与炎性肠病有关的抗原的制作方法
【专利说明】与炎性肠病有关的抗原 【技术领域】
[0001] 本发明是关于炎性肠病（inflammatory bowel disease，IBD)的治疗和检测。本 发明牵涉结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员的使用，特别是结合纤维连 接蛋白的结构域ED-A的特异性结合成员。该特异性结合成员可（例如）缀合至免疫抑制 性或抗炎性分子，例如白介素-10。
[0002] 【先前技术】
[0003] 炎性肠病（Inf lammatory Bowel Disease，IBD)是一群影响结肠与小肠的 炎性病况。IBD的主要类型为克罗恩氏病（Crohn' s disease，⑶）和溃疡性结肠炎 (ulcerative colitis，UC)。IBD致病机理的特征为造成和维持肠内慢性发炎状态的 不同血管发生性调节作用（Chidlow et al·，2006, Am J Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.，29, G5-G18)。克罗恩氏病可影响胃肠道的任何部分，而溃疡性结肠炎则通常受 限于结肠和直肠 （Summers RW，Elliott DE，Qadir K，Urban JF，Thompson R, Weinstock JV (2003) Am. J. Gastroentol.，98:2034-2041)。依据其严重性，溃疡性结肠炎的治疗可能需 要免疫抑制作用以控制其症状，且治疗经常牵涉施予抗炎性分子。
[0004] 已知IBD的特征为促炎细胞因子的上调，例如：IFN- γ、IL-6和IL-12 (如 IL-12p70)。例如已知克罗恩氏病与过量的IL-12/IL-23和IFN- γ /IL-17产生有关 (Strober et al. (2007), The Journal of Clinical Investigation, 117(3), 514-521)〇 亦已有克罗恩氏病活跃期间，IL_12p70与IL-23合成的报导$1188 6丨&1.2006，11^1&臟· Bowel Dis. 12:9-15)〇
[0005] 纤维连接蛋白（Fibronectin(FN))是一种醣蛋白，其在多种正常组织和体液中广 泛表达。其是胞外基质（extracellular matrix(ECM))的组分，并参与许多生物过程，包括 细胞附着、细胞迀移、止血、血栓形成、创伤愈合、组织分化和癌性转化。
[0006] 不同的FN同种型是藉由原始转录体FN前mRNA(pre-mRNA)的三个区域（ED-A、 ED-B、IIICS)的选择性剪接而产生，其是由细胞因子和胞外pH所调节的过程（Balza(1988) FEBS Lett. , 228, 42-44 ；Carnemolla(1989) J. Cell Biol.,106, 1139-1148 ；Borsi(1990) FEBS Lett. 261,175-178)。纤维连接蛋白含有两个III型球状外结构域（globular extra-domains)，其可进行选择性剪接：ED_A 和 ED-B (ffrench-Constant (1995) Exp. Cell Res.，22, 261-271，Kaspar et al. (2006) Int. J. cancer, 118, 1331-1339)。小鼠纤维连接蛋 白的ED-A和人纤维连接蛋白的ED-A的同一性为96. 7% (这两个90氨基酸的序列之间仅 有3个氨基酸不同）。
[0007] 经报导乳癌（Jacobs et al. (2002)Human Pathol, 33,29-38,Matsumoto et al. (1999) Jpn.J. Cancer Res. ,90,320-325)和肝癌（Oyama et al. (1989) JBC，264，10331-10334，Tavian et al. (1994) Int. J. Cancer, 56, 820-825)的肿瘤细胞和实 体肿瘤中在mRNA水平上有纤维连接蛋白ED-A的表达，而纤维肉瘤（fibrosarcoma)、横纹 肌肉瘤（rhabdomyosarcoma)和黑色素瘤在分离蛋白质水平上有纤维连接蛋白ED-A的表 达（Borsi et al. (1987) J. Cell Biol. ,104,595-560)。除了癌症，已报导类风湿性关节炎 有纤维连接蛋白的ED-A的表达（W02009/056268)。