针对海产鱼的类结节病的dna疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于诱导针对鱼类感染类结节病的病原菌美人鱼发光杆菌杀鱼 亚种t/affise/ae 5^5/7. piscicit/a)的保护性免疫的 DNA 疫苗。
[0002] 本说明书中的"类结节病（pseudotuberculosis，假结核病）"是指由A t/affise/ae 5^5/7. Ms1CiciiZa的感染引起的类结节病，因此，不仅包含在青甘鱼（Seriola quinqueradiata，蛳鱼）类中发病的类结节病，还包含在青甘鱼类以外的鱼类[例如属于鱼卢 形目（Perciformes)的鱼类（黑鯛、真鯛、赤点石斑鱼等）、属于胡瓜鱼目（Osmeriformes) 的鱼类（香鱼等）、属于飩形目（Tetraodontiformes)的鱼种（绿鳍马面飩等）等]中因相 同病原菌而发病的巴氏杆菌病（Pasteurellosis)。
【背景技术】
[0003] 在以海鲜类为代表的众多水生生物的养殖产业中，作为封闭系统的养殖领域中的 病毒性疾病和细菌性疾病，由于个体高密度地存在，因此这些感染的影响巨大，成为养殖产 业中的严重问题。
[0004] 类结节病（或巴氏杆菌病）作为1963年在美国切萨皮克（Chesapeake)湾中白鱼卢 鱼（Roccus americanus，美洲白辦）大量死亡的病原疾病而首次被报道（非专利文献1)。 在日本，1968年在四国南西的养殖青甘鱼0岁鱼中观察到该病的发生，第二年1969年在西 日本一带的养殖青甘鱼中流行。另外，并非只有青甘鱼类，在黑鯛、真鯛、赤点石斑鱼、香鱼、 绿鳍马面飩等鱼种中也有发生，由于该病具有极强的传染性，因此成为威胁海产养殖的问 题（非专利文献1)。
[0005] /I 属于发光杆菌属，是呈现革兰氏阴性兼性厌氧 性的非运动性短杆菌（0. 6~1. 2X0. 8~2. 6 #m)的一科。该细菌的增殖适温为25~ 30°C，最佳pH为7. 5~8. 0,最佳食盐浓度为2~3%，对氨节西林（Ampicillin)、奥索利酸 (Oxolinic acid)、氟苯尼考（Florfenicol)等显示出敏感性。该病的症状以在脾脏和肾脏 中形成Imm左右的小白点为特征。小白点是细菌集落配置点，多数被纤维组织包围形成结 节。这些菌集落的形成是基于：可耐受吞噬细胞的细胞内消化，并在吞噬细胞内发生增殖， 从而在毛细血管或间质组织内形成菌球（非专利文献2)。
[0006] 在日本，虽然针对该病已经批准了灭活疫苗，但灭活疫苗难以诱导细胞免疫。然 而，细胞免疫的诱导能力高的疫苗还几乎没有开发（专利文献1和专利文献2)。
[0007] 在细菌感染症的预防或治疗中通常使用疫苗。疫苗有灭活疫苗（日本脑炎、外氏 病等）、类毒素（破伤风、白喉等）、减毒疫苗（卡介苗（BCG)、脊髓灰质炎等）、基因重组疫 苗（乙型肝炎病毒等）等。灭活疫苗和使外毒素无毒化而获得的类毒素是诱导对抗这些疾 病的抗体的比较安全的疫苗。与灭活疫苗相比，基因重组疫苗不含杂质，因此被认为是更安 全的疫苗。
[0008] 但是，虽然这些疫苗可以诱导抗体的产生，但难以诱导细胞免疫，这是其缺点。另 外，灭活疫苗和减毒疫苗需要在产业上大量获得作为抗原的蛋白，必须适当地增殖病原菌。 而且，通过减毒疫苗获得的免疫效果虽然大多能够长期维持，但另一方面被指出具有副作 用、危险性。认为灭活疫苗和基因重组疫苗在宿主内的抗原持续性短，需要佐剂等。现有的 这些疫苗从制备到接种到被检体内这段期间需要冷藏保存，因此存在着成本增加和效力降 低的问题。
[0009] 最近，疫苗的研宄开发正在推进，通过给予编码免疫原性蛋白的质粒DNA，开发了 带来免疫诱发的新疫苗种类（DNA疫苗），如下所述改善了现有疫苗的不利。即，由于DNA疫 苗不仅可以诱导体液免疫应答，还可以强效诱导细胞免疫，因此具有以下优点：可以赋予对 感染症的保护能力；可以高度纯化；在室温或高温下也稳定，无需冷藏保存即可长期贮藏； 通过基因工程学方法容易迅速地改良DNA疫苗；以及缩短疫苗开发所花费的时间等。
[0010] 已知通过向肌肉内注射编码杆状病毒UfeMorirw1S)的结构蛋白的糖蛋白的基 因，会刺激虹鳟和比目鱼的免疫应答（非专利文献3)。另外，关于虹鳟和比目鱼有DNA疫苗 的报道（非专利文献4)。但在其他鱼种中没有DNA疫苗的报道。
