离子交联法制备壳聚糖-负电性抗生素纳米粒及其抑菌活性的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及纳米技术和抗生素递送领域，特别是涉及抗生素纳米颗粒的制备，来用于抗生素可控释放系统和抑菌活性。
【背景技术】
[0002]负电性抗生素是在水溶液中电离后出现负电荷基团的一类抗生素，其主要含有羧酸、磷酸、磺酸等基团，包括达托霉素，磷霉素，多粘菌素E甲磺酸钠，安福霉素，头孢尼西，黄霉素等。在此，以达托霉素作为主要的研宄对象。
[0003]达托霉素是自链霉菌发酵液中提取得到的一种全新结构的环脂肽类抗生素，它对高耐药性菌株引起的临床症状具有显著的效果。2003年底，美国食品与药物管理局(FDA)批准注射用达托霉素用于治疗一些革兰氏阳性菌引起的并发性皮肤及皮肤结构感染，如脓月中、手术切口感染和皮肤溃疡，以及金黄色葡萄球菌引起的菌血症。2006年，批准达托霉素用于治疗感染性心内膜炎。达托霉素除了能作用于大多数临床相关革兰氏阳性菌外，更重要的是它在体外对已呈现甲氧西林(methicillin)、万古霉素和利奈唑烷等耐药性质的分离菌株具有强力活性。达托霉素的作用机制与其他抗生素不同，它是通过扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀菌的目的，因此细菌对达托霉素产生耐药性可能会比较困难。达托霉素具有有效的体外和体内杀菌活性，以对抗造成严重且威胁生命疾病的临床相关革兰氏阳性细菌。
[0004]2010年7月29日，FDA称就诊疗过程中使用静脉内注射药物达托霉素(daptomycin，Cubist制药公司生产，商品名Cubicin)可能引起嗜酸细胞性肺炎的问题。
[0005]利用生物大分子材料来制备纳米药物载体，希望能够既满足对药物输送的要求，又减弱对生物体的毒副作用。用于纳米药物载体中的生物大分子主要包含蛋白质和多糖(如壳聚糖)两大类。由于这些大分子都可以从自然界的动植物中获得，来源丰富，同时也是一种可再生资源，它们具有良好的生物体亲合性，排斥反应小，而且能被生物体内的酶降解，降解后的产物对生物体的毒副作用也较小，另外这些大分子的分子链上常常带有羟基、氨基、羧基等大量可以反应的官能团，可以作为化学修饰的位点，因此它们作为药物的载体材料具有非常广阔的应用前景。
[0006]壳聚糖是甲壳素通过强碱水解或酶解后脱去乙酰基得到的多糖，化学名为聚(1，4)-2-氨基-2-脱氧-β -D-葡萄糖。壳聚糖的生物相容性好，有促吸收作用，且对人体无毒，也不会对环境产生二次污染，因此，在各方面有广泛的应用。另外，壳聚糖可以被体内多种酶生物降解，降解产物无毒而且能被生物体完全吸收，因此，是药物缓释的理想载体，近年来，作为药物载体材料，壳聚糖受到了很大的关注。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种有效地递送负电性抗生素的纳米制剂。本发明通过离子交联法制备壳聚糖-负电性抗生素纳米颗粒能有效地控释药物且具有相当的抑菌活性。
[0008]本发明进一步的目的在于提供一种用来有效地进行负电性抗生素递送的生物相容性的聚合物，从而减少其副作用。
[0009]上述以及其他目的是通过一种天然阳离子多糖来实现的，其中所述的聚合物是壳聚糖(分子量lk-500kDa)。此外，该聚合物壳聚糖能溶于弱酸性溶液，且带有大量正电荷，因此它很容易与带有负电荷的分子在水相条件下作用而制成纳米粒。本发明主要使用离子交联法制备壳聚糖-负电性抗生素纳米粒。该方法可以解决药物吸收难、毒性和不稳定等问题，同时具有缓控释作用和增加靶向性等优点。
