Cheng)等人1994自然 (Nature) 369:684以及其中的参考文献中。
[0086] 可以在将氨基酸取代引入血球凝集素和/或神经氨酸酶多肽中的操纵技术中 使用的多核苷酸可以是例如可以利用各种固相策略合成的寡核苷酸，这些固相策略包 括单核苷酸基的和/或三核苷酸基的亚磷酰胺偶联化学。例如，可以通过向延伸的多 核苷酸链顺序添加活化的单体和/或三聚体来合成核酸序列。参见例如，卡拉瑟斯， 1\111.(〇31'111:116^，]\111.)等人1992酶学方法（]^1:11￡112：71]1〇1)211:3。寡核苷酸也可以订购自 多种商业来源中的任何来源，例如米德兰注册试剂公司（TheMidlandCertifiedReagent Company)(米德兰，德克萨斯州）、大美国吉恩公司（The Great American Gene Company) (盐湖城，犹他州）、ExpressGen公司（芝加哥，伊利诺伊州）、操纵子技术公司（Operon Technologies, Inc.)(亨茨维尔，阿拉巴马州）以及许多其他来源。
[0087] 血球凝集素中的氨基酸位置是基于Hl编号。神经氨酸酶中的氨基酸位置是基于 Nl编号。血球凝集素和神经氨酸酶两者的氨基酸编号方案都为本领域的普通技术人员所熟 知。基于Hl氨基酸残基的位置知识，本领域的普通技术人员应该能够容易地确定H1-H16 甲型流感血球凝集素多肽中的任一个中的某一氨基酸残基的位置。同样地，基于Nl氨基酸 残基的位置知识，本领域的普通技术人员应该能够容易地确定任何甲型流感N1-N9神经氨 酸酶多肽中的某一氨基酸残基的位置。其中的一个或多个血球凝集素氨基酸残基被改变的 甲型流感病毒可以是Hl、H2、H3、H5、H6、H7或H9甲型流感病毒。
[0088] 金肽
[0089] 血球凝集素多肽包括如示于SEQ ID NO: 1、3和4中的多肽的全部或任何部分。如 果该血球凝集素多肽包括如示于SEQ ID NO: 1中的氨基酸序列的全部或一部分，则它在氨 基酸残基位置125处可以具有天冬氨酸，或在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸残基， 或在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸，或在氨基酸残基位置125处可以具有天冬氨 酸并且在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸，或在氨基酸残基位置125处可以具有天 冬氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸，或在氨基酸残基位置127处可以具 有谷氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸，或在氨基酸残基位置125处可以 具有天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸并且在氨基酸残基位置209处可 以具有谷氨酸。该血球凝集素多肽可以与在其天然发生的环境中通常伴随它或与它相互作 用的组分分离或基本上不含这些组分。
[0090] 如果该血球凝集素多肽包括如示于SEQ ID N0:3中的氨基酸序列的全部或一部 分，则它在氨基酸残基位置124处可以具有亮氨酸，或在氨基酸残基位置125处可以具有天 冬氨酸，或在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸，或在氨基酸残基位置209处可以具有 谷氨酸，或在氨基酸残基位置124处可以具有亮氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具 有谷氨酸，或在氨基酸残基位置125处可以具有天冬氨酸并且在氨基酸残基位置209处可 以具有谷氨酸，或在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸并且在氨基酸残基位置209处 可以具有谷氨酸，或在氨基酸残基位置124处可以具有亮氨酸、在氨基酸残基位置127处可 以具有谷氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸，或在氨基酸残基位置125处 可以具有天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸并且在氨基酸残基位置209 处可以具有谷氨酸。该血球凝集素多肽可以与在其天然发生的环境中通常伴随它或与它相 互作用的组分分离或基本上不含这些组分。
[0091] 如果该血球凝集素多肽包括如示于SEQ ID N0:4中的氨基酸序列的全部或一部 分，则它在氨基酸残基位置125处可以具有天冬氨酸，或在氨基酸残基位置127处可以具有 谷氨酸残基，或在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸，或在氨基酸残基位置125处可 以具有天冬氨酸并且在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸，或在氨基酸残基位置125 处可以具有天冬氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸，或在氨基酸残基位置 127处可以具有谷氨酸并且在氨基酸残基位置209处可以具有谷氨酸，或在氨基酸残基位 置125处可以具有天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处可以具有谷氨酸并且在氨基酸残基 位置209处可以具有谷氨酸。该血球凝集素多肽可以与在其天然发生的环境中通常伴随它 或与它相互作用的组分分离或基本上不含这些组分。
