酸残基位置125处的天冬氨酸以及在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或
[0280] 在氨基酸残基位置127处的谷氨酸以及在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或
[0281] 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处的谷氨酸以及在 氨基酸残基位置209处的谷氨酸。
[0282] 实施例E4.如实施例El所述的分离的血球凝集素多肽，包括SEQIDNO: 3的氨基 酸序列。
[0283] 实施例E5.如实施例E4所述的分离的血球凝集素多肽，其中如示于SEQIDNO:3 中的氨基酸序列包括：
[0284] 在氨基酸残基位置124处的亮氨酸；或
[0285] 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸；或
[0286] 在氨基酸残基位置127处的谷氨酸；或
[0287] 在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或
[0288] 在氨基酸残基位置124处的亮氨酸以及在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或
[0289] 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸以及在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或
[0290] 在氨基酸残基位置127处的谷氨酸以及在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或
[0291] 在氨基酸残基位置124处的亮氨酸、在氨基酸残基位置127处的谷氨酸以及在氨 基酸残基位置209处的谷氨酸；或
[0292] 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸、在氨基酸残基127处的谷氨酸以及在氨基 酸残基位置209处的谷氨酸。
[0293] 实施例E6.如实施例El所述的分离的血球凝集素多肽，包括SEQIDNO:4的氨基 酸序列。
[0294] 实施例E7.如实施例E6所述的分离的血球凝集素多肽，其中SEQIDNO:4的氨基 酸序列包括：
[0295] 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸；或
[0296] 在氨基酸残基位置127处的谷氨酸；或
[0297] 在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或
[0298] 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸以及在氨基酸位置127处的谷氨酸；或
[0299] 在氨基酸残基位置127处的谷氨酸以及在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或
[0300] 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸以及在氨基酸位置209处的谷氨酸；或
[0301] 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处的谷氨酸以及在 氨基酸残基位置209处的谷氨酸。
[0302] 实施例E8.-种分离的多核苷酸，编码如实施例E1-E7中任一项所述的血球凝集 素多肽。
[0303] 实施例E9.-种载体，包括根据实施例E8所述的多核苷酸。
[0304] 实施例E10.-种细胞，包括根据实施例E9所述的载体。
[0305] 实施例ElL-种组合物，包括如任何实施例E1-E7所述的血球凝集素多肽。
[0306] 实施例E12.如实施例Ell所述的组合物，该组合物是免疫原性的。
[0307] 实施例E13.-种组合物，包括如实施例E8所述的分离的多核苷酸、如实施例E9 所述的载体或如实施例ElO所述的细胞中的任一个。
[0308] 实施例E14.如实施例Ell或E12中任一项所述的组合物，该组合物进一步包括神 经氨酸酶多肽。
[0309] 实施例E15.如实施例E14所述的组合物，其中该神经氨酸酶多肽包括SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7 或 SEQ ID NO:8 的氨基酸序列。
[0310] 实施例E16.如实施例E15所述的组合物，其中该神经氨酸酶多肽包括SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
