Hsp90抑制肽偶联物及其在肿瘤治疗中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤革El向治疗剂，具体涉及一种热休克蛋白90抑制狀偶联物在制备 治疗肿瘤的靶向治疗偶联物中的应用。
【背景技术】
[0002] 恶性肿瘤严重威胁人类的生命健康，改善当前肿瘤的治疗效果是医药工作者的一 项重要使命。临床使用的大部分化疗药物对肿瘤的靶向性较差，用药后并不是优先在肿瘤 病灶富集，肿瘤药物总量通常只占总给药剂量的5-10%。同时化疗药物的毒副作用常常限 制了化疗药物的最佳使用量，最终导致化疗不完全、早期复发和化疗耐药。
[0003]目前针对肿瘤细胞特有的突变信号通路的酪氨酸激酶抑制剂类在临床使用中获 得了巨大成功。对于突变型病人而言，这类药物不仅疗效好，而且毒副作用很小。然而这些 新型药物存在抑瘤谱窄、使用10-12月后出现耐药等不足。原癌信号通路之间存在多重平 行关系，很多情况下可以互相补偿、代替，因而简单阻断一条通路往往不足以危及癌细胞的 生存。为了弥补这种不足，人们开始着眼于这些通路的交汇点，希望以一种药物同时阻断多 条通路，提高药物的作用效果，改善药物的抑瘤谱和病人个体普适性，HSP90就是其中一种。
[0004] HSP90是广泛存在于真核细胞的一种分子伴侣，正常条件下主要协助细胞内新合 成的客户蛋白肽链（NascentpeptideofClientprotein)以正确折叠成具有各种生化功 能的酶、受体或信号因子等。在化疗药物作用下，肿瘤细胞启动保护性机制，其中包括快速 上调HSP90的表达。这种保护机制是构成肿瘤化疗逃逸及耐药的重要基础。肿瘤细胞的 HSP90表达水平普遍较正常细胞高2-10倍[1]，此外细胞膜上也有高丰度HSP90表达[2]。 现已知有数十种原癌信号蛋白属于HSP90的客户蛋白[3]，从而使HSP90成为一个重要的原 癌信号网络交汇点，对肿瘤细胞的HSP90分子伴侣功能进行抑制，就有可能同时促进多种 原癌蛋白质的降解。同样HSP90通过调控细胞自噬过程参与细胞对药物的应答，因而抑制 HSP90有望显著改善肿瘤治疗效果。
[0005] 如发明人在其发明专利（专利号：ZL201310258476.0;发明名称：一种肿瘤特异性 靶向肽及其应用）所述，利用噬菌体展示技术，筛选到与肺癌具有特异性结合的靶向肽（其 氨基酸序列为LPLTPLP，下文简称为P7)，并将该肿瘤特异性靶向肽与包载多西紫杉醇的生 物高分子材料聚乳酸连接，在制备肿瘤早期诊断和治疗试剂中的用途。在下文中，所述靶向 肽与包载多西紫杉醇的聚乳酸形成的偶联物又称为靶向肽的纳米制剂（TN-DTX)。
【发明内容】
[0006] 申请人提取了肿瘤细胞膜表面蛋白，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳回收蛋白并进行质 谱鉴定，经过质谱鉴定明确氨基酸序列为LPLTPLP的靶向肽（下文简称为靶向肽）的结合 位点蛋白为HSP90。通过蛋白印迹实验研宄了所述靶向肽对HSP90的表达影响。结果显示， 靶向肽作用于肿瘤细胞后，可以直接降低HSP90的表达。因此该靶向肽是一种HSP90的抑 制肽。
[0007] 如【背景技术】部分所述，HSP90在多种肿瘤细胞中高表达，有利于细胞对抗外界的温 度、药物及放射线刺激，在肿瘤复发和耐药过程中发挥重要作用。申请人对靶向肽联合多西 紫杉醇的作用进行了探讨。
[0008] 多西紫杉醇及靶向肽处理后，肿瘤细胞内自噬相关蛋白Beclin1及LC3的蛋白 表达水平发生变化。单独给予靶向肽不影响肿瘤细胞内自噬相关蛋白Beclin1及LC3的 蛋白表达。单独使用多西紫杉醇时，细胞内Beclin1表达水平明显升高，同时LC3-I型向 LC3-II型发生转变，表明细胞内自噬水平升高。当同时加入多西紫杉醇及靶向肽后，与单纯 使用多西紫杉醇相比较，自噬相关蛋白Beclin1表达水平明显下降，LC3-I型向LC3-II型 的转变也有所逆转，结果表明靶向肽能够显著抑制多西紫杉醇引起的肿瘤细胞自噬。
[0009] 由此可以看出，所述靶向肽不仅具有靶向作用，与多西紫杉醇联合使用时能够促 进肿瘤细胞由自噬向凋亡转变，从而提高对肿瘤细胞的杀伤作用。基于此，申请人将所述 靶向肽与多西紫杉醇偶联制备一种集成靶向递送、自噬抑制和肿瘤杀伤功能于一体的偶联 物，下文以DTX-P7表示。
[0010] 本发明通过在体实验显示，与常规制剂和基于该靶向肽制备的纳米制剂相比，所 述偶联物能够显著缩小肿瘤体积，对肺腺癌、乳腺癌、黑素瘤等细胞也有明显的杀伤作用。
[0011] 本发明提供了基于该HSP90抑制肽在制备细胞毒性剂偶联物方面的用途。本发明 所述的HSP90抑制肽能够特异性结合肿瘤细胞并抑制细胞内HSP90的表达。
[0012] 本发明还提供一种由HSP90抑制肽与细胞毒性剂通过接头连接形成的偶联物。优 选地，所述HSP90抑制肽的氨基酸序列为LPLTPLP，优选地所述HSP90抑制肽的氨基端连接 1-3个G，羧基端连接S、SH或SHS。优选地，所述细胞毒性剂选自多西紫杉醇、紫杉醇和阿 霉素。优选地，所述的接头具有如下所示的通式：-C〇-(CH2CH2)n-C〇-，其中n选自1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10,所述接头最优选为-CO-CH2CH2-CO-。
[0013] 本发明提供所述的HSP90抑制肽由接头通过酯化或酰胺化反应与细胞毒性剂如 多西紫杉醇，紫杉醇和阿霉素等制备偶联物，优选靶向肽的氨基端通过接头与多西紫杉醇 和紫杉醇的2-0H相连接，制备偶联物。
[0014] 在另一方面，本发明还提供所述的HSP90抑制肽氨基端通过接头与阿霉素的 10-来苏己吡喃基上的-3-NH2相连接所制备的偶联物。
