猪流感血球凝集素与神经氨酸酶变体的制作方法_2

文档序号:8459898阅读:来源:国知局
酰胺,或氨基酸残基位置 241可以是缬氨酸并且氨基酸残基位置369可以是天冬酰胺,或氨基酸残基位置222可以 是天冬酰胺、氨基酸残基位置241可以是缬氨酸并且氨基酸残基位置369可以是天冬酰胺。 如果具有对包括SEQ ID N0:4的氨基酸序列的血球凝集素多肽进行编码的基因组区段的该 重配流感病毒是6:1:1重配流感病毒,则它可以进一步具有对包括SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:7的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽进行编码的基因组区段。
[0039] 如果该重配流感病毒是6:2重配流感病毒,其中编码血球凝集素多肽的该基因组 区段包括SEQ ID N0:4的氨基酸序列并且编码神经氨酸酶多肽的该基因组区段包括如示 于SEQ ID N0:8中的氨基酸序列,则编码血球凝集素多肽的该基因组区段可以包括SEQ ID N〇:4,其中氨基酸残基位置125是天冬氨酸并且氨基酸残基位置127是谷氨酸,并且其中 编码SEQ ID N0:8的神经氨酸酶多肽的该基因组区段可以在氨基酸位置222处包括天冬酰 胺、在氨基酸残基位置241处包括缬氨酸并且在氨基酸残基位置369处包括天冬酰胺。可 替代地,编码血球凝集素多肽的该基因组区段可以包括SEQ ID N0:4,其中氨基酸残基位置 125是天冬氨酸并且氨基酸残基位置127是谷氨酸并且编码SEQ ID N0:8的神经氨酸酶多 肽的该基因组区段可以在氨基酸位置369处包括天冬酰胺。
[0040] 在这些重配流感病毒(例如,7:1、6:2、6:1:1)的任一个中,这六个内部基因组 区段可以属于一种或多种病毒中的任一种(包括供体病毒)。供体病毒为本领域的普通 技术人员所通常理解的。供体病毒的实例包括甲型/安阿伯/6/60(A/Ann Arbor/6/60) 或乙型/安阿伯/1/66、甲型/波多黎各/8/34(A/Puerto Rico/8/34)、乙型/列宁格勒 /14/17/55(B/Leningrad/14/17/55)、乙型 /14/5/1、乙型 /USSR/60/69、乙型 / 列宁格勒 /179/86、乙型 / 列宁格勒 /14/55 或乙型 / 英格兰 /2608/76 (B/England/2608/76)。如果 这六个内部基因组区段属于一种单个供体病毒,则该供体病毒可以是甲型/安阿伯/6/60 或乙型/安阿伯/1/66、甲型/波多黎各/8/34、乙型/列宁格勒/14/17/55、乙型/14/5/1、 乙型/USSR/60/69、乙型/列宁格勒/179/86、乙型/列宁格勒/14/55或乙型/英格兰 /2608/76
[0041] 这些重配病毒中的任一个可以处于免疫原性组合物中。免疫原性组合物可以是能 够增强个体对抗原的免疫应答的组合物,即包括含有如示于SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3或 SEQ ID N0:4中的氨基酸序列的全部或一部分的血球凝集素多肽的流感病毒或包括含有如 示于SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO:8中的氨基酸序列的全部或一部分的神经氨 酸酶多肽的流感病毒。可以例如通过测量中和分泌抗体和/或血清抗体的水平或量来监测 免疫原性。免疫原性组合物可以能够诱导保护性免疫应答。如果该免疫原性组合物诱导保 护性免疫应答,则它可以预防或减少由被以下项感染导致的症状:包括含有如示于SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4中的氨基酸序列的全部或一部分的血球凝集素多肽的 野生型流感病毒,或包括含有如示于SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7或SEQ ID N0:8中的氨基 酸序列的全部或一部分的神经氨酸酶多肽的流感病毒。
[0042] 该免疫原性组合物中的重配流感病毒可以是灭活的。可以通过使用例如甲醛和/ 或b-丙内酯灭活流感病毒。可替代地,该免疫原性组合物中的重配流感病毒可以是减毒 活的。这种减毒活重配流感病毒将展现出这样的特征,如例如冷适应、减毒或温度敏感性。 如应用于病毒的术语"温度敏感的"、"冷适应的"和"减毒的"是本领域已知的。例如,术语 "温度敏感的(ts)"指示例如,相对于甲型流感株在33°C下,病毒在39°C下展现出100倍或 更大的滴度减少,或相对于乙型流感株在33°C下,该病毒在37°C下展现出100倍或更大的 滴度减少。术语"冷适应的(ca) "指示该病毒在25°C下展现出它在33°C下的生长的100倍 内的生长,而术语"减毒的(att)"指示该病毒在白鼬(ferret)的上呼吸道中复制但是在其 肺组织中不可检出并且在动物中不导致流感样疾病。应该理解的是,具有中间表型的病毒 也适于结合在此的HA和NA序列制备6:2或6:1:1或7:1重配流感病毒,这些具有中间表 型的病毒即在39°C (对于甲型病毒株)或37°C (对于乙型病毒株)下展现出小于100倍 的滴度减少的病毒,或在25°C下展现出比它在33°C下的生长超过100倍的生长(例如,200 倍、500倍、1000倍、小于10, 000倍内)的病毒,和/或相对于在白鼬的上呼吸道中的生长 在肺中展现出减少的生长(即,部分减毒的)和/或在动物中展现出减少的流感样疾病的 病毒。
