基于荧光碳纳米颗粒的可视化球形核酸及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种可视化球形核酸及其制备方法和应用，尤其涉及一种基于荧光碳纳米颗粒的可视化球形核酸及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]基因疗法已成为治疗癌症等具有挑战性疾病的一种新颖和强大的手法。有效的基因治疗很大程度上依赖于安全和高效的转染试剂。然而，治疗性的核酸(包括SiRNA和反义DNA)的递送仍然是基因调节和治疗主要难点。核酸递送载体，如阳离子高分子，脂质体和人工改造病毒，被用于核酸的输送，从而达到穿透胞膜和免于核酸酶降解的目的。这些载体存在很大的不足，比如不可降解性，严重的免疫原性或使用浓度的毒性，因此它们很难满足应用的要求(参考文献 1-Verma, 1.M.；Somia, N.Nature 1997，389，239-242 ;文献 2:Choi, C.H.；Hao, L.；Narayan, S.P.；Auyeung, E.；Mirkin, C.A.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2013，110，7625-7630)。
[0003]核酸在药物递送，基因治疗以及疾病诊断中应用广泛。在过去十年，球形核酸系统通常以金纳米颗粒为核心，表面覆盖核酸。与传统的方法相比，球形核酸在没有任何转染试剂的条件下，具有很高的细胞摄入率和转染效率。球形核酸由于其空间位阻结构，能有效地防止核酸酶的降解。它们还有免疫反应极小，毒性低和高效的基因调节能力等特性。这些优势都使球形核酸成为基因递送和基因治疗的理想体系(参考文献3:ffilliams, S.C.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2013，110，13231-13233 ;文献 4-Cutler, J.1.；Auyeung, E.；Mirkin, C.A.J.Am.Chem.Soc.2012，134，1376-1391 ;文献 5:Zheng, D.;Gil johann, D.A.；Chen, D.L.；Massich, M.D.；ffang, X.Q.；1rdanov, H.；Mirkin, C.A.；Paller, A.S.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2012，109，11975-11980)。
[0004]多功能化将更大程度地拓展球形核酸的应用范围，可视化是实现这一目标的重要一环。可视化的球形核酸，将有利于研宄其递送情况及诊断应用。纳米金用于球形核酸具有一些不利的因素:1)长期毒性不确定；2)暗场发光，标记物分辨率低。荧光半导体纳米晶体也常被用于球形核酸，但它们一般由毒性大的重金属作为核心，与生物功能材料的基本要求相悖(参考文献6:Rosi, N.L.；Gi I johann, D.A.；Thaxton, C.S.；Lytton-Jean, A.K.；Han, M.S.；Mirkin, C.A.Science 2006, 312, 1027-1030 ；文献 7:Gil johann, D.A.；Seferos, D.S.；Prigodich, A.E.；Patel, P.C.；Mirkin, C.A.J.Am.Chem.Soc.2009，131，2072-2073 ;文献 8:Young, K.L.；Scott, A.ff.；Hao, L.；Mirkin, S.E.；Liu, G.；Mirkin, C.A.Nano Lett.2012，12，3867-3871 ;文献 9:Bhunia, S.K.；Saha, A.；Maity, A.R.；Ray, S.C.；Jana, N.R.Sc1.Rep.2013, 3, 1473 ；文献 10:Boisselier, E.；Astruc, D.Chem.Soc.Rev.2009, 38, 1759-1782 ；文献 ll:Huang，X.；Zhang, F.；Zhu, L.；Choi, Κ.Y.；Guo, N.；Guo, J.；Tackett, K.；Anilkumar, P.；Liu, G.；Quan, Q.；Choi, H.S.；Niu, G.；Sun, Y.P.；Lee, S.;Chen, X.ACS Nano 2013,7,5684-5693)。
[0005]表面氨基化的荧光碳纳米技术:采用氨(胺)基类化合物，如壳聚糖，丝蛋白或碳水化物与聚醚酰亚胺混合物，在水热反应或微波反应的条件下，一步可形成荧光碳纳米颗粒(FCNs)。据文献报道，这些FCNs具有稳定的光致发光，较宽的激发光谱，可调的发射波长，并且具有良好的生物相容性。这些优势是传统的有机染料重金属核壳结构量子点无可比拟的(参考文献 12:Yang Y.；Cui J.；Zheng M.；Hu C.Jan S.；Xiao Y.；Yang Q.；Liu Y.Chem.Commun.2012, 48, 380-382.文献 13:Liu C., Zhang P., Zhai X., Tian F., Liff., Yang J., Liu Y., Wang H., Wang ff., Liu ff.B1materials 2012, 33(13):3604-13.文献14:ffu Z.L., Zhang P., Wang ff., Leng F., Gao Μ.X., Liu C.F., Huang C.Z.J.Mater.Chem.B,2013，1:2868 - 2873)。