[0092] 神经氨酸酶多肽包括如示于SEQ ID NO:5-8中的多肽的全部或任何部分。如果该 神经氨酸酶多肽包括如示于SEQ ID N0:8中的氨基酸序列的全部或一部分，则氨基酸残基 位置222可以是天冬酰胺，或氨基酸残基位置241可以是缬氨酸，或氨基酸残基位置369可 以是天冬酰胺，或氨基酸残基位置222可以是天冬酰胺并且氨基酸残基位置369可以是天 冬酰胺，或氨基酸残基位置241可以是缬氨酸并且氨基酸残基位置369可以是天冬酰胺，或 氨基酸残基位置222可以是天冬酰胺、氨基酸残基位置241可以是缬氨酸并且氨基酸残基 位置369可以是天冬酰胺。该神经氨酸酶多肽可以与在其天然发生的环境中通常伴随它或 与它相互作用的组分分离或基本上不含这些组分。
[0093] 可以通过转导适合的宿主细胞系或细胞株并且使宿主细胞生长至适当的细胞密 度并且将这些细胞培养一段另外的时间来产生这些多肽。然后，可以从培养基中回收表达 的多肽（例如，HA和/或NA多肽）。可替代地，可以通过离心收获宿主细胞，通过物理或化 学手段加以破坏，并且将所得粗提物保留用于进一步纯化。可以将真核或微生物细胞用于 表达蛋白质并且然后可以通过任何便利的方法加以破坏，包括冻融循环、超声处理、机械破 坏、或使用细胞裂解剂，或本领域的普通技术人员熟知的其他方法。
[0094] 可以通过本领域中熟知的多种方法中的任一种从重组细胞培养物中回收并纯化 表达的多肽，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换层析法、磷酸 纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲和层析（例如，使用本领域的普通技术人员已知的任 何标记系统）、羟基磷灰石层析、以及凝集素层析。如所希望的，可以将蛋白质重折叠步骤用 于完成成熟蛋白的构型中。并且，可以在最终的纯化步骤中利用高效液相层析（HPLC)。除 在此提及的参考文献之外，多种纯化方法在本领域中也是熟知的，包括例如以下各项中陈 述的那些：萨恩丹娜（Sandana) (1997)蛋白质的生物分离（Bioseparation of Proteins)， 学术出版公司；和博拉格（Bollag)等人（1996)蛋白质方法（Protein Methods)，第2版威 利-利斯公司（Wiley-Liss)，纽约；沃克（Walker) (1996)蛋白质方案手册（The Protein Protocols Handbook)胡玛纳出版社（Humana Press)，新泽西州，哈里斯（Harris)和安格 拉（Angal) (1990)蛋白质纯化应用：实用方法（Protein Purification Applications:A Practical Approach)牛津的IRL出版社，牛津，英格兰；哈里斯和安格拉蛋白质纯化方 法：实用方法（Protein Purification Methods:A Practical Approach)牛津的 IRL 出版社，牛津，英格兰；斯科普斯（Scopes) (1993)蛋白质纯化：原理与实践（Protein Purification:Principles and Practice)第 3 版施普林格公司（Springer Verlag)， 纽约；詹森（Janson)和赖登（Ryden) (1998)蛋白质纯化：原理，高分辨率方法与应用 (Protein Purification:Principles, High Resolution Methods and Applications)，第 二版威利-VCH公司（Wiley-VCH)，纽约；以及沃克（1998)CD-R0M上的蛋白质方案（Protein Protocols on⑶-ROM)胡玛纳出版社，新泽西州。
[0095] 这些多肽可以单独地在组合物中或与其他多肽组合。如果这种多肽或这些多 肽在适于给药的组合物中，则它们可以与处于例如冻干粉、浆液、水溶液、洗液或悬浮液 形式的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂一起配制（参加例如，哈德曼（Hardman) 等人，（2001)古德曼和吉尔曼的治疗学的药理学基础（Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics)，麦格劳希尔公司（McGraw-Hill)，纽约 (N.Y.);热纳罗（Gennaro) (2000)雷明顿：药学科学与实践（Remington:The Science and Practice of Pharmacy)，利平科特，威廉姆斯和威尔金斯公司（Lippincott, Williams, and Wilkins)，纽约（N. Y.);阿维斯（Avis)等人（编辑）（1993)药物剂型：胃肠外药剂 (Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications)，马塞尔?