锦灯笼宿萼皂苷在制备抗肿瘤药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及以锦灯笼宿萼皂苷在制备抗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 锦灯笼（Physalis alkekengi, L. var. francheti (Mast. ) Makino )又名红姑娘、 挂金灯、红灯笼、灯笼果，为爺科（Solanaceae)酸楽属植物，广泛分布于欧亚大陆，如俄 罗斯、中国、日本以及朝鲜等国家。锦灯笼为带果实的宿萼，秋季果实成熟，果实球形、味 甘、微酸，可作水果，营养丰富；宿萼微苦，成熟时呈红色或橙红色。锦灯笼果实不仅可 以食用，而且是我国的传统中药。锦灯笼含有内酯类、黄酮类、萜类、生物碱类、留醇类、氨 基酸类及无机元素等几大类化学成分。已有的研究表明，锦灯笼有多方面的药理作用，如 酸浆苦素B是锦灯笼的主要抗炎成分，常用于上呼吸道感染疾病的治疗；木犀草素对心血 管系统、祛痰及体外抗柯萨奇均具较好疗效。然而有关锦灯笼宿萼皂苷抗肿瘤活性的研究 尚未见报道，我们发现其抗肿瘤作用明显，是一种有开发前途的抗肿瘤药物。
【发明内容】
[0003] 本发明提供了锦灯笼宿萼皂苷在制备抗肿瘤药物方面的应用。
[0004] 本发明提供的化合物的制备方法为：将干燥的成熟锦灯笼宿萼粉碎，乙醇浸泡过 夜；水浴回流提取，过滤，取上清，共提取3次；将3次的滤液合并，离心，取上清弃沉 淀；将上清水浴旋转蒸发并回收乙醇.将上述上清液与配制好的水饱和正丁醇在分液漏斗 上反复充分震荡混合，过夜；然后将下层水层放入烧杯中，正丁醇层保留，将水层重复上 述萃取步骤两次；合并上层正丁醇层，旋转蒸发回收正丁醇至黏稠状；用少量甲醇溶解沉 淀，加入乙醚洗涤，离心，洗涤数次至上清无色；沉淀物在真空干燥箱中干燥过夜得粗皂 苷；将锦灯笼宿萼粗皂苷配制成10 mg/mL的水溶液，充分溶解、离心后，将上清液上样于 大孔树脂层析柱洗脱：首先用蒸馏水洗脱，将洗脱液进行薄层层析（TLC)检测，直至硅胶 G薄层层析检验没有显色反应为止，洗脱至无寡糖存在；然后以乙醇溶液进行洗脱，将洗脱 液进行三氯醋酸显色，直至无颜色反应，将洗脱液旋转蒸发浓缩至一定体积，水浴蒸发去 除存留的少量乙醇后，将浓缩液冰冻干燥，即得分离纯化后的锦灯笼宿萼皂苷。
[0005] 本发明提供的含有化合物的药物，可以通过将化合物添加药学上可接受的辅料或 可选的其它成分而制成适于临床使用的药物组合物。
[0006] 本发明的化合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，是通过以下的药效实验得到证实 的。
【具体实施方式】
[0007] 制备例1:锦灯笼宿萼皂苷的制备 取600g干燥的成熟锦灯笼宿萼粉碎，加入70%的乙醇，浸泡过夜；60°C水浴回流提取 2 h，过滤，取上清，共提取3次；将3次的滤液合并，3 500 r/min离心10 min，取上清 弃沉淀；将上清水浴旋转蒸发并回收乙醇.将上述上清液与配制好的水饱和正丁醇在分液 漏斗上反复充分震荡混合，过夜；然后将下层水层放入烧杯中，正丁醇层保留，将水层重 复上述萃取步骤两次；合并上层正丁醇层，旋转蒸发回收正丁醇至黏稠状；用少量甲醇溶 解沉淀，加入5倍乙醚洗漆，3 OOO r/min离心15 min,洗漆数次至上清无色；沉淀物在 真空干燥箱中干燥过夜得粗皂苷；将锦灯笼宿萼粗皂苷配制成10 mg/mL的水溶液，充分溶 解、离心后，将上清液上样于D-101大孔树脂层析柱（4 cmX40 cm)，静止0.5 h后进行洗 脱.洗脱：首先用蒸馏水洗脱，将洗脱液进行薄层层析（TLC)检测，直至硅胶G薄层层析 检验没有显色反应为止（薄层层析方法：用正丁醇-甲酸-水（4 : 6 : 1，体积比）为展 开剂，5%硫酸乙醇溶液为显色剂，KKTC条件下2 min即可显色），洗脱至无寡糖存在；然 后以60%的乙醇溶液进行洗脱，将洗脱液进行三氯醋酸显色，直至无颜色反应，将洗脱液 旋转蒸发浓缩至一定体积，水浴蒸发去除存留的少量乙醇后，将浓缩液冰冻干燥，即得分 离纯化后的锦灯笼宿萼皂苷。