[0006]FCNs在医学和生命科学的实践与研宄中发挥着越来越重要的作用。FCNs的最大优点是具备良好荧光特性，所以在生物检测方面具有一定的优势。但目前FCNs的应用范围比较有限，如何最大限度地拓展FCNs在生物医学中的应用成为一个非常有意义的课题。
【发明内容】
[0007]本发明提供了一种可视化球形核酸及其制备方法和应用，特别是一种基于荧光碳纳米颗粒的可视化球形核酸及其制备方法和应用。本发明中，在不需要任何其他转染试剂的情况下，该可视化球形核酸可高效地将核酸递送到细胞内，提高了细胞摄入率和转染效率，具有重要的应用价值。
[0008]为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案:
[0009]第一方面，本发明提供了一种可视化球形核酸，所述可视化球形核酸包括荧光碳纳米颗粒(FCNs)内核和结合在其表面的寡核苷酸。
[0010]本发明所述的可视化球形核酸是一种以荧光碳纳米颗粒(FCNs)为核，表面结合寡核苷酸的复合物。其中，FCNs可用于示踪球形核酸的递送情况，寡核苷酸进入细胞内释放出来，可调节目标基因的表达情况，引起相关的生物效应；另外，本发明利用碳纳米颗粒荧光性质稳定的特性，制备可用于监测的球形核酸系统，可根据实际情况选择合适发射波长的碳纳米颗粒作为球形核酸的核心。
[0011]本发明中，所述荧光碳纳米颗粒内核为表面氨基化的荧光碳纳米颗粒。
[0012]本发明中，对所述荧光碳纳米颗粒不作特别限定，例如可以是发蓝光的，也可以发绿光的，或者是发红光的，都可以应用于本发明。
[0013]本发明通过将荧光碳纳米颗粒进行表面氨基化，只需简单的一步反应法即可制备得到表面氨基化的荧光碳纳米颗粒，简化了球形核酸的复杂的合成过程。
[0014]优选地，所述焚光碳纳米颗粒的粒径小于20nm，例如可以是5nm、8nm、10nm、12nm、15nm、18nm、19nm。本发明的焚光碳纳米颗粒的粒径分布比较均勾，并且单分散性较好。
[0015]本发明中，所述寡核苷酸为巯基化修饰的核酸；优选地，所述寡核苷酸为SiRNA或反义DNA。
[0016]本发明提供的可视化的球形核酸体系，在不需任何其他转染试剂的情况下，可高效地将核酸递送到细胞内，并下调目标mRNA和蛋白的表达水平；在不需任何其他转染试剂的情况下，可高效地将核酸递送到肿瘤部位，并在肿瘤部位蓄积程度高，能够抑制肿瘤的增长。
[0017]第二方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的可视化球形核酸的制备方法，所述方法包括以下步骤:
[0018](I)制备荧光碳纳米颗粒；
[0019](2)将寡核苷酸进行巯基化修饰；
[0020](3)以步骤⑴得到的荧光碳纳米颗粒作为内核，表面结合步骤(2)的寡核苷酸，得到可视化球形核酸。
[0021]本发明中，步骤(I)所述制备荧光碳纳米颗粒包括:以氨基类化合物为原料，采用水热合成法得到荧光碳纳米颗粒。
[0022]优选地，所述氨基类化合物为碳水化合物与聚醚酰亚胺的混合物、壳聚糖或丝蛋白中的任意一种或至少两种的混合物，优选为壳聚糖。
[0023]本发明中，步骤(2)所述巯基化修饰采用过硫化钠、盐酸硫醇亚胺或硫代硫酸钠中的任意一种或至少两种的混合物进行，优选为盐酸硫醇亚胺。
[0024]作为优选的技术方案，所述的可视化球形核酸的制备方法包括以下步骤:
[0025](I)将壳聚糖加入到去离子水中，同时充分搅拌，然后置于密闭容器中反应，将所得产品溶液离心，然后用透析袋处理，除去小分子物质，得到的上清液即为荧光碳纳米颗粒；
[0026](2)将SiRNA或反义DNA进行巯基化修饰；
[0027](3)将步骤(I)的荧光碳纳米颗粒进行活化:采用偶联剂与荧光碳纳米颗粒震荡反应12h，超滤离心洗涤，除去未反应完的偶联剂，收集活化的荧光碳纳米颗粒；
[0028](4)将步骤⑵巯基化修饰的SiRNA或反义DNA进行激活:取50 μ L 0.1M的二硫苏糖醇，加入到50 μ g巯基化的SiRNA或反义DNA中，混匀后室温静置2h，除盐，纯化，收集样品；
[0029](5)将步骤(3)的荧光碳纳米颗粒与步骤⑷的巯基化SiRNA或反义DNA结合:将除盐处理后的巯基化siRNA或反义DNA与荧光碳纳米颗粒混合，在4h以上的时间内加入浓度为3M的NaCl至浓度为0.3M，震荡反应12h后，形成荧光的球形核酸，超滤离心，洗涤多次，收集产物。
[0030]第三方面，本发明还提供了如第一方面所述的可视化球形核酸在生物标记或药物递送中的应用。
[0031]与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果:
[0032](I)本发明提供的可视化的球形核酸体系，在不需任何其他转染试剂的情况下，可高效地将核酸递送到细胞内，并下调目标mRNA和蛋白的表达水平；在不需任何其他转染试剂的情况下，可高效地将核酸递送到肿瘤部位，并在肿瘤部位蓄积程度高，能够抑制肿瘤的增长；
[0033](2)本发明可操作性强，设备简单，成本低；分离提纯简单，重复性好，在一般实验室均能完成，易于规模化和推广；碳量子点表面性质可控，荧光性能