[0311] 实施例E17.如实施例E16所述的组合物，其中SEQ ID N0:8的该神经氨酸酶多肽 包括：
[0312] 在氨基酸残基位置222处的天冬酰胺；或
[0313] 在氨基酸残基位置241处的缬氨酸；或
[0314] 在氨基酸残基位置369处的天冬酰胺；或
[0315] 在氨基酸残基位置222处的天冬酰胺以及在氨基酸残基位置369处的天冬酰胺； 或
[0316] 在氨基酸残基位置241处的缬氨酸以及在氨基酸残基位置369处的天冬酰胺；或
[0317] 在氨基酸残基位置222处的天冬酰胺、在氨基酸残基241处的缬氨酸以及在氨基 酸残基位置369处的天冬酰胺。
[0318] 实施例FL -种分离的神经氨酸酶多肽，包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
[0319] 实施例F2.根据实施例Fl所述的分离的神经氨酸酶多肽，该神经氨酸酶多肽包括 如示于SEQ ID NO:8中的氨基酸序列。
[0320] 实施例F3.根据实施例F2所述的分离的神经氨酸酶多肽，其中SEQ ID NO:8的该 神经氨酸酶多肽包括：
[0321] 在氨基酸残基位置222处的天冬酰胺；或
[0322] 在氨基酸残基位置241处的缬氨酸；或
[0323] 在氨基酸残基位置369处的天冬酰胺；或
[0324] 在氨基酸残基位置222处的天冬酰胺以及在氨基酸残基位置369处的天冬酰胺； 或
[0325] 在氨基酸残基位置241处的缬氨酸以及在氨基酸残基位置369处的天冬酰胺；或
[0326] 在氨基酸残基位置222处的天冬酰胺、在氨基酸残基241处的缬氨酸以及在氨基 酸残基位置369处的天冬酰胺。
[0327] 实施例F4. -种分离的多核苷酸，编码如实施例F1-F3中任一项所述的神经氨酸 酶多肽。
[0328] 实施例F5. -种载体，包括根据实施例F4所述的多核苷酸。
[0329] 实施例F6. -种细胞，包括根据实施例F5所述的载体。
[0330] 实施例F7. -种组合物，包括如实施例F1-F3中任一项所述的神经氨酸酶多肽、如 实施例F4所述的多核苷酸、如实施例F5所述的载体或如实施例F6所述的细胞。
[0331] 实例
[0332] 现在参考以下实例来描述本发明。提供这些实例仅是出于说明的目的，并且本发 明决不应该被解释为局限于这些实例，而是应该被解释为涵盖由于在此所提供的这些传授 内容而变得明显的任何以及所有变体。
[0333] L材料与方法
[0334]野牛型病毒:由美国疾病控制与预防中心(the Centers for Disease Control and Prevention, USA)友情提供卵生长的野生型HlNlpdm甲型病毒/布里斯班/10/2010和 甲型/新罕布什尔/2/2010。甲型/吉尔罗伊/231/2011分离自白鼬的洗鼻液，该白鼬感染 了从饲养人员传播来的人类流感。所有这些病毒在马丁达比（Madin Darby)犬肾（MDCK)细 胞（欧洲细胞培养物保藏中心（European Collection of Cell Cultures))和鸡胚卵（查 尔斯河实验室（Charles River Laboratories)，威明顿，马萨诸塞州）两者中扩张。
[0335] 通讨反向遗传学产牛重组病毒:将wtHlNlpdm病毒的HA和NA基因区段通过 RT-PCR进行扩增并且克隆进pAD3000载体中（霍夫曼（Hoffmann)等人，2000美国国家科 学院院刊97:6108-13)。使用QuikChange%定点诱变试剂盒（安捷伦科技公司（Agilent Technologies)，圣克拉拉，加利福尼亚州）进行定点诱变，以向HA和NA基因中引入特异性 变化。如先前描述的（金（Jin)等人，2003病毒学（Virology) 306:18-24)，通过质粒拯救 产生6:2重配疫苗病毒。简言之，通过将八个对HlNl病毒的HA和NA蛋白基因区段和冷适 应的甲型/安阿伯/6/60(AA ca，H2N2)病毒的六个内部蛋白基因区段进行编码的cDNA质 粒共转染进共培养的293T和MDCK细胞中而产生6:2重配候选疫苗病毒。使从细胞上清液 中拯救的病毒在10日龄至11日龄鸡胚卵的尿囊腔中繁殖。通过对扩增自vRNA的RT-PCR cDNA测序来验证病毒的HA和NA序列。
[0336]病毒滴定:通过荧光聚焦测定(FFA)测量MDCK细胞中的感染性病毒滴度并且将其 表示为IogltlFFU(荧光聚焦单位）/ml。如以前描述的（陆（Lu)等人，2005J. Virol(病毒学 杂志），79:6763-6771)，通过噬斑测定检查病毒噬斑形态学。为了比较6:2重配病毒在卵中 的复制，将卵用IO 3FFU的病毒/卵接种并在33°C下孵育3天。收获尿囊液，用于FFA测定 和噬斑测定两者。