德克尔公司（Marcel Dekker)，纽约；利伯曼（Lieberman)等人（编辑）（1990)药物剂型：片剂（Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets)，马塞尔?德克尔公司，纽约；利伯曼等人（编辑）（1990)药物剂 型：分散体系（Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems)，马塞尔?德克尔公司， 纽约；魏纳（Weiner)和科特克斯基（Kotkoskie) (2000)赋形剂毒性与安全性（Excipient Toxicity and Safety)，马塞尔?德克尔公司，纽约（N.Y.)) 〇
[0096] 如果这些多肽处于组合形式，则该组合可以包括一种、两种、三种、四种、五种、六 种或更多种血球凝集素和/或神经氨酸酶多肽。该组合物可以包括包含SEQ ID NO: 1的氨 基酸序列的血球凝集素多肽与包含SEQ ID N0:5的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽。该组 合可以包括在氨基酸残基位置125处具有天冬氨酸的SEQ ID NO: 1以及具有SEQ ID NO:5 的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽，或可以包括在氨基酸残基位置127处具有谷氨酸残基的 SEQ ID N0:1以及具有SEQ ID N0:5的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽，或可以包括在氨基 酸残基位置209处具有谷氨酸的SEQ ID NO: 1以及具有SEQ ID N0:5的氨基酸序列的神经 氨酸酶多肽，或可以包括在氨基酸残基位置125处具有天冬氨酸并在氨基酸残基位置127 处具有谷氨酸的SEQ ID NO: 1以及具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽，或 可以包括在氨基酸残基位置125处具有天冬氨酸并在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸的 SEQ ID N0:1以及具有SEQ ID N0:5的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽，或可以包括在氨基酸 残基位置127处具有谷氨酸并在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸的SEQ ID NO: 1以及具 有SEQ ID N0:5的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽，或可以包括在氨基酸残基位置125处具 有天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处具有谷氨酸并在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸 的SEQ ID NO: 1以及具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽。
[0097] 该组合物可以包括包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的血球凝集素多肽和包含SEQ ID N0:6的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽。该组合可以包括在氨基酸残基位置124处具有 亮氨酸的SEQ ID N0:3以及包含SEQ ID N0:6的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽，或可以包 括在氨基酸残基位置125处具有天冬氨酸的SEQ ID N0:3以及包含SEQ ID N0:6的氨基酸 序列的神经氨酸酶多肽，或可以包括在氨基酸残基位置127处具有谷氨酸的SEQ ID N0:3 以及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽，或可以包括在氨基酸残基位置209 处具有谷氨酸的SEQ ID NO: 3以及包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽，或可 以包括在氨基酸残基位置124处具有亮氨酸并在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸的SEQ ID N0:3以及包含SEQ ID N0:6的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽，或可以包括在氨基酸残 基位置125处具有天冬氨酸并在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸的SEQ ID NO: 3以及包 含SEQ ID N0:6的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽，或可以包括在氨基酸残基位置127处具 有谷氨酸并在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸的SEQ ID NO: 3以及包含SEQ ID NO:6的 氨基酸序列的神经氨酸酶多肽，或可以包括在氨基酸残基位置124处具有亮氨酸、在氨基 酸残基位置127处具有谷氨酸并在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸的SEQ ID NO: 3以及 包含SEQIDN0:6的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽，或可以包括在氨基酸残基位置125处 具有天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处具有谷氨酸并在氨基酸残基位置209处具有谷氨 酸的SEQIDNO:3以及包含SEQIDNO:6的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽。
[0098] 该组合物可以包括包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的血球凝集素多肽和包含SEQ IDN0:5或SEQIDN0:6或SEQIDN0:8的氨基酸序列的神经氨酸酶多肽。该组合物可以 包括在氨基酸残基位置125处具有天冬氨酸的SEQIDN0:4以及包含SEQIDN0:5的神经 氨酸酶多肽，或在氨基酸残基位置127处具有谷氨酸残基的SEQIDN0:4以及包含SEQID NO: 5的神经氨酸酶多肽，或在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸的SEQIDNO: 4以及包含 SEQIDNO: 5的神经氨酸酶多肽，或在氨基酸残基位置125处具有天冬氨酸并在氨基酸残基 位置127处具有谷氨酸的SEQIDN0:4以及包含SEQIDN0:5的神经氨酸酶多肽，或在氨 基酸残基位置125处具有天冬氨酸并在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸的SEQIDNO:4 以及包含SEQIDNO: 5的神经氨酸酶多肽，或在氨基酸残基位置127处具有谷氨酸并在氨 基酸残基位置209处具有谷氨酸的SEQIDNO: 4以及包含SEQIDNO: 5的神经氨酸酶多肽， 或在氨基酸残基位置125处具有天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处具有谷氨酸并在氨基 酸残基位置209处具有谷氨酸的SEQIDNO:4以及包含SEQIDNO:5的神经氨酸酶多肽。
[0099] 该组合物可以包括在氨基酸残基位置125处具有天冬氨酸的SEQIDN0:4以及 包含SEQIDNO: 6的神经氨酸酶多肽，或在氨基酸残基位置127处具有谷氨酸残基的SEQ IDNO: 4以及包含SEQIDNO: 6的神经氨酸酶多肽，或在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸 的SEQIDN0:4以及包含SEQIDN0:6的神经氨酸酶多肽，或在氨基酸残基位置125处具 有天冬氨酸并在氨基酸残基位置127处具有谷氨酸的SEQIDN0:4以及包含SEQIDN0:6 的神经氨酸酶多肽，或在氨基酸残基位置125处具有天冬氨酸并在氨基酸残基位置209处 具有谷氨酸的SEQIDN0:4以及包含SEQIDN0:6的神经氨酸酶多肽，或在氨基酸残基位 置127处具有谷氨酸并在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸的SEQIDNO:4以及包含SEQ IDNO: 6的神经氨酸酶多肽，或在氨基酸残基位置125处具有天冬氨酸、在氨基酸残基位置 127处具有谷氨酸并在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸的SEQIDN0:4以及包含SEQID NO:6的神经氨酸酶多肽。
[0100] 该组合物可以包括在氨基酸残基位置125处具有天冬氨酸的SEQIDNO:4以及包 含SEQIDNO: 8的神经氨酸酶多肽，或在氨基酸残基位置127处具有谷氨酸残基的SEQID NO: 4以及包含SEQIDNO: 8的神经氨酸酶多肽，或在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸的 SEQIDN0:4以及包含SEQIDN0:8的神经氨酸酶多肽，或在氨基酸残基位置125处具有 天冬氨酸并在氨基酸残基位置127处具有谷氨酸的SEQIDN0:4以及包含SEQIDN0:8的 神经氨酸酶多肽，或在氨基酸残基位置125处具有天冬氨酸并在氨基酸残基位置209处具 有谷氨酸的SEQIDN0:4以及包含SEQIDN0:8的神经氨酸酶多肽，或在氨基酸残基位置 127处具有谷氨酸并在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸的SEQIDN0:4以及包含SEQID NO: 8的神经氨酸酶多肽，或在氨基酸残基位置125处具有天冬氨酸、在氨基酸残基位置127 处具有谷氨酸并在氨基酸残基位置209处具有谷氨酸的SEQIDNO:4以及包含SEQIDNO:8 的神经氨酸酶多肽。SEQIDN0:8的神经氨酸酶多肽在位置222处可以具有天冬酰胺，或 在位置241处可以具有缬氨酸，或在位置369处可以具有天冬酰胺，或在位置222处可以具 有天冬酰胺并在位置369处可以具有天冬酰胺，或在位置241处可以具有缬氨酸并在位置 369处可以具有天冬酰胺，或在位置222处可以具有天冬酰胺、在位置241处可以具有缬氨 酸并在位置369处可以具有天冬酰胺。