[0010]本发明是通过以下的技术方案实现的，具体步骤如下:
[0011]壳聚糖-负电性抗生素纳米粒的制备方法如下:称取一定量的壳聚糖，溶于醋酸-醋酸钠缓冲液中，配成一定浓度的壳聚糖溶液，用Imol/LNaOH溶液调节pH至5.0。另称取一定量的负电性抗生素溶于蒸馏水中配成一定浓度的负电性抗生素水溶液。在磁力搅拌条件下将负电性抗生素水溶液缓慢滴加到上述壳聚糖溶液中，继续搅拌30min，用0.8 μπι微孔滤膜过滤，即得壳聚糖-负电性抗生素纳米粒。用MWCO = 3500透析袋进行透析除去未包裹的药物。最后纳米粒冻干或保存在4°C下备用。
[0012]本发明具有如下的有益效果:本发明制备的基于离子交联法的壳聚糖-负电性抗生素纳米粒能有效地控释药物，并且具有相当的抑菌活性，在抗生素递送领域具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0013]图1是本发明按照实施例1合成的壳聚糖-达托霉素纳米粒外观照片和粒径分布；
[0014]图2是本发明按照实施例1制备的壳聚糖-达托霉素纳米粒在不同pH条件下释放曲线；
[0015]图3是本发明按照实施例1制备的壳聚糖-达托霉素纳米粒及其对照样品的抑菌活性:1-达托霉素纳米粒；2_达托霉素标准品；3_壳聚糖；具体用药量如下:(a)载药量为
1.25 μ g/片；(b)载药量2.5 μ g/片；(C)载药量5 μ g/片；(d)载药量10 μ g/片
[0016]图4是本发明按照实施例1的壳聚糖-达托霉素纳米粒，达托霉素标品以及壳聚糖的抑菌圈直径。
【具体实施方式】
[0017]实施例1
[0018]称取一定量的壳聚糖，溶于50mM的醋酸-醋酸钠溶液中，配成0.5mg/ml的壳聚糖溶液，用Imol/LNaOH溶液调节pH至5.0。另称取一定量的达托霉素溶于纯化水中配成4mg/ml的达托霉素水溶液。在磁力搅拌条件下将4ml达托霉素水溶液缓慢滴加到上述壳聚糖溶液中，继续搅拌30min，用0.8 μ m微孔滤膜过滤，即得壳聚糖-达托霉素纳米粒。用MWCO=3500透析袋进行透析除去未包裹的药物。最后纳米粒冻干或保存在4°C下备用。
[0019]实施例2
[0020]纳米粒的表征
[0021]纳米粒的大小使用动态光散射测定，样品为2ml。
[0022]实施例3
[0023]壳聚糖-达托霉素纳米粒载药量的测定
[0024]首先绘制标准曲线。配制不同浓度的达托霉素标准溶液，分别取5、10、20、40、60,80,120 μ I 的 1.0075mg/ml 达托霉素水溶液，稀释至 4ml，即得 1.260,2.519,5.038、10.076,15.113,20.150,30.225 μ g/ml的达托霉素水溶液，用紫外-可见光分光光计测定其在221nm处的吸光度A，拟合曲线得方程:y = 0.0255x+0.0181，R2= 0.9959。
[0025]取2ml壳聚糖-达托霉素纳米粒，于冷冻干燥机中冻干，得纳米粒1.30mg，加蒸饱水复溶后滴加0.lmol/L的HCl至澄清。稀释20倍后测紫外吸光度，代入达托霉素吸光度标准曲线得达托霉素浓度为0.3952mg/mlo代入载药量计算公式:载药量=(Wt/ffn) X 100%(Wt:纳米粒中达托霉素的质量;Wn:纳米粒的总质量)，计算得载药量。
[0026]实施例4
[0027]壳聚糖-达托霉素纳米粒的体外释放