[0337]病毒牛长动力学与病毒蛋白质表汰：在MDCK细胞中确定重组6:2重配体的生长动 力学。将MDCK细胞以5或0.005的感染复数（MOI)用病毒接种。吸附Ihr后，将受感染细 胞用PBS洗涤并用包含lg/ml TPCK-胰蛋白酶（西格玛-奥德里奇公司（Sigma-Aldrich)， 圣路易斯，密苏里州）的最低必需培养基（MEM)孵育并在33°C下孵育。在不同的时间点收 集细胞培养上清液并且通过FFA测定确定病毒滴度。
[0338] 通过蛋白质印迹来分析受感染细胞中产生的病毒蛋白和细胞培养上清液中释放 的病毒粒子。如上所述，以MOI为5将MDCK细胞用病毒感染。在感染后8hr和16hr，收集 细胞培养上清液并且通过在微量离心机中在14, OOOrpm下离心5min除去细胞碎片。收集受 感染细胞并用 RIPA 缓冲液（20mM TrisCUpH 7. 5]、150mM NaCl、l% Triton X-100、0. 5% 脱氧胆酸钠、0. 1% SDS、蛋白酶抑制剂混合物）裂解。使相等量的细胞裂解液和细胞上清液 在变性条件下在N〇VexSq2% Tris-甘氨酸凝胶（英杰公司，卡尔斯巴德，加州）上电泳。 将蛋白转移至硝酸纤维素膜上并用流感特异性抗体进行印迹。
[0339] 对于免疫荧光测定，以MOI为0. 005将MDCK细胞用病毒感染。在感染后15hr或 48hr，将受感染细胞用10%福尔马林固定20分钟，随后用冰冷甲醇处理5分钟。然后，将细 胞用羊抗甲型流感病毒多克隆抗体（密理博公司（Millipore)，贝德福德，马萨诸塞州）以 1:40的稀释度在室温下孵育lhr，随后用FITC-轭合的兔抗羊IgG抗体（密理博公司，贝德 福德，马萨诸塞州）以1:100的稀释度孵育30min。通过荧光显微镜检查染色的细胞。
[0340]通讨HAI测宙检测血清抗体:用每0.2ml剂量7. Olog 1(IFFU的病毒经鼻接种来自西 蒙森实验室（Simonsen Laboratories)(吉尔罗伊，加州）的八至十周龄雌性和雌性白鼬（n =3/组）。感染后14天收集白鼬血清样品。使用HAI测定确定感染后白鼬血清中的抗同 源性和异源性病毒的抗体水平。将25 y 1用受体破坏酶（RDE，登卡生研公司（Denka Seiken Co.)，东京，日本）处理的连续稀释的血清样品与4个HA单位的指定病毒（25 yl)混合于 96孔V型底微孔板中。在室温下孵育30min后，将50 y 1的0. 5%鸡红细胞（cRBC)添加至 每个孔中并且再孵育45min。将HAI滴度定义为抑制病毒血凝的最高血清稀释度的倒数。
[0341] 2.HlNlpdm疫苗株在鸡胚卵中区别生长
[0342] 与甲型/加利福尼亚/7/2009 (CA/09)相比，三种最近的HlNlpdm株甲型/布 里斯班/10/2010 (Bris/10)、甲型/新罕布什尔/2/2010 (NH/10)和甲型/吉尔罗伊 /231/2011 (Gil/ll)在HA和NA基因区段两者中均展示出序列变异。在多个HA位置（例如 119、124、127、191、209以及222)处观察到卵适应序列变化（表1，下文）。为了评估这些病 毒的LAIV疫苗候选物的生长，使用八质粒反向遗传学体系产生包含来自主供体甲型病毒/ 安阿伯/6/60ca的6个内部蛋白基因区段和来自野生型（wt) HlNlpdm病毒的HA和NA基因 的6:2冷适应的（ca)重配病毒。将拯救的病毒在鸡胚卵中扩增并通过荧光聚焦测定（FFA) 确定感染性病毒滴度。通过噬斑测定检查MDCK细胞中的噬斑形态学（图1)。卵衍生的 Bris/10 wt的HA基因是均质的（表1)。相比于CA/09，Bris/10 ca在MDCK细胞中有效地 生长至8. 51og1(lFFU/ml的滴度并形成大的噬斑。从NH/10 wt病毒克隆三种在HA中具有卵 适应变化的 HA 变体（P124L/L191I、P124L/K209E 和 D127E/K209E)。对应的 NH/10ca 变体 在卵中生长至不同的滴度并且具有不同的噬斑形态学。P124L/L191I变体在卵中具有较低 的滴度并且在MDCK细胞中形成极小的噬斑。P124L/K209E和D127E/K209E ca两种病毒均 形成大的噬斑并且D127E/K209E变体达到8. 21og1(lFFU/ml的滴度，从而表明K209E变化主 要地有助于有效的病毒生长。不能从质粒转染的细胞中回收包含最初的HA序列或具有卵 适应变化（D222N)的HA的Gil/11 6:2 ca病毒。对应地，包含D127E/K209E的Bris/10 wt 和NH/10 wt分离株有效地生长，而Gil/11 wt在MDCK细胞和卵两者中均不良地生长（数 据未示出），从而表明HA和NA基因控制病毒复制。这些高低生长病毒的序列比较表明位置 125、127和209处的HA残基对于病毒在卵中的生长而言可以是重要的。
