一种癌转移抑制剂及其应用

文档序号:8463919阅读:838来源:国知局
一种癌转移抑制剂及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域,具体的涉及一种癌转移抑制剂及其应用,更具体的 涉及mir-518a-l和/或其成熟miRNA在诊治肺腺癌转移中的新用途。
【背景技术】
[0002] miRNA通常由RNA聚合酶II (Pol II)转录生成。Pol II结合在以后形成发夹结 构的颈环DNA序列附近。生成的转录本经修饰添加5'帽子结构和3'末端多腺苷酸尾巴结 构,并剪切,生成的产物称为初级miRNA (pri-miRNA),该产物可能长达数千或数百核苷酸, 可能包含多个miRNA环结构。
[0003] 单个pri-miRNA可能含一到六个miRNA前体。这些发夹结构每个由约70nt左右的 核苷酸组成。每个发卡结构附以部分序列以利于有效剪切处理。pri-miRNA中的双链发夹 RNA 结构被叫做 DGCR8 的核蛋白(DiGeorge Syndrome Critical Region 8)辨认,DGCR8 同 Drosha酶一起形成微处理(microprocessor)复合体。在该复合体中,DGCR8组织Drosha 蛋白的RNase III结构域使其在距离发卡结构约11个核苷酸处切割pri-miRNA,使其释放 发卡结构。释放的发卡结构即为前miRNA(pre-miRNA),pre-miRNA在3'存在两个悬空的核 苷酸,pre-miRNA 5'为磷酸集团,3'为羟基集团。
[0004] 在胞浆中,pre-miRNA发夹结构经RNase III Dicer切割处理。这种内源性核糖 核酸酶(endoribonuclease)与发夹结构的3'相互作用并在环的3'和5'臂上完成切割, 产生长约22nt并不完美匹配的miRNA :miRNA*双链结构。
[0005] miRNA与靶mRNA的典型作用方式主要有两种。在大多数情况下,复合物中的单 链miRNA与靶mRNA的3' UTR不完全互补配对,阻断靶基因的翻译,从而调苄基因表达。这 种方式主要影响蛋白表达水平,并不影响mRNA的稳定性。近来,有研宄对翻译抑制理论提 出质疑,发现被抑制的革G mRNAs和miRNAs共同聚集于胞衆中被称为P小体(processing bodies,P_bodies)的区域,这个区域还浓缩了许多参与mRNA降解的酶类。P小体可能是作 为未翻译mRNA进行暂时的可逆储存的容器,减少一些特定P小体组成蛋白的表达能够缓和 miRNA介导的基因表达抑制作用。P小体是胞浆中的一定区域,它包含参与多种转录后过程 的蛋白质,例如:mRNA 降解(mRNA degradation)、无义介导 mRNA 衰退(nonsense-mediated mRNA decay, NMD),转录抑制及 RNA 介导的基因沉默(RNA-mediated gene silencing)。
[0006] 另一种作用方式与siRNA类似,当miRNA与mRNA完全互补配对时,Ago2蛋白通过 切割mRNA直接导致其降解,实现基因沉默。以siRNA参与的RNAi为例:siRNA可与RISC结 合,作为模板识别mRNA靶子,通过碱基互补配对原则,mRNA与siRNA中的反义链结合,置换 出正义链。双链mRNA在Dicer酶、ATP和解旋酶共同作用下产生22nt左右的siRNA,siRNA 继续同RISC形成复合体,与siRNA互补的mRNA结合,使mRNA被RNA酶裂解。这个过程也 称为转录后基因沉默(PTGS)。
[0007] 总之,当前认为miRNA以何种方式与目的基因作用和miRNA与目的基因的配对程 度有关。miRNA与目的基因配对不完全时,miRNA就以抑制目的基因的表达发挥作用;miRNA 与目的基因某段序列配对完全时,就可能引起目的基因在互补区断裂而导致基因沉默。另 外,miRNAs有时候也导致组氨酸修饰和启动子区的DNA甲基化,从而影响靶基因的表达。除 此外,近来发现快速脱腺苷酸化(accelerated deadenylation)是miRNA抑制基因表达的 新机制。在哺乳动物细胞中发现miR-125b和let-7能够促进mRNA聚腺苷酸尾巴(polyA tail)的去除。用3'组蛋白茎-环结构取代聚腺苷酸尾巴,不但可以消除miR-125b对mRNA 含量的影响,还可以降低对蛋白质合成的作用,可见miRNA能通过降低翻译效率和聚腺苷 酸化mRNA的浓度来抑制基因表达。
[0008] 肺腺癌(lung adenocarcinoma)属于非小细胞肺癌,易发生于女性及不抽烟者。在 肺部的位置常较周边,肿瘤扩大的速度较慢(倍增时间约120天)。早期无征兆,通常诊断 出来时已经是晚期。非小细胞肺癌占肺癌总数的75%-80%。在我国由于肺癌所致的死亡 占全部肿瘤相关死亡的23%左右,大约90%的恶性肿瘤的死亡与肿瘤转移有关,绝大多数 肺癌患者由于肿瘤细胞的局部侵袭及远处转移,确诊时己经失去手术机会。因此,深入了解 参与肺癌侵袭及转移的因子及可能的机制,对于肺癌的早期干预及个体化治疗提供指导, 以期能改善肺癌的预后。
[0009] 本发明通过对肺腺癌患者进行回顾性分析,将其分成两组:肺腺癌转移组和非 转移组,通过Illumina平台进行测序分析,获得miRNA表达数据,进而进行生物信息学分 析,发现在肺腺癌转移组中mir-518a_l低表达显著,同时找到miR-518a-1-5p的革El标基因 MKI67、F0XM1和MIDI。进一步的分子生物学验证结果显示,mir-518a-l和肺腺癌转移密切 相关,过表达miR-518a-1-5p能有效降低其靶标基因 MKI67、FOXMl和MIDI的蛋白的表达, 可用于临床诊断及预防检测,具有很好的实际应用价值。