W02010/078950亦报导了纤维连接蛋白 的ED-A在子宫内膜异位、牛皮癣和牛皮癣性关节炎中的表达，然而组织化学分析显示在多 发性硬化症和溃疡性结肠炎中，ED-A的表达很弱至实际上无表达。Brenmoehl等人发表的 免疫组织化学分析（Int.J. Colorectal Dis. (2007)22:611-623)显示相较于对照组黏膜， ED-A表达在CD患者的发炎肠黏膜的表达降低，而在溃疡性结肠炎则升高。Brenmoehl等人 (2007)亦报导在CD患者的纤维性黏膜（fibrotic mucosa)中，ED-A和ED-B同种型的表达 升高。因为已知所述纤维连接蛋白同种型与创伤愈合相关，故可预期纤维性黏膜中有ED-A 和ED-B同种型表达。以⑶患者的发炎肠粘膜中ED-A表达较衍生自对照组患者的黏膜低， Brenmoehl等人（2007)并未提出⑶（活跃）期间ED-A发生表达。此文件中也没有公开结 合纤维连接蛋白的ED-A同种型的结合成员用于治疗或诊断IBD的用途。
[0008] 白介素-10 (IL-10)是一种抗炎性细胞因子，其功能为免疫系统的重要调控者。虽 然已知IL-10在免疫系统中具有许多不同的作用，其两种主要活性包括抑制巨噬细胞的细 胞因子产生，以及在T细胞活化期间抑制巨细胞的附属功能（Abbas A, Lichtman A, Pober J.,1994,Cellular and Molecular Immunology. 2nd Ed.Philadelphia:W. B. Saunders Company)。这些作用的效果使得IL-10在免疫系统中主要扮演抗炎性作用。IL-10最初 被称为细胞因子合成抑制因子（cytokine synthesis inhibiting factor(CSIF))，此 蛋白质的发现基于的是其生物活性（Delves P，Roitt I(eds)，1998, Encyclopedia of Immunology, 2nd Ed. San Diego:Academic Press)。因为其众所周知的抗炎性特性，IL-10 疗法被引入作为克罗恩氏病（CD)可能的新颖抗炎性治疗（Fedorak et al. ,Gastroenterol ogy (2000) 119, 1473-1482. ；Schreiber et al., Gastroenterology(2000) 119, 1461-1472 ； Colombel et al·, Gut (2001)49, 42-46)。
[0009] Asadullah 等人（Pharmacology Reviews, (2003), 55, 245-269)回顾 了数种 炎性疾病中白介素-10疗法的技术状况。在回顾慢性炎性肠病时，Asadullah等人报 导进行了许多大型多中心临床试验（multicenter trial)，以患有轻微/中度⑶或 治疗抗性CD的患者测试多个IL-10剂量，以及藉由全身性施予进行治疗性回肠或 回肠结肠切除术的患者，以预防内窥镜术后遗症（Fedorak et al. ,Gastroenterolo gy(2000) 119, 1473-1482. ；Schreiber et al. , Gastroenterology (2000) 119,1461-1472 ； Colombel et al.，Gut (2001) 49, 42-46.)。数据显示IL-10疗法是安全的且耐受性良好。然 而，与安慰剂治疗相较，IL-IO治疗并未造成显著较高的缓解率或临床改善。
[0010] 整体而言，临床结果并不让人满意，而Herfarth和Scholmerich则有许多关于此 治疗策略令人失望的讨论（Gut (2002) 50, 146-147)。
[0011] 因此，仍有对于多种IBD状态的有效治疗的需求。 【
【发明内容】
】
[0012] 本发明人意外发现，融合至IL-10的抗EDA抗体能够：⑴在IBD患病小鼠中体内 选择性定位至发炎结肠的位点，和（ii)降低IBD患病小鼠中某些促炎细胞因子的血清水 平，特别是干扰素 -γ、IL-6和IL_12p70。
[0013] 经由施予融合至IL-10的抗EDA抗体而下调促炎细胞因子特别令人意外，因为 Tilg等人（Gut (2002)，50, 191-195)报导以重组的人IL-10治疗克罗恩氏病患者会引发干 扰素-γ。Shibata 等人（J. Immunol·, (1998) 161,4283-4288)亦报导 IL-IO 增强了 NK 细 胞产生INF-γ，但抑制巨噬细胞产生诱导INF-γ的因子。