[0343] 表L最近的HlNlpdm株的HA序列比较
[0344]
【主权项】
1. 一种重组重配流感病毒，该重组重配流感病毒包括编码血球凝集素多肽的第一基因 组区段，其中该血球凝集素多肽包括如示于SEQIDNO: 1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4中 的氨基酸序列。
2. -种重组重配流感病毒，该重组重配流感病毒包括编码血球凝集素多肽的第一基因 组区段，其中该血球凝集素多肽包括： 在氨基酸残基位置124处的亮氨酸；或 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸；或 在氨基酸残基位置127处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置124处的亮氨酸以及在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸以及在氨基酸残基位置127处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸以及在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置127处的谷氨酸以及在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处的谷氨酸以及在氨基 酸残基位置209处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置124处的亮氨酸、在氨基酸残基位置127处的谷氨酸以及在氨基酸 残基位置209处的谷氨酸；或
3. 如权利要求1或权利要求2所述的重组重配流感病毒，该重组重配流感病毒进一步 包括编码神经氨酸酶多肽的第二基因组区段，其中该神经氨酸酶多肽包括： 在氨基酸残基位置222处的天冬酰胺；或 在氨基酸残基位置241处的缬氨酸；或 在氨基酸残基位置369处的天冬酰胺；或 在氨基酸残基位置222处的天冬酰胺以及在氨基酸残基位置369处的天冬酰胺；或 在氨基酸残基位置241处的缬氨酸以及在氨基酸残基位置369处的天冬酰胺；或 在氨基酸残基位置222处的天冬酰胺、在氨基酸残基241处的缬氨酸以及在氨基酸残 基位置369处的天冬酰胺。
4. 如权利要求1至3中任一项所述的重组重配流感病毒，该重组重配流感病毒进一步 包括一种流感病毒的六个内部基因组区段，该流感病毒具有减毒、温度敏感和冷适应中的 一种或多种的表型特征。
5. 如权利要求1至4中任一项所述的重组重配流感病毒，其中该血球凝集素多肽包括 如示于SEQIDNO: 1中的氨基酸序列；并且其中 在位置125处的氨基酸是天冬氨酸；并且 在位置127处的氨基酸是谷氨酸；并且 在位置209处的氨基酸是谷氨酸。
6. 如权利要求1至4中任一项所述的重组重配流感病毒，其中该血球凝集素多肽包括 如示于SEQIDN0:3中的氨基酸序列；并且其中 在位置125处的氨基酸是天冬氨酸；并且 在位置127处的氨基酸是谷氨酸；并且 在位置209处的氨基酸是谷氨酸。
7. 如权利要求1至4中任一项所述的重组重配流感病毒，其中该血球凝集素多肽包括 如示于SEQIDNO:4中的氨基酸序列；并且其中 在位置125处的氨基酸是天冬氨酸；并且 在位置127处的氨基酸是谷氨酸；并且 在位置209处的氨基酸是谷氨酸。
8. 如权利要求1至7中任一项所述的重组重配流感病毒，其中该神经氨酸酶多肽包括 如示于SEQIDN0:8中的氨基酸序列；并且其中 在位置222处的氨基酸是天冬酰胺；并且 在位置241处的氨基酸是缬氨酸；并且 在位置369处的氨基酸是天冬酰胺。
9. 如权利要求5至8中任一项所述的重组重配流感病毒，其中该六个内部基因组区段 属于甲型流感病毒/安阿伯/6/60。
10. 如权利要求5至8中任一项所述的重组重配流感病毒，其中该六个内部基因组区段 属于甲型流感病毒/波多黎各/8/34。
11. 如权利要求1至10中任一项所述的重组重配流感病毒，其中该重配流感病毒已经 被灭活。
12. 如权利要求1至11中任一项所述的重组重配流感病毒，其中该重配流感病毒是减 毒活的。
13. -种免疫原性组合物，包括如权利要求1至12中任一项所述的重组流感病毒。
14. 如权利要求13所述的免疫原性组合物，该免疫原性组合物包括包含H3N2甲型流感 株HA和NA抗原的重组流感病毒、包含山县乙型流感株HA和NA抗原的重组流感病毒、以及 包含维多利亚乙型流感株HA和NA抗原的重组流感病毒。
