针对丙型肝炎病毒的嵌合疫苗抗原的制作方法

文档序号:8515282阅读:544来源:国知局
针对丙型肝炎病毒的嵌合疫苗抗原的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学和制药工业领域,特别地涉及针对丙型肝炎病毒(HCV)的嵌合抗 原和包含所述嵌合抗原的疫苗组合物的开发。在本发明中,使用最少数目的组分,因为所述 嵌合抗原能够诱导增强的且多样的针对HCV的抗原的免疫应答,这通过精确选择对于所述 抗原来说特异的区域和包括对于CD4+ T淋巴细胞来说特异的人工表位来实现。 现有技术
[0002] HCV 感染全世界人口 的大约 3% (Williams R·,H印atology, 2006, 44:521-526)。 大多数被感染的个体行进至慢性(Amoroso P等人,J Hepatol, 1998, 28:939-944)。 丙型肝炎是慢性肝损伤、肝硬化、肝功能衰竭和肝癌的主要原因之一(Hoofnagle JH.,H印atology,2002, 36(5Suppl I) :S21-S29)。目前,它在第一世界国家中是肝移植的主 要原因。另外,HCV感染与肝外表现(尤其是例如II型冷球蛋白血症、膜性增生性肾小球肾 炎、迟发性皮肤卟啉症)有关。不存在针对该病毒的预防性疫苗,并且在使用中的基于PEG 化的干扰素(IFN) +利巴韦林的组合的抗病毒治疗在少于50%的病例中是有效的。此外,这 些治疗引起多重不良事件(Ghany MG 等人,!fepatology, 2009, 49 (4) : 1335-74)。
[0003] HCV是属于黄病毒科丙型肝炎病毒属的一种病毒。它是有包膜的病毒,其病 毒颗粒具有50至70nm的大小,并且与极低密度脂蛋白(VLDL)相联合(Popescu Cl和 Dubuisson, J. Biol Cell, 2009, 102 (1):63-74)。病毒基因组为大约 9. 6kb 的正极性的单 链核糖核酸(RNA)。该基因组编码病毒多蛋白,其以共翻译和翻译后方式被加工成至少 10种病毒蛋白:核心、EU E2、p7(结构蛋白),和非结构蛋白NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、 NS5B (Bartenschlager R和 Lohmann V·,2000,J Gen Virol, 81:1631-48)〇
[0004] 对于获得针对HCV的有效疫苗,存在若干重大的障碍。该病原体是RNA病毒,其可 以快速突变以适应宿主环境。这对世界上鉴定出的多种病毒分离物的序列的高度多样性 做出了贡献。已描述了六种主要的基因型,其在核苷酸序列水平上可以达到相差直至30% (Simmonds P·,J Hepatol, 1999, 31Suppl 1:54-60)。最大的异质性存在于 HCV 的 E2 蛋白 的高变区中,其中恰好存在对于中和抗体的可能的靶表位。事实上,HCV作为异质的病毒分 子群体在生物体中循环,这是称为"准种"的现象(Simmonds P.,J Gen Virol, 2004, 85 (Pt 11) :3173-88)。已证明突变是一种对由宿主发展出的特异性免疫应答(体液的以及细胞 的)进行逃逸的方式。
[0005] 应当强调,HCV在具有免疫能力的个体中造成持续感染,尽管存在活跃的免疫应答 (Lechmann等人,Semin Liver Dis, 2000, 20, 211-226)。目前,已阐明了数种对于免疫系统 的病毒效应,其通过促进不相关的免疫应答的发展和阻止对于病毒去除来说真正有效的应 答的发展而有助于病毒的持续存在。无论在先天免疫中还是在获得性免疫中,均看到这些 效应(Grakoui A 等人,Science, 2003, 302 (5645) : 659-62)。存在这样的证据:针对 HCV 的 无效免疫应答不仅不能达到去除该病原体,而且还有助于肝损伤。
[0006] 迄今为止,还没有完全确定与针对HCV感染的保护或病毒澄清相关联的免疫学参 数。然而,估计针对各种不同病毒抗原的强力且持续的细胞免疫应答的诱导是特别重要的 (Lechmann 等人,Semin Liver Dis, 2000, 20, 211-226)。在被 HCV 慢性感染的个体中,对于 特异性T淋巴细胞的应答的影响是特别引人注意的。几种机制看起来对于该效应做出了贡 献,其中之一是调节性T细胞的作用。
[0007] 为了开发针对HCV的疫苗,已研宄了几乎所有的免疫接种策略。在这些策略中 强调了重组蛋白、合成肽、病毒样颗粒、裸脱氧核糖核酸(DNA)和重组病毒的使用。作 为针对HCV的疫苗候选物的靶标,已评价了所有的病毒抗原。大多数的疫苗候选物依 然集中于在动物模型中的免疫原性研宄的阶段,虽然目前几个候选物处于临床阶段,其 中经证明是安全的和具有免疫原性的,但还没有临床影响的证明(Alvarez-Lajonchere L,Duefias-Carrera S·,Int Rev Immunol, 2012, 31 (3) :223-42) 〇
[0008] 基于蛋白质亚基的疫苗的开发是对于HCV所评价的首要策略之一。所提出的基 于HCV的结构区域的抗原的策略中的一些已在动物模型中取得了有限的针对该病毒的 保护。用由El和Ε2蛋白形成的寡聚体进行免疫接种的黑猩猩的情况就是这样的。对 七只黑猩猩进行了疫苗接种,其中五只得到保护,和两只得病,但被治愈而未进展为慢性 期(Choo 等人,Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91,1294-1298)。已将所述保护作用与 能够抑制E2与人细胞结合的抗体(Ab)的存在相关联(Rosa等人,Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93, 1759-1763)。
[0009] 作为同源二聚体,纯化出了来自基因型Ib分离物的重组El蛋白(Maertens等 人,Acta Gastroenterol Belg, 2000, 63, 203)。两只被HCV慢性感染的黑猩猩接受9个剂 量的50 μ g重组El蛋白。该疫苗接种改善了肝组织学,招致了病毒抗原从肝脏中消失,和降 低了丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。尽管在血清中的病毒RNA水平在治疗期间未改变,但 在结束治疗后肝脏炎症和病毒抗原重新出现。观察到在高水平的针对El的抗体与肝损伤 的减少之间的联系(Maertens 等人,Acta Gastroenterol Belg, 2000, 63, 203)。甚至在人 中评价了在氧化铝中配制的HCV的El的蛋白变体。该疫苗候选物经证明是安全的和具有 免疫原性的,从而能够诱导抗体应答以及特异性的淋巴组织增生性应答(Nevens F.等人,H 印atology,2003, 38 (5) : 1289-96)。然而,该疫苗候选物的施用没有达到在临床上影响HCV感 染,因为未实现在患者中的病毒澄清,也未观察到肝脏疾病的显著改善。用完整的蛋白质亚 基进行免疫接种的分析研宄具有在某些情况下不诱导强烈的细胞应答的缺点。此外,该分 析研宄还冒这样的风险:包括了在以各种不同水平影响由该病原体诱导的抗-HCV免疫应 答的各种不同机制中所牵涉的区域(Grakoui A等人,Science, 2003, 302(5645) :659-62)。
[0010] 基于包含对于T淋巴细胞来说特异的HCV表位的合成肽的混合物的两个疫苗候选 物也已达到了在人中的临床评价阶段(Yutani等人,Cancer Sci, 2009, 100(10) :1935-42 ; Klade 等人,Gastroenterology, 2008, 134 (5) : 1385-95)。在被HCV 慢性感染的个体