[0043] 痔苗
[0044] 流感疫苗的实例是FLUMIST (米迪缪尼有限公司(Medlmmune,LLC)),它是一 种保护儿童和成人免受流感疾病的减毒活疫苗(贝尔奇(Belshe)等人1998新英格兰 医学杂志(N Engl J Med)338:1405-12;尼科尔(Nichol)等人1999美国医学会杂志 (JAMA)282:137-44)。
[0045] FLUMIST疫苗株包含例如来源于该疫苗针对的野生型株(或,在一些情况下,针对 相关株)的HA和NA基因区段连同六个来自常见的主供体病毒(MDV)的基因区段PB1、PB2、 PA、NP、M以及NS。因此,在此的HA和NA序列可以被包括在各种FLUMIST配制品中。通过 将野生型甲型/安阿伯/6/60 (A/AA/6/60)株在相继较低的温度下于原代鸡肾组织培养中 连续传代而产生FLUMIST的甲型流感株的MDV (MDV-A)(马斯萨博(Maassab) 1967流感病毒 在 25°C下的适应与生长特征(Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C)自然(Nature) 213:612-4)。MDV-A 在 25°C下(ca,冷适应)高效 复制,但是其生长在38°C和39°C下受到抑制(ts,温度敏感的)。另外,此病毒在受感染的 白鼬的肺中不复制(att,减毒)。相信ts表型通过限制该疫苗在除了呼吸道的最凉部位以 外的所有部位的复制而有助于该疫苗在人类中的减毒。
[0046] 疫苗的其他实例包括灭活疫苗FLUZ0NE? (赛诺菲巴斯德公司(Sanofi Pasteur))、FLUVIRIN(诺华疫苗公司(Novartis Vaccines))、FLUARIX? (葛兰素史 克公司(GlaxoSmithKline))、FLULAVAL(魁北克的 ID 生物医药公司(ID Biomedical Corporation of Quebec) )、AFLURIA(商杰特生物医疗公司(CSL Biotherapies))。这些疫 苗产生自包含HA和NA序列(如在此披露的那些)和第二(例如,PR8)流感病毒的六个内 部基因组区段的流感病毒。灭活的流感疫苗可以处于裂解病毒或全病毒形式。典型地,灭 活的流感疫苗处于裂解病毒形式。
[0047] 可以将疫苗配制为包括一种或多种用于增强对流感抗原的免疫应答的佐剂。适合 的佐剂包括:完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、皂苷、矿物凝胶(例如氢氧化铝)、表面活性 物质(例如溶血卵磷脂)、普鲁兰尼克多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳液、卡介苗(BCG)jg 小棒状杆菌以及合成佐剂QS-21、AS03和MF59。
[0048] 还可以用一种或多种免疫刺激分子配制疫苗或与其结合而递送。免疫刺激分子 包括具有免疫刺激、免疫增强和促炎症活性的各种细胞因子、淋巴因子以及趋化因子,如 白介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13);生长因子(例如,粒细胞-巨噬细 胞(GM)-集落刺激因子(CSF));以及其他免疫刺激分子,如巨噬细胞炎症因子、Flt3配体、 B7. I ;B7. 2 等。
[0049] 可以将在此描述的重组和重配病毒、免疫原性组合物和疫苗以免疫有效量并且在 适当的载体或赋形剂中预防地给予,以刺激特异性针对一种或多种如通过HA和/或NA序 列确定的流感病毒株的免疫应答。典型地,该载体或赋形剂是药学上可接受的载体或赋形 剂,如无菌水、盐水溶液、缓冲盐水溶液、右旋糖水溶液、甘油水溶液、乙醇、来自未感染的鸡 蛋的尿囊液(即,标准尿囊液或NAF)或其组合。根据本领域已确立的方案制备保证无菌度、 pH、等渗性以及稳定性的此类溶液。通常,选择载体或赋形剂,以使得过敏以及其他不良效 应最小化,并且以便适合具体的给药途径,例如皮下、肌内、鼻内等。