[0028]绘制纳米粒的体外释药行为曲线:精密量取3ml纳米粒4份，分别置于透析袋(MWC0 = 3500)中，将透析袋两端扎紧，分别置于装有40mL pH分别为4.5，5.0，6.0和7.4的磷酸盐缓冲溶液的锥形瓶中，锥形瓶放置于温度37°C、振荡频率120次/min的水浴振荡器中，分别于0.5h，lh, 2h，4h，6h，8h，12h，24h，48h和72h自锥形瓶中取出3mL溶液，用紫外-可见光分光光度计测其在λ = 221nm处的吸光度，同时立即向锥形瓶中补加3mL相同pH值的磷酸盐缓冲溶液。由标准曲线计算溶液中达托霉素的浓度及累积释放率。重复上述步骤两次。取三批样本的累积释放率的平均值，绘制纳米粒中达托霉素的累积释放曲线图。
[0029]实施例5
[0030]达托霉素纳米颗粒抗葡萄球菌活性研宄
[0031]将20ml灭菌的营养琼脂培养基加入到已灭菌的平皿中、冷却，制备底层培养基。取培养8h的金黄色葡萄球菌液体培养物2ml加到10ml灭菌且冷却到55°C的I %营养琼脂培养基中，震荡混匀，吸取5ml加入到底层培养基上，制备含金黄色葡萄球菌的双层平板。用镊子将载药量为10，5，2.5，1.25 μ g/片的达托霉素纳米粒无菌滤纸片置于金黄色葡萄球菌的双层平板上，同时设辅料核寡糖和达托霉素标准品为对照，37°C培养24h。观察比较不同载药量组中达托霉素纳米粒、达托霉素标准品和核寡糖的抑菌圈大小并测量抑菌圈直径。
【主权项】
1.一种含抗生素的纳米制剂，其特征主要在于该纳米制剂主要包括以下成分:阳离子聚合物，负电性抗生素。制备方法为离子交联法。
2.权力要求I所述的聚合物是一种阳离子壳聚糖，分子量范围lk-500k；
3.权力要求I所述的抗生素是负电性抗生素，具体包括达托霉素，磷霉素，多粘菌素E甲磺酸钠，安福霉素，头孢尼西，黄霉素等。
4.根据权力要求I所述的纳米颗粒的制备方法，其特征是所述反应步骤如下: 称取一定量的壳聚糖，溶于50mM的醋酸-醋酸钠溶液中，配成0.01-5.0mg/ml的壳聚糖溶液，用lmol/L NaOH溶液调节pH至3.0-7.0。另称取一定量的负电性抗生素溶于蒸馏水中配成0.5-20mg/ml的水溶液。在磁力搅拌条件下将负电性抗生素溶液缓慢滴加到上述壳聚糖溶液中，负电性抗生素溶液与壳聚糖溶液的体积比例为1: 1-10: 1，继续搅拌30min，用0.8 μ m微孔滤膜过滤，即得壳聚糖-负电性抗生素纳米粒。用透析袋(MWC0 =3.5k-14k)进行透析除去未包裹的药物。最后纳米粒冻干或保存在4°C下备用。
5.根据权力要求4所述的纳米颗粒的纯化方法，其特征为:透析袋的分子量在3.5k-14k范围内。
6.根据权力要求I或4所述的纳米颗粒作为抗菌应用。
7.—种通过注射给药的抗生素传递系统，根据权利I要求所述的达托霉素及其负电性抗生素的纳米粒，其特征在于，纳米粒作为制剂不仅可制备成注射剂亦可制备液体制剂。
【专利摘要】本发明提供了一种负电性抗生素的纳米制剂。其主要包括壳聚糖，负电性抗生素；将该抗生素通过离子交联法制备壳聚糖-负电性抗生素纳米颗粒。该法制备过程简单，操作简便，不使用有机溶剂，得到的纳米颗粒粒径均匀，且重现性较好。该抗生素纳米颗粒的药效学活性与原药相当。该抗生素纳米粒具有抗菌谱广、毒副作用低等优点。通过制备该纳米粒制剂，可达到安全、有效、作用可靠的治疗目的。
【IPC分类】A61K38-10, A61P31-04, A61K9-08, A61K47-36, A61K45-00, A61K9-14
【公开号】CN104784120
【申请号】CN201410489772
【发明人】姜虎林, 邢磊, 何玉静, 崔朋飞, 黄炜珺
【申请人】中国药科大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2014年9月22日