[0014] 于是，在第一方面中，本发明提供一种特异性结合成员（例如：抗体分子），其结合 纤维连接蛋白（A-FN)的外结构域-A(Extra Domain-A(ED-A))同种型，用于治疗IBD的方 法。本发明亦提供结合纤维连接蛋白的外结构域-A(ED-A)同种型的特异性结合成员（例 如：抗体分子），用于制造供治疗IBD的药物的用途。本发明亦提供一种治疗患者IBD的方 法，该方法包含施予患者治疗有效量的药物，其包含结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特 异性结合成员。优选地，该特异性结合成员结合人纤维连接蛋白的ED-A同种型。
[0015] 用于本发明的第一方面的特异性结合成员（例如：抗体分子），可结合纤维连接蛋 白的ED-A。
[0016] 用于本发明的第一方面的特异性结合成员（例如：抗体分子），可缀合至具有免疫 抑制性或抗炎性活性的分子、可检测标记、放射性同位素或生物活性分子，例如：细胞因子、 激素、治疗性放射性同位素、细胞毒性药物。该特异性结合成员可由可切割的连接子缀合至 该生物活性分子。
[0017] 在一个优选实施例中，该特异性结合成员（例如：抗体分子）被缀合至具有免疫抑 制性或抗炎性活性的分子，例如：IL_10。
[0018] IBD，如本文所称，可为活性IBD。具体而言，该IBD可为克罗恩氏病、溃疡性结肠 炎、胶原性结肠炎（collagenous colitis)、淋巴细胞性结肠炎（lymphocytic colitis)、 缺血性结肠炎（ischaemic colitis)、分流性结肠炎（diversion colitis)、贝赛特氏病 (Behget，S disease)或未定型结肠炎（indeterminate colitis)。该IBD 可为CD 或 UC0 该IBD可为CD、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、分流性结肠炎、贝赛特氏 病或未定型结肠炎。在一个实施方案中，该IBD不是UC。该IBD可为通常发炎作用不限于结 肠和直肠的IBD，例如：⑶。IBD可为不仅止影响结肠内膜的IBD。优选地该IBD是⑶。本文 所使用的术语CD、UC、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、分流性结肠炎、贝 赛特氏病和未定型结肠炎，可分别代表活性CD、活性UC、活性胶原性结肠炎、活性淋巴细胞 性结肠炎、活性缺血性结肠炎、活性分流性结肠炎、活性贝赛特氏病和活性未定型结肠炎。
[0019] 在第二方面中，本发明提供结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员 (例如：抗体分子），用于将缀合至该特异性结合成员的分子传递至IBD组织。本发明亦提 供结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合成员（例如：抗体分子），用于制造供将 缀合至该特异性结合成员的分子递送至IBD组织的药物。本发明亦提供一种将分子传递至 人或动物内IBD组织的方法，其中该分子被缀合至结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异 性结合成员以形成缀合物，该方法包含将该缀合物施予该人或动物。优选地，该特异性结合 成员结合人纤维连接蛋白的ED-A同种型。
[0020] 本发明的第二方面中使用的特异性结合成员（例如：抗体分子）可结合纤维连接 蛋白的ED-A。
[0021] 本发明的第二方面中使用的特异性结合成员（例如：抗体分子）可缀合至可检测 性标记、放射性同位素或生物活性分子，例如：细胞因子、激素、治疗性放射性同位素或细胞 毒性药物。该特异性结合成员可藉由可切割的连接子缀合至该生物活性分子。
[0022] 该特异性结合成员（例如：抗体分子）优选地缀合至IL-10。
[0023] 在第三方面中，本发明提供一种结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合 成员（例如：抗体分子）以用于诊断IBD的方法。本发明亦提供结合纤维连接蛋白的ED-A 同种型的特异性结合成员用于制造供诊断IBD的诊断产品的用途。本发明亦提供一种检测 或诊断人或动物中IBD的方法，其中该方法包含下列步骤：
[0024] (a)向该人或动物施予结合纤维连接蛋白的ED-A结构域的特异性结合成员，和
[0025] (b)测定该特异性结合成员存在或不存在于该人体或动物体中的IBD位置，其中 该特异性结合成员区域定位至IBD的位置代表1BD存在。