[0050] 应该以足以刺激特异性针对一种或多种流感病毒株(即,对抗在此描述的HA和/ 或NA流感抗原)的免疫应答的量给予免疫有效量的重组和重配病毒、免疫原性组合物或疫 苗。用于诱发针对一种或多种流感株的保护性免疫应答的剂量和方法是本领域的普通技 术人员已知的。参见例如USPN5, 922, 326;赖特(Wright)等人,1982感染与免疫(Infect. Immun. )37:397-400;金姆(Kim)等人,1973 儿科学(Pediatrics)52:56-63;以及赖特等 人,1976儿科学杂志(J. Pediatr.) 88:931-936。例如,在约I-1000 HID5q (人类感染剂量)的 范围内提供流感病毒,即每个给予的剂量约IO5-IO8Pfu (噬斑形成单位)。典型地,将基于例 如年龄、身体状况、体重、性别、饮食、给药时间以及其他临床因素在此范围内调节剂量。可 以例如使用针头和注射器或无针注射装置通过皮下或肌内注射而全身性给予疫苗配制品。 可替代地,可以通过滴剂、大颗粒气雾剂(大于约10微米)鼻内给予疫苗配制品或喷雾进 上呼吸道中。对于鼻内给药,减毒活病毒疫苗通常是优选的,例如减毒的、冷适应的和/或 温度敏感的重组或重配流感病毒。参见上文。虽然用单次剂量刺激保护性免疫应答是优选 的,但是可以通过相同或不同途径给予另外的剂量,以达到希望的预防效果。
[0051] 虽然用单次剂量刺激保护性免疫应答是优选的,但是可以通过相同或不同途径给 予另外的剂量,以达到希望的预防效果。在新生儿和婴儿中,例如,可能需要多次给予,以诱 发足够水平的免疫力。必要时,可以在整个童年时期每隔一段时间连续给药,以维持足够 水平的对抗野生型流感感染的保护。类似地,对特别易受反复或严重流感感染影响的成人 (例如像医护人员、日托人员、幼儿的家庭成员、老年人以及具有受损的心肺功能的个体) 可能需要多次免疫,以建立和/或维持保护性免疫应答。可以例如通过测量中和分泌抗体 和血清抗体的量监测诱导的免疫力水平,并且必要时,调节剂量或重复疫苗接种,以诱发和 维持希望的保护水平。
[0052] 除了包括对含有SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的全部 或一部分的血球凝集素多肽和/或含有SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO:8的氨基 酸序列的全部或一部分的神经氨酸酶多肽进行编码的基因组区段的流感病毒之外,该疫苗 还可以包括超过一种重组和/或重配流感病毒,即一种或多种流感病毒。该疫苗可以是另 外包括具有H3HA抗原的重组甲型流感病毒和具有山县(Yamagata)或维多利亚(Victoria) 株HA抗原的重组乙型流感病毒的三价疫苗。该疫苗可以是四价疫苗。如果该疫苗是四价 疫苗,则它可以另外包括具有HA3HA抗原的重组甲型流感病毒、具有山县株HA抗原的重组 乙型流感病毒、以及具有维多利亚株HA抗原的重组乙型流感病毒。
[0053]制各流感病毒的方法
[0054]可以通过多种本领域熟知的方法容易地获得重组或重配流感病毒。在一种方法 中,将一个或多个载体引入能够支持流感病毒的复制的宿主细胞群体中。该一个或多个载 体包括对应于第一流感株的至少六个内部基因组区段的核苷酸序列以及产生包括SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的氨基酸序列的血球凝集素多肽的第一基因组区段。
[0055] 如果该第一基因组区段产生包括SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的血球凝集素多肽, 则它在氨基酸残基位置125处可以具有天冬氨酸,或在氨基酸残基位置127处可以具有谷 氨酸残基,或在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸,或在氨基酸残基位置125处可以具 有天冬氨酸并且在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸,或在氨基酸残基位置125处可 以具有天冬氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸,或在氨基酸残基位置127 处可以具有谷氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸,或在氨基酸残基位置 125处可以具有天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸并且在氨基酸残基位 置209处可以具有谷氨酸。此外,还可以引入对应于产生神经氨酸酶多肽的第二基因组区 段的核苷酸序列。该第二基因组区段可以产生包括SEQ ID N0:5的氨基酸序列的神经氨酸 酶多肽。