[0008] 实验例1:锦灯笼宿萼皂苷对体外肿瘤细胞的抑制作用 材料和试剂 药物及试剂： 锦灯笼宿萼皂苷，白色粉末，按照制备例1方法制备； 注射用硫酸长春新碱，上海华联制药有限公司，规格Img/支； RPMI1640培养基：GIBC0公司生产； 新生牛血清(超级)，杭州四季青生物工程材料有限公司； 胰蛋白酶，Sigma公司生产； 横基罗丹明B(sulforhadamineB,SRB)，Sigma公司； 注射用链霉素，山东瑞阳制药有限公司，Ig (100万单位）/支； 注射用青霉素钠，山东鲁抗医药股份有限公司，80万单位/支； 其它常用化学试剂为国产分析纯。
[0009] 细胞株：人肝癌细胞株SMMC-7721、Bel-7402、人卵巢癌细胞株H08910、人前列腺 癌胞PC-3M、人肺腺癌细胞株A549、人结肠癌细胞株HCT-8、人食管癌细胞株CaEs-17、人脑 胶质瘤细胞株U251、人胃癌细胞株BGC-823、人胃腺癌细胞株SGC-7901，均购自中国医学科 学院北京肿瘤研究所药理室。
[0010] 仪器：C02培养箱，超净工作台，酶标仪，倒置显微镜，细胞培养瓶（Costar，USA)， 96孔细胞培养板（Costar，USA)。
[0011]软件：MicrosoftExcel7. 0 统计分析软件；MicrocalOrigin6. 0 数据处理软 件。
[0012] 实验方法 药物及试剂配制： RPMI1640培养基一袋加水一升，补加2克碳酸氢钠，10万单位青霉素和IOOmg链霉素， 调节pH值至7. 4,用0. 22Mm除菌滤膜过滤除菌。90ml培养基加灭活新生牛血清IOml即为 完全培养液。胰蛋白酶用D-hanks缓冲液配成0. 25%溶液后过滤除菌。
[0013] 准确称取锦灯笼宿萼皂苷20.0 mg于灭菌离心管中，加入DMSO 1ml，配成20 mg/ ml原液。取10 W原液加到IOml的完全培养液中，即成为20呢/ml应用液，再分别用完全 培养液稀释为l〇、5、2. 5和I. 25吒/ml的应用液。
[0014] 细胞培养及传代： 所有细胞均贴壁培养于含IOml完全培养液细胞培养瓶中，于37°C、5%C02、饱合湿度下 培养。细胞长满瓶底后用灭菌D-hanks液洗两次，加0. 25%胰蛋白酶消化细胞2分钟，倒掉 胰蛋白酶，待轻摇细胞能完全脱落后，加完全培养液30ml后，用移液管吹散细胞，分装于3 个新的细胞培养瓶中，继续培养。
[0015] 上述实验均在严格无菌条件下进行。
[0016] 结果测定：将对照用培养板取出于含细胞孔中轻轻加入25ul 50%预冷的三氯醋 酸溶液于培养液面上，静置5分钟后，在4°C冰箱放置1小时，弃去上层液体，用去离子水洗 5遍，置空气中干燥后留待与加药培养板一并染色分析。
[0017] 细胞加药培养48小时后，取出培养板，于每孔加入50ul预冷的50%三氯醋酸，静 置5分钟后移入4°C冰箱中静置1小时，取出用去离子水洗5遍，空气中干燥，待完全干燥 后每孔加入1%的乙酸配制的〇. 4%的SRB lOOul，染色20分钟后倒掉染液，用1%乙酸洗5 次，去除未结合的染料。空气中干燥后用pH 10. 5的lOmmol/L的非缓冲Tris碱液150ul 溶解，在平板振荡器上振荡5分钟，在BioRad酶标仪上测定各孔在490nm的光吸收。本底 对照板的细胞同样处理测定0D490。