【发明内容】

[0010] 本发明的目的还在于提供mir-518a-l和/或其成熟miRNA在制备预防、诊 断和/或治疗肺腺癌转移试剂中的应用。mir-518a-l的序列见序列表SEQ ID NO 1。 mir-518a-l 的成熟 miRNA 为 miR-518a-1-5p 和 miR-518a-1-3p 其序列见序列表 SEQ ID NO 2(miR-518a-1-5p)和 SEQ ID NO 3(miR-518a-1-3p)。
[0011] 进一步,所述的预防、诊断肺腺癌转移试剂包括基于高通量测序方法和/或基于 定量PCR方法和/或基于探针杂交方法检测肺腺癌样本中mir-518a-l和/或其成熟miRNA 的转录或基于免疫检测方法检测肺腺癌样本中其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况,优 选采用northern杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于 微球的流式细胞术检测肺腺癌样本中mir-518a-l和/或其成熟miRNA的转录;采用ELISA 和/或胶体金试纸条检测肺腺癌样本中其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况。优选所述 mir-518a-l 的成熟 miRNA 调控的靶基因为 FOXMl、MIDI、MKI67。
[0012] 优选的,所述的基于定量PCR方法包括特异性扩增mir-518a-l和/或其成熟 miRNA的引物,进一步优选特异性扩增mir-518a-l引物序列为SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5,特异性扩增mir-518a-l成熟miRNA引物序列为SEQ ID NO 6;所述的基于探针杂交方法 包括与mir-518a-l和/或其成熟miRNA的核酸序列杂交的探针;所述免疫检测方法包括 与其成熟miRNA调控基因表达蛋白特异性结合的抗体,进一步优选调控的靶基因为F0XM1、 MIDI、MKI67蛋白特异性结合的抗体。
[0013] 进一步,所述的治疗肺腺癌转移试剂包括上调mir-518a-l和/或其成熟miRNA的 转录和/或促进其成熟miRNA的活性的试剂。优选的,采用基于RNA的microRNA功能获得 性技术和/或基因特异性miR Mimics技术上调mir-518a_l和/或其成熟miRNA的转录和/ 或促进其成熟miRNA的活性。更优选人工合成mir-518a-l成熟miRNA的短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)或通过调控启动子上调mir-518a_l。
[0014] 本发明的目的在于提供一种治疗肺腺癌转移药物组合物,其特征在于,所述药物 组合物包含:
[0015] (a)上调mir-518a-l和/或其成熟miRNA的转录和/或促进其成熟miRNA的活性 的试剂;
[0016] (b)药剂学上能接受的载体。
[0017] 进一步,采用基于RNA的microRNA功能获得性技术和/或基因特异性miRMimics 技术上调mir-518a-l和/或其成熟miRNA的转录和/或促进其成熟miRNA的活性。优选 人工合成mir-518a_l成熟miRNA的短发夹RNA (short hairpin RNA,shRNA)或通过调控启 动子上调mir-518a_l。
[0018] 本发明的目的在于提供一种肺腺癌转移诊断试剂,所述肺腺癌转移诊断试剂能够 检测肺腺癌样本中mir-518a-l和/或其成熟miRNA的转录或免疫检测方法检测肺腺癌样 本中其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况。
[0019] 进一步,所述肺腺癌转移诊断试剂基于高通量测序方法和/或基于定量PCR方法 和/或基于探针杂交方法检测肺腺癌样本中mir-518a-l和/或其成熟miRNA的转录或基 于免疫方法检测肺腺癌样本中其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况,优选采用northern 杂交方法、miRNA表达谱芯片、核酶保护分析技术、RAKE法、原位杂交、基于微球的流式细胞 术检测肺腺癌样本中mir-518a-l和/或其成熟miRNA的转录;采用ELISA和/或胶体金试 纸条检测肺腺癌样本中其成熟miRNA调控的靶基因的表达情况。优选所述mir-518a-l的 成熟miRNA调控的靶基因为FOXMl、MIDI、MKI67。
[0020] 优选的,所述的用于定量PCR方法包括特异性扩增mir-518
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