[0056] 如果该第一基因组区段产生包括SEQIDNO:3的氨基酸序列的血球凝集素多肽, 则它在氨基酸残基位置124处可以具有亮氨酸,或在氨基酸残基位置125处可以具有天冬 氨酸,或在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸,或在氨基酸残基位置209处可以具有谷 氨酸,或在氨基酸残基位置124处可以具有亮氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有 谷氨酸,或在氨基酸残基位置125处可以具有天冬氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以 具有谷氨酸,或在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸并且在氨基酸残基位置209处可 以具有谷氨酸,或在氨基酸残基位置124处可以具有亮氨酸、在氨基酸残基位置127处可以 具有谷氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸,或在氨基酸残基位置125处可 以具有天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸并且在氨基酸残基位置209处 可以具有谷氨酸。此外,可以引入对应于产生神经氨酸酶多肽的第二基因组区段的核苷酸 序列。该第二基因组区段可以产生包括SEQIDNO:6的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽。
[0057] 如果该第一基因组区段产生包括SEQIDN0:4的氨基酸序列的血球凝集素多肽, 则它在氨基酸残基位置125处可以具有天冬氨酸,或在氨基酸残基位置127处可以具有谷 氨酸残基,或在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸,或在氨基酸残基位置125处可以具 有天冬氨酸并且在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸,或在氨基酸残基位置125处可 以具有天冬氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸,或在氨基酸残基位置127 处可以具有谷氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸,或在氨基酸残基位置 125处可以具有天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸并且在氨基酸残基位 置209处可以具有谷氨酸。此外,可以引入对应于产生神经氨酸酶多肽的第二基因组区段 的核苷酸序列。该第二基因组区段可以产生包括SEQIDNO:5或SEQIDNO:7或SEQID NO:8的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽。如果该第二基因组区段产生包括SEQIDNO:8的氨 基酸序列的神经氨酸酶多肽,则氨基酸残基位置222可以是天冬酰胺,或氨基酸残基位置 241可以是缬氨酸,或氨基酸残基位置369可以是天冬酰胺,或氨基酸残基位置222可以是 天冬酰胺并且氨基酸残基位置369可以是天冬酰胺,或氨基酸残基位置241可以是缬氨酸 并且氨基酸残基位置369可以是天冬酰胺,或氨基酸残基位置222可以是天冬酰胺、氨基酸 残基位置241可以是缬氨酸并且氨基酸残基位置369可以是天冬酰胺。
[0058] 对应于第一流感株的至少6个内部基因组区段的核苷酸序列可以属于为掺入进 流感疫苗或为科学研宄或开发目的提供有用特性的任何流感株。第一流感株的令人希望的 性状可以是减弱的致病性或表型、冷适应、温度敏感性。第一流感株的实例包括甲型/安阿 伯/6/60或乙型/安阿伯/1/66、甲型/波多黎各/8/34、乙型/列宁格勒/14/17/55、乙型 /14/5/1、乙型/USSR/60/69、乙型/列宁格勒/179/86、乙型/列宁格勒/14/55或乙型/英 格兰 /2608/76。
[0059]用于产生流感病毒的载体可以是例如提供在细菌和真核细胞中具有功能的 一个或多个复制起点、以及任选地便于对包括质粒序列的细胞进行筛选或选择的标记 物的质粒载体。参见例如,诺伊曼(Neumann)等人,1999,美国国家科学院院刊(PNAS. USA)96:9345-9350。
[0060] 这些载体可以是能够在任一方向上启动来自插入的cDNA的病毒基因组区段的转 录,也就是说,给出(+)链和(-)链病毒RNA分子两者的双向表达载体。为了实现双向转 录,可以将这些病毒基因组区段中的每个区段插入具有至少两个独立的启动子的表达载体 中,这样使得由第一 RNA聚合酶启动子(例如,RNA pol I启动子)从一条链转录病毒基因 组RNA的拷贝,并且从第二RNA聚合酶启动子(例如,RNA Pol II启动子)合成病毒mRNA。 因此,可以将这两个启动子按相反方向安排为在至少一个适于插入病毒基因组RNA区段的 克隆位点(即,限制性内切酶识别序列)(优选独特的克隆位点)的侧翼。可替代地,可以 利用"双义"表达载体,其中从该载体的同一条链转录(+)链mRNA和(-)链病毒RNA(作为 cRNA)〇
