一种纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的新型制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种对糖尿病治疗起作用的多糖复合体的制备方法，具体为纳米 硒-梭柄松苞菇多糖复合体的新型制备方法，属于生物医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一种以高血糖为临床特征的综合性代谢紊乱疾病。根据世界卫生组织在 2014年公布的数据，全球糖尿病患者人数已经达到3. 47亿。
[0003] 由于糖尿病患者体内的氧化应激水平显著高于正常人，因此患者的肾脏、眼睛、心 脏、血管和神经等组织极易受到氧化损伤，而诱发各种糖尿病并发症。糖尿病并发症也被认 为是糖尿病对机体的主要危害。近期研宄发现，摄入抗氧化剂能够显著缓解和修复糖尿患 者机体内的氧化损伤病变，从而实现对糖尿病及其并发症的治疗。因此如何更有针对性地 选择安全、高效和廉价的抗氧化剂来实现对糖尿病及其并发症的有效干预，成为现今科学 研宄的热点。
[0004] 梭柄松苞菇是我国传统的名贵中药材，在《本草纲目》和《滇南本草》便对其有相 关记载。它具有高蛋白、低脂肪和低能量的特性，因此是糖尿病患者非常理想的日常营养膳 食补充。随着现代生物技术的深入研宄，梭柄松苞菇的药用价值及其活性成分不断被发掘， 其中梭柄松苞菇多糖被证明具有极强的抗糖尿病活性，能有效的降低糖尿病小鼠的血糖、 血脂和机体氧化应激水平。
[0005] 纳米硒是一种红色胶体状态单质硒，一般是利用还原剂还原亚硒酸钠而获得。它 几乎没有毒性，同时比无机硒和有机硒更易吸收，并且表现出更高的抗氧化活性。已经被广 泛的应用于糖尿病、心血管疾病和肿瘤的研宄和治疗。而纳米硒的粒径、稳定性和生物活性 往往受到还原剂性能的影响。现阶段，纳米硒制备过程中常采用的还原剂包括：维生素C、 二丁基羟基甲苯和谷胱甘肽等。梭柄松苞菇醇提物是梭柄松苞菇多糖提取过程中，去除醇 溶性物质的废弃物，然而研宄发现梭柄松苞菇醇提物中富含黄酮和多酚等还原剂，其还原 性能显著高于维生素C和二丁基羟基甲苯，因此梭柄松苞菇醇提物具备成为新型还原剂的 潜质。
[0006] 研宄发现，在液相中如果没有分散剂或稳定剂的存在下红色的纳米硒是十分不稳 定的，并且极易聚集形成大颗粒（一般认为纳米硒的粒径与活性成负相关），而失去生物 活性和可利用性。而多糖具有复杂分支结构及活泼的羟基基团，可以将纳米硒吸附和包 裹，使纳米硒更稳定地存在于液相体系中，并且由于多糖自身的生物活性，从而赋予了纳米 硒-多糖复合体更丰富的生物特性。因此，如果能将具有强抗氧化活性的梭柄松苞菇多糖 作为纳米硒的分散剂，它们所形成的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的抗氧化活性很可能 会显著高于梭柄松苞菇多糖和纳米硒独表现出的抗氧化活性，这将对糖尿病的治疗产生更 为积极效果。
[0007] 值得注意的是多糖的分子量很可能对纳米硒-多糖复合体的理化性质有重要影 响。前期研宄发现梭柄松荀葫多糖中含有多个分子量组分，如果能以梭柄松荀葫多糖的不 同分子量组分作为模版，阐明多糖的分子量与纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的粒径之间 的相关性，必将为纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体以及其他纳米硒-多糖复合体的制备方 法提供新的思路和参考。
【发明内容】
[0008] 针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种以梭柄松苞 菇多糖作为分散剂，梭柄松苞菇醇提物作为还原剂的新型纳米硒-多糖制备方法，同时也 为糖尿病的治疗提供新的干预手段。
[0009] 本发明提供的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的新型制备方法，其特征在于，其 包括以下步骤：
[0010] (1)样品预处理：依次进行清洁、切块和冷冻干燥，获得含水量低于5%的新鲜梭 柄松荀葫样品；
[0011] (2)提取梭柄松苞菇多糖：依次将新鲜梭柄松苞菇样品进行粉碎、乙醇洗涤、水提 取、乙醇沉淀、去除蛋白质和去除小分子物质的处理，从而获得梭柄松苞菇多糖；
[0012] (3)制备还原剂：将梭柄松苞菇多糖提取过程中的乙醇洗涤液冷冻干燥，获得固 体粉末即为还原剂；
[0013] (4)制备纳米硒：利用制备好的还原齐U，将亚硒酸钠还原成单质硒；
[0014] (5)制备纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体：利用多糖游离的羟基，对纳米硒表面进 行修饰和包裹，形成稳定的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体。