[0101] 多核苷酸
[0102] 多核苷酸可以编码如示于SEQ ID NO: 1、3和4中的血球凝集素多肽的全部或一部 分或如示于SEQ ID N0:5-8中的神经氨酸酶多肽中的任一个。多核苷酸的实例包括含有如 示于SEQ ID N0:9-16中的序列的全部或一部分的那些。多核苷酸可以是DNA、RNA或其他 合成或修饰形式的DNA或RNA分子。这些多核苷酸可以在载体中。
[0103] 载体可以是核酸可以借此在生物、细胞或细胞组件之间传播和/或传递的手段。 载体包括在宿主细胞的染色体中自主复制或可以整合进其中的质粒、病毒、噬菌体、前病 毒、噬菌粒、转座子、人工染色体等。载体也可以是不自主复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多 核苷酸、在同一条链内由DNA和RNA两者组成的多核苷酸、聚-赖氨酸-轭合的DNA或RNA、 肽-轭合的DNA或RNA、脂质体-轭合的DNA等。如果该载体是表达载体，则它可以能够促 进掺入其中的核酸的表达以及复制。可以将该载体或表达载体掺入宿主细胞中。
[0104] 如果该载体是表达载体并且该表达载体已经被选择用于引入细菌细胞中，则 该表达载体可以是多功能大肠杆菌克隆与表达载体，如BLUESCRIPT (Stratagene公 司），或pIN载体（范黑克（Van Heeke) &舒斯特（Schuster) 1989生物化学杂志（J Biol Chem)264:5503-5509) ;pET载体（Novagen公司，麦迪逊，威斯康星州）；或任何 其他此类熟知的表达载体。类似地，在酵母酿酒酵母中，可以使用多种包含组成型或诱 导型启动子（如a因子、醇氧化酶和PGH)的载体产生希望的表达产物。对于评论， 参见奥苏贝尔（Ausubel)，见下文和格朗特（Grant)等人，1987酶学方法（Methods in Enzymology)153:516-544。
[0105] 宿丰细朐
[0106] 可以使用任意多种熟知且常见地实践的技术用载体转导、转化或转染宿主细胞。 一般而言，宿主细胞可以是细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌属和鼠伤寒沙门菌；真菌细胞，， 如酿酒酵母、毕赤酵母和粗糙脉孢菌；昆虫细胞，如果蝇属和草地贪夜蛾；或哺乳动物细 胞，如 COS、Vero、PerC、CHO、BHK、MDCK、293、293T 以及 C0S7 细胞。
[0107] 可以将包括载体或表达载体的宿主细胞在修饰为适于例如通过产生病毒来活化 启动子、选择转化体或扩增插入的多核苷酸序列的常规营养素培养基中培养。培养条件 (如温度、PH等）典型地是先前用于被选择用于进行表达的具体宿主细胞的那些，并且对 于本领域的普通技术人员而言以及在此处引用的参考文献中应是清楚的，这些参考文献包 括例如弗莱施奈伊（Freshney) (1994)动物细胞培养，基本技术手册（Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique)，第3版，威利-利斯公司，纽约以及其中引用的参 考文献。其他有用的参考文献包括例如，保罗（Paul) (1975)细胞与组织培养（Cell and Tissue Culture)，第5版，利文斯顿，爱丁堡；亚当斯（Adams) (1980)生物化学与分子生物 学实验室技术-为生物化学家提供的细胞培养（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culture for Biochemists)，沃克（Work)和伯登（Burdon) (编辑）爱思唯尔公司（Elsevier)，阿姆斯特丹。关于在体外产生流感病毒的特别令人感 兴趣的组织培养程序的另外的细节包括例如，在科恩（Cohen)和谢弗曼（Shafferman)(编 辑）的疫苗设计与生产中的新策略（Novel Strategies in Design and Production of Vaccines)中的默腾（Merten)等人，（1996)在用于制备疫苗的细胞培养物中生产流感病毒 (Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation)中，出 于所有目的将其以其全部内容结合在此。另外，通过常规实验法容易地确定适合于本发明 的此类程序的变化并且为本领域的普通技术人员所熟悉。
[0108] 试齐Il盒和试齐Il
[0109] 试剂盒可以包含一种或多种核酸、多肽、抗体或在此描述的细胞系（例如，包括或 具有包含SEQ ID NO: 1和3-8