坏，以及随后用这些缺乏 至少一个拷贝的a-l，3_GT基因的细胞的核进行核转移。
[0021] Cooper&Koren的美国专利No. 6, 331，658要求保护表达唾液酸转移酶或岩藻糖基 转移酶蛋白的遗传工程化的哺乳动物，但其中并没有证实该动物的实际产生。该专利指出 该遗传工程化的哺乳动物将表现出哺乳动物细胞表面上的半乳糖基化蛋白的减少。
[0022] 密苏里大学校产管理董事的PCT公开No. W003/055302证实了产生用于异种移植 的杂合a 1，3GT敲除幼猪。该申请广泛涉及包含破坏的a-l，3_GT基因的敲除猪，其中与野 生型相比，敲除猪中功能性a-1，3_GT的表达减少。该申请没有提供关于使得猪能够用于 异种移植时a-1，3_GT必须减少的程度。此外，该申请并未提供任何关于产生的杂合猪表 现