[0011] 现有技术文献 专利文献 专利文献1 :日本特开平9-176043号公报； 专利文献2 :日本特开2002-003400号公报； 非专利文献 非专利文献 1:S. F. Snieszko 等人，"Bacteriology"，（美国），1964 年，88 卷， 第 1814-1814 页； 非专利文献2:若林久嗣、室贺清邦编集，"魚介類ω感染症·寄生虫症"，（恒星社厚 生阁），2004年，第206-211页； 非专利文献3 :P. Boudinot等人，"Virology"，（美国），1998年，249卷，第 297-306 页； 非专利文献 4 :McLauchlan 等人，"Fish and shellfish Immunology"，（英国）， 2003 年，15 卷，第 39-50 页。
【发明内容】
[0012] 发明所要解决的课题 本发明的课题在于提供：用于诱导针对类结节病的保护性免疫的鱼类用DNA疫苗。
[0013] 用于解决课题的手段 本发明人深入研宄了对海产鱼的类结节病有效的疫苗，结果发现：将携带编码A damselae 5?办577· 的月旨蛋白(Lipoprotein: ppal: SEQ ID NO: I)、DegQ 丝 氨酸蛋白酶（DegQ serine protease: ppa2: SEQ ID NO: 3)和外膜蛋白 A 前体（Outer membrane protein A precursor: pparsl: SEQ ID NO: 5)的基因的质粒 DNA 混合或分别 接种给比目鱼和红甘鰺（红甘）时，具有对抗海产鱼的类结节病的免疫效果、以及增加免疫 相关基因的表达量。而且，将这些序列按照比目鱼的密码子使用频率进行序列变换形成人 工基因 （SEQ ID NO: 7、9、11)，将携带该基因的质粒DNA也同样进行接种时，发现各自具有 高的免疫防除效果，完成了本发明。
[0014] BP，本发明涉及下述的[1]~[9]。
[0015] [1] [1]的鱼类用DNA疫苗，其特征在于，包含下述物质作为有效成分：包含编码 针对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的免疫原性多肽的核苷酸序列或将该序列根据比目鱼的密 码子使用频率进行修饰而获得的核苷酸序列的DNA、或包含上述DNA的表达载体；
[2] [1]的鱼类用DNA疫苗，其中，上述免疫原性多肽是由选自美人鱼发光杆菌杀鱼亚 种的ppal、ppa2和pparsl的基因编码的多肽或其部分片段；
[3] [2]的鱼类用DNA疫苗，其中，上述免疫原性多肽是由SEQ IDNO: 2、4或6所表示 的氨基酸序列构成的多肽或其部分片段；
[4] [1]的鱼类用DNA疫苗，其中，上述免疫原性多肽是：⑴包含SEQ ID NO: 2、4或 6所表示的氨基酸序列的多肽；（2)包含SEQ ID NO: 2、4或6所表示的氨基酸序列中有1 个或多个氨基酸被缺失、取代或添加而获得的氨基酸序列、且具有针对美人鱼发光杆菌杀 鱼亚种的免疫原性的修饰多肽；或（3)与SEQ ID NO: 2、4或6所表示的氨基酸序列的同源 性为80%以上、且具有针对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的免疫原性的同源多肽；或者它们的 部分片段；
[5] [1]的鱼类用DNA疫苗，其中，上述核苷酸序列是：（1) SEQIDN0: 1、3、5、7、9或 11所表示的核苷酸序列；或（2)与SEQ IDN0: 1、3、5、7、9或11所表示的核苷酸序列的同 源性为80%以上、且编码具有针对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的免疫原性的多肽的核苷酸序 列；或者它们的部分序列；
[6] [1]的鱼类用DNA疫苗，其中，上述表达载体为包含天然型基因的质粒wild-ppal、 wild_ppa2 或 wild-pparsl、或者包含修饰基因的质粒 opt-ppal、opt_ppa2 或 opt-pparsl ;
[7] 类结节病的预防或治疗方法，其特征在于：对鱼给予[1]~[6]中任一项的鱼类用 DNA疫苗；
[8] [7]的方法，其中，上述鱼为属于鲈形目、飩形目或胡瓜鱼目的鱼；
[9] [1]~[6]中任一项的鱼类用DNA疫苗在诱发针对海产鱼的类结节病的免疫应答 中的应用。
[0016] 另外，本发明还涉及： 鱼类用DNA疫苗用的或类结节病的预防或治疗用的DNA、或包含上述DNA的表达载体， 所述DNA包含编码针对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的免疫原性多肽的核苷酸序列；以及 DNA或包含上述DNA的表达载体在制备鱼类用DNA疫苗中的应用，所述DNA包含编码针 对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的免疫原性多肽的