[0026] 优选地，该特异性结合成员结合人纤维连接蛋白的ED-A同种型。
[0027] 本发明的第三方面中使用的特异性结合成员（例如：抗体分子）可结合纤维连接 蛋白的ED-A。
[0028] 本发明的第三方面中使用的特异性结合成员（例如：抗体分子）可缀合至可检测 标记或放射性同位素。
[0029] 在第四方面中，本发明提供一种结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特异性结合 成员以用于对IBD组织成像的方法。本发明亦提供结合纤维连接蛋白的ED-A同种型的特 异性结合成员，用于制造供对IBD组织成像的成像剂的用途。本发明亦提供一种检测人或 动物中IBD组织或对其成像的方法，其中该方法包含下列步骤：
[0030] (a)向该人或动物施予结合纤维连接蛋白的ED-A结构域的特异性结合成员，和
[0031] (b)检测该特异性结合成员与人体或动物体内的IBD组织的结合。
[0032] 优选地，该特异性结合成员结合人纤维连接蛋白的ED-A同种型。
[0033] 本发明的第四方面中使用的特异性结合成员（例如：抗体分子）可结合纤维连接 蛋白的ED-A。
[0034] 本发明的第四方面中使用的特异性结合成员（例如：抗体分子）可缀合至可检测 标记或放射性同位素。
[0035] 在第五方面中，本发明提供一种缀合物，其包含缀合至IL-10的结合纤维连接蛋 白的ED-A同种型（例如：ED-A)的结合成员，其中该缀合物具有如SEQ ID NO: 13所示的序 列。此缀合物在本文中称为F8-IL10。因为此缀合物的VH和VL结构域是藉由5个氨基酸 的连接子连接（参见图1B)，预期该缀合物在溶液中形成非共价性同型二聚体。
[0036] 本发明使用的特异性结合成员可为结合纤维连接蛋白的ED-A同种型和/或纤维 连接蛋白的ED-A的抗体分子，其中该抗体包含本文所述的F8抗体的一个或多个互补决定 区（CDR)。所述序列提供于下文（参见SEQ ID NO: 1-6)。F8抗体的CDR序列亦显示于图 1〇
[0037] 本发明使用的特异性结合成员可包含一个或多个本文所述的CDR(例如：CDR3)， 且任选地包含⑶Rl和⑶R2,以形成一组⑶R。
[0038] 优选地，本发明使用的特异性结合成员包含一组本文所述的F8抗体的H和/或L 抗体CDR，在所公开的H和/或L CDR组中带有十个或更少（例如：一个、二个、三个、四个 或五个）氨基酸取代。
[0039] 取代作用可能在该组⑶R中的任何残基发生，且可在⑶Rl、⑶R2和/或⑶R3中。 [0040] 本发明使用的特异性结合成员可包含抗体分子，例如：人抗体分子。该特异性结 合成员通常包含抗体VH和/或VL结构域。特异性结合成员的VH结构域亦提供用于本发 明中。各VH和VL结构域中包含互补决定区（⑶R)和构架区域（FR)。VH结构域包含一组 HCDRs，而VL结构域包含一组IXDR。抗体分子可包含抗体VH结构域，其包含VH⑶R1、⑶R2 和⑶R3与构架。其可替代性或同时包含抗体VL结构域，其包含VL⑶R1、⑶R2和⑶R3与 构架。所有本文所公开的VH和VL序列、⑶R序列、⑶R组和HCDR组与IXDR组，均代表本发 明使用的特异性结合成员的实施方式。如本文所述，"一组⑶R"包含⑶R1、⑶R2和⑶R3。 因此，一组 HCDR 代表 HCDR1、HCDR2 和 HCDR3,而一组 LCDR 代表 LCDR1、LCDR2 和 LCDR3。除 非另有指明，"一组⑶R"包括HCDR和IXDR。
[0041] 本发明使用的特异性结合成员可包含抗体VH结构域，其包含互补决定区HCDR1、 HCDR2和HCDR3与构架，其中HCDRl是SEQ ID ΝΟ:1，且其中任选的HCDR2是SEQ ID NO:2 和 / 或 HCDR3 是 SEQ ID NO:3。
[0042] -般而言，VH结构域与VL结构域配对以提供抗体抗原结合位点，虽然如下文的进 一步论述，VH或VL结构域单独可能用来结合抗原。因此，本发明使用的特异性结合成员可 进一步包含抗体VL结构域，其包含互补决定区IXDRl、IXDR2和IXDR3与构架，其中IXDRl 是SEQIDNO:4，且其中任选地LCDR2是SEQIDNO:5和/或LCDR3是SEQIDNO:6。
[0043] 本发明使用的特异性结合成员优选地可包含纤维连接蛋白的ED-A的抗体分子， 其中该抗体分子包含VH结构域和VL结构域，其中该VH结构域包含构架和一组互补决定区 HCDR1、HCDR2和HCDR3,且其中该