[0015] 在另一方面，本发明还提供所述HSP90抑制肽氨基端通过接头与阿霉素的8-羟乙 醜基相连接，制备偶联物。
[0016] 本发明涉及以上述本发明偶联物作为活性成份的药物。通过将本发明偶联物与一 种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任 何剂型。本发明还涉及所述偶联物在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途。所述 肿瘤是HSP90高表达肿瘤，优选自肺癌、肺腺癌、黑色素瘤、胃癌、乳腺癌、肾癌、肝癌、口腔 表皮癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌和神经肿瘤，更优选为肺腺癌、乳腺癌和 黑色素瘤，进一步优选为肺腺癌。
[0017] 本发明偶联物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉 注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。
[0018] 给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂（包 括真溶液和胶体溶液）、乳剂（包括0/V型、《/〇型和复乳）、混悬剂、注射剂（包括水针剂、 粉针剂和输液）、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂（包括普通片、肠溶 片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片）、胶囊剂（包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊）、 颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气（粉）雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软 膏剂、凝胶剂、糊剂等。
[0019] 本发明偶联物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种 微粒给药系统。
[0020] 为了将本发明偶联物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀 释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳 糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙 醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶 浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡 波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维 素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙 烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂 酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
[0021] 还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双 层片和多层片。
[0022] 为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明偶联物与稀释剂、助流剂混 合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合 剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀 释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。
[0023] 为将本发明偶联物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物 作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、PH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶 剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-0-环糊精等；PH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、 氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干 粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。
[0024] 此外，如需要也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加 剂。
[0025] 为达到用药目的，本发明的药物可用任何公知的给药方法给药。
[0026] 本发明的偶联物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物