[0018] 根据各孔0D490计算药物对细胞增殖的抑制率： 根据药物浓度对数与抑制率，用Microcal Origin软件作直线回归，得到直线方程，计 算抑制率在50%时对应的药物浓度即为锦灯笼宿萼皂苷对肿瘤细胞的半抑制浓度（IC5tlX
[0019] 于上述同样条件下测定每株细胞的IC5Q。
[0020] 实验结果表明，锦灯笼宿萼皂苷对多种人源肿瘤细胞株，包括：肝癌、肺癌、前列腺 癌、胃癌、卵巢癌细胞、前列腺癌、结肠癌、食管癌、神经胶质瘤等均有较强的抑制其增殖作 用，IC5tl 均小于 10Mg/ml。
[0021] 实验例2 :锦灯笼宿萼皂苷对体外肿瘤细胞的抑制作用 材料和试剂： 锦灯笼宿萼皂苷，按照制备例1制备。
[0022] 昆明种小鼠，体重18 - 22g，雄性；C57BL/6小鼠，体重18 - 22g，雄性。
[0023] S180肉瘤、H22肝癌、U14宫颈癌和Lewis肺癌瘤株，购自中国医学科学院北京药 物所。
[0024] 实验方法：S180肉瘤、H22肝癌和U14宫颈癌接种：取于昆明鼠腹腔内接种传代七 天的上述荷瘤小鼠，消毒腹部皮肤后，抽取腹水，加入三倍体积的注射用生理盐水稀释，消 毒昆明鼠腋下皮肤，每只小鼠于腋下注射瘤细胞悬液〇. 2 ml，各瘤株分别接种50只小鼠。
[0025] Lewis肺癌接种：取已接种10天的Lewis肺癌、生长状态良好的小鼠，脱颈处死， 用酒精消毒皮肤后，剥取肿瘤组织，加入五倍重量的生理盐水后用组织匀浆器研磨成匀浆， 100目灭菌不锈钢网过滤。消毒每只小鼠左侧腋皮肤，接种瘤液0.2ml。接种50只小鼠。
[0026] 接瘤后第二天随机分为5组，分别为模型组、环磷酰胺对照组（80mg/kg)、锦灯笼 宿萼皂苷高（50mg/kg)、锦灯笼宿萼皂苷中（5mg/kg体重）和锦灯笼宿萼皂苷低（0.5mg/ kg)组。环磷酰胺用生理盐水配成4mg/ml，锦灯笼宿萼皂苷用聚乙二醇做助溶剂，配成 2. 5、0. 25和0.025mg/ml，给药量0. 2ml/10g体重。环磷酰胺接瘤后第二天给药一次，锦 灯笼宿萼皂苷各组于接瘤后第二天给药，隔日一次，共5次。贝萼皂苷元末次给药后第三 天处死小鼠，剥取瘤组织称重。计算抑瘤率。
【主权项】
1. 锦灯笼宿萼皂苷在制备药物方面的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于锦灯笼宿萼皂苷在制备抗肿瘤药物方面的 应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，起特征在于锦灯笼宿萼皂苷在制备治疗抗肝癌、卵巢 癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、食管癌的药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供了以锦灯笼宿萼皂苷为活性成分的药物，其可单独与药用辅料或与其它药物联合制备成药物，本发明还提供了其在制备药物方面的应用，具体地提供了其在制备抗肿瘤药物方面的应用。
【IPC分类】A61P35-00, A61K36-81
【公开号】CN104740063
【申请号】CN201310725525
【发明人】黄映琪
【申请人】青岛百草汇中草药研究所
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2013年12月25日