15. -种产生重组重配流感病毒的方法，该方法包括： (a) 向能够支持流感病毒复制的宿主细胞群体中引入多个载体，该多个载体包括第一 流感株的至少6个内部基因组区段和第一基因组区段，该第一基因组区段编码包含如示于 SEQIDNO: 1、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4中的氨基酸序列的血球凝集素多肽； (b) 培养该宿主细胞群体，以扩增该重组重配流感病毒；并且 (c) 从该宿主细胞群体中回收该重组重配流感病毒。
16. 如权利要求15所述的方法，其中包含SEQIDNO: 1的氨基酸序列的该血球凝集素 多肽包括： 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸；或 在氨基酸残基位置127处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸以及在氨基酸残基位置127处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸以及在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置127处的谷氨酸以及在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处的谷氨酸以及在氨基 酸残基位置209处的谷氨酸。
17. 如权利要求15所述的方法，其中包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的该血球凝集素 多肽包括： 在氨基酸残基位置124处的亮氨酸；或 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸；或 在氨基酸残基位置127处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置124处的亮氨酸以及在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸以及在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置127处的谷氨酸以及在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置124处的亮氨酸、在氨基酸残基位置127处的谷氨酸以及在氨基酸 残基位置209处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸、在氨基酸残基127处的谷氨酸以及在氨基酸残 基位置209处的谷氨酸。
18. 如权利要求15所述的方法，其中包含SEQIDNO:4的氨基酸序列的该血球凝集素 多肽包括： 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸；或 在氨基酸残基位置127处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸以及在氨基酸位置127处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置127处的谷氨酸以及在氨基酸残基位置209处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸以及在氨基酸位置209处的谷氨酸；或 在氨基酸残基位置125处的天冬氨酸、在氨基酸残基位置127处的谷氨酸以及在氨基 酸残基位置209处的谷氨酸。
19. 如权利要求15至18中任一项所述的方法，其中步骤（a)中的该多个载体包括第二 基因组区段，该第二基因组区段编码包含SEQIDNO: 5或SEQIDNO: 7或SEQIDNO:8的 氨基酸序列的神经氨酸酶多肽。
20. 如权利要求19所述的方法，其中该神经氨酸酶多肽包括SEQIDNO: 8的氨基酸序 列。
21. 如权利要求20所述的方法，其中如示于SEQIDN0:8中的该神经氨酸酶多肽包括： 在氨基酸残基位置222处的天冬酰胺；或 在氨基酸残基位置241处的缬氨酸；或 在氨基酸残基位置369处的天冬酰胺；或 在氨基酸残基位置222处的天冬酰胺以及在氨基酸残基位置369处的天冬酰胺；或 在氨基酸残基位置241处的缬氨酸以及在氨基酸残基位置369处的天冬酰胺；或 在氨基酸残基位置222处的天冬酰胺、在氨基酸残基241处的缬氨酸以及在氨基酸残 基位置369处的天冬酰胺。
【专利摘要】提供了多肽、多核苷酸、方法、组合物以及包括流感血球凝集素和神经氨酸酶变体的疫苗。
【IPC分类】A61K39-145
【公开号】CN104780936
【申请号】CN201380059593
【发明人】金红, 陈忠英
【申请人】米迪缪尼有限公司
【公开日】2015年7月15日
【申请日】2013年11月15日
【公告号】CA2891508A1, EP2919809A1, WO2014078674A1