[0015] 进一步，作为优选，本发明还包括测定纳米硒-梭柄松荀葫多糖复合体的抗糖尿 病氧化应激活性，其利用STZ诱导的糖尿病小鼠作为动物实验模型，评价糖尿病小鼠在服 用纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体后，对机体内的各生理指标的改善。
[0016] 进一步，作为优选，所述步骤（1)样品预处理的具体操作为：
[0017] (a)清洁：用特制塑料刮片将适量新鲜梭柄松苞菇表面的泥渍去除，且不可用水 清洗；
[0018] (b)切块：将清洁后的新鲜梭柄松苞菇切块，每一个梭柄松苞菇均分为四块；
[0019] (C)冷冻干燥：将梭柄松荀葫块放入冷冻干燥机，获得含水量低于5%的样品。
[0020] 进一步，作为优选，所述步骤（2)样品预处理的具体操作为：
[0021](a)、粉碎：将经预处理的梭柄松苞菇粉碎，过40目筛，即获得梭柄松苞菇粉末；
[0022] (b)、乙醇洗涤：将适量梭柄松苞菇粉末加入索氏提取装置，并按料液比1 : 10,加 入95%的乙醇，80°C水浴回流抽提2h后，将混合液加入离心管离心，离心转速为5000rpm， 离心时间为5min，将上清液干燥，所得粉末即为该反应的还原剂；
[0023] (c)水提取：将经乙醇洗涤后，离心管中的沉淀样品干燥，并按料液比1 : 20与蒸 馏水混合，超声波作用功率为150W，且使其每工作15min，暂停5min，提取温度80°C，提取时 间2. 5h，以上步骤重复提取三次，合并提取液即为梭柄松苞菇多糖提取液；
[0024] (d)乙醇沉淀：将多糖提取液利用旋转蒸发仪浓缩，加入5倍体积的95%乙醇溶 液，搅拌0. 5h后，置于4°C冰箱12h，再离心，离心转速为5000rpm，离心时间为5min，弃上清 液，收集沉淀，冻干待用；
[0025](e)去除蛋白质：按固液比I: 10加入蒸馏水溶解梭柄松苞菇粗多糖，随后加入 1/4倍体积的氯仿-正丁醇，充分振荡30min后，再离心，且离心转速为5000rpm，离心时间 为5min，获得三层液体，吸取最下层多糖溶液，重复该步骤5次；
[0026] (f)去除小分子物质：将去除蛋白质的粗多糖提物，加入截留分子量为5000的透 析袋中，流水过夜，以去除小分子物质，再利用旋转蒸发仪将该多糖提取液浓缩，并加入4 倍体积的95%乙醇溶液，搅拌0. 5h后，置于4°C冰箱12h，再离心，离心转速为5000rpm，离 心时间为5min，弃上清液，沉淀即为梭柄松苞菇多糖，冻干保藏于-80°C冰箱待用。
[0027] 进一步，作为优选，所述步骤（4)中制备纳米硒的具体操作为：
[0028] 将5mL亚硒酸钠溶液置于磁力搅拌器上，加入5mL超纯水，再分别缓慢滴加入5mL 不同浓度的梭柄松苞菇醇提物溶液及IOOmM的维生素C，常温反应24h后，将反应液置于透 析袋中处理，直至透析袋外没有亚硒酸钠被检测到，所得透析袋内样品即为纳米硒，其中， 检测透析袋外有无亚硒酸钠的方法是，取少量透析袋外液体，滴加维生素C后液体不变红， 则证明没有亚硒酸钠存在。
[0029] 进一步，作为优选，所述步骤（5)制备纳米硒-梭柄松荀葫多糖复合体的具体操作 为：
[0030] 将5mL亚硒酸钠溶液置于磁力搅拌器上，加入梭柄松苞菇多糖溶液，充分混匀后， 缓慢滴加入5mL的梭柄松苞菇醇提物，常温反应24h后，将反应液置于相应规格的透析袋 中处理，直至透析袋外没有亚硒酸钠和梭柄松苞菇多糖被检测到，所得透析袋内样品即为 纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体。
[0031] 此外，本发明还提供了一种对糖尿病氧化应激具有调节作用的多糖复合体，其特 征在于，该多糖复合体是采用上述方法制备的纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体。
[0032] 本发明的有益效果：
[0033] (1)利用梭柄松苞菇多糖提取过程中的废弃物（乙醇洗涤液）作为反应的还原剂， 不但实现了废弃物的再次利用，而且该新型还原剂相对于维生素C等传统还原剂，具有更 出色还原性能（纳米硒的粒径减小了 23. 8% );
[0034] (2)整个制备过程的反应条件温和，成本低廉，并且操作简单易于工业推广，所得 纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体的粒径仅为32. 7nm，并且在存放60天后依然可以保持在 62. 7nm，具有非常好的生物可利用性及稳定性；
[0035] (3)纳米硒-梭柄松苞菇多糖复合体中的梭柄松苞菇多糖和纳米硒能够协同促进 该复合体的抗氧化活性。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合实验对本发明做进一步说明。
[0037] 1?实验方案及结果
[0038] I. 1 样品
[0039] 当地市场购买的新鲜梭柄松苞菇
[0040] 1.2样品预处理
[0041] 1. 2. 1清洁：用特制塑料刮片将适量新鲜梭柄松苞菇表面的泥渍去除（如果用水 清洗，会造成表面多糖的损失）。
[0042] 1. 2. 2切块：将清洁后的新鲜梭柄