[0061] 可替代地,这些载体可以是单向表达载体,其中将病毒cDNA插入在pol I启动子 与终止序列之间(内部转录单位)。此内部转录单位的侧翼是RNA聚合酶II (pol II)启动 子和聚腺苷酸化位点(外部转录单位)。在该单向系统中,pol I和pol II启动子在cDNA 的上游并且产生正义未加帽cRNA(来自pol I启动子)和正义加帽mRNA(来自pol II启动 子)。参见例如,霍夫曼(Hoffmann)和韦伯斯特(Webster),2000,普通病毒学杂志(J. Gen. Virol.)81:2843-2847。
[0062] 在其他系统中,由pol I和pol II启动子转录的病毒序列可以从不同的表达载体 转录。在这些实施例中,可以使用在pol I启动子的控制下编码各个病毒基因组区段的载 体("VRNA表达载体")和在pol II启动子的控制下编码一种或多种病毒多肽(例如,流 感PA、PB1、PB2以及NP多肽)的载体("蛋白质表达载体")。
[0063] 可以通过本领域已知的任何方法或技术引入包括这些核苷酸序列的一个或多个 载体。例如,可以通过电穿孔、显微注射和基因枪引入载体。还参见例如,勒夫勒(Loeffler) 和贝尔(Behr),1993,酶学方法(Meth. Enzymol) ,217:599-618;科恩(Cohen)等人,1993, 酶学方法,217:618-644 ;临床药理学与治疗学(Clin. Pharma. Ther) ,29:69-92(1985), 萨姆布鲁克(Sambrook)等人,分子克隆:实验手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第2版,冷泉港实验室,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约,1989以及奥苏贝 尔(Ausubel)等人,编著当代分子生物学实验手册(Current Protocols in Molecular Biology),纽约约翰威利父子公司(John Wiley & Sons, Inc.,N.Y.),纽约(1987-2001)。
[0064] 还可以利用脂质或脂质体引入包括该核苷酸序列的一个或多个载体。脂质或 脂质体包括结合至DNA或RNA的脂肪颗粒或脂质的混合物,以提供疏水性的包衣递送 运载体。适合的脂质体可以包括常规合成的或天然的磷脂脂质体材料中的任一种,包 括来自天然来源(如卵、植物或动物来源)的磷脂,如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂 酰甘油、鞘磷脂、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰肌醇。也可以使用合成的磷脂,例如二肉豆蔻酰 磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine)、二油酰磷脂酰胆碱 (dioleoylphosphatidycholine)以及对应的合成的磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油。可以与 载体轭合的脂质或脂质体对于技术人员来说也是可商购的。本领域的普通技术人员已知 的可商购的脂质或脂质体转染试剂的实例包括LIP0FECTAMINE (英杰公司(Invitrogen))、 GENEJUICE(Novagen 公司)、GENEJAMMER? (Stratagene 公司)、FUGENE HD(罗氏 公司(Roche))、MEGAFECTIN(Qbiogene 公司)、SUPERFECT(凯杰公司(Qiagen))以及 EFFECTENE (凯杰公司)。
[0065] 此外,可以通过形成压实的多核苷酸复合体或纳米球引入包括该核苷酸序列 的一个或多个载体。压实的多核苷酸复合体描述于美国专利5, 972, 901、6, 008, 336和 6, 077, 835中。纳米球描述于美国专利号5, 718, 905和6, 207, 195中。复合了核酸的这些 压实的多核苷酸复合体和纳米球利用聚合阳离子。典型的聚合阳离子包括明胶、聚-L-赖 氨酸和壳聚糖。可替代地,该载体的多核苷酸可以与DEAE-右旋糖酐复合,或可以使用如磷 酸钙共沉淀或氯化钙共沉淀等技术进行转染。引入包括该核苷酸序列的一个或多个载体可 以使得或可以不使得该核苷酸序列被掺入宿主细胞的染色体中。
[0066] 该一个或多个载体被引入其中的宿主细胞群体是能够支持流感病毒的复制的任 何群体。这些宿主细胞中的许多是本领域的普通技术人员已知的并且包括MDCK细胞、BHK 细胞、PCK细胞、MDBK细胞、COS细胞、Vero非洲绿猴肾细胞;PERC. 6细胞(来源于使用重组 DNA技术永生化的单个的人类视网膜衍生的细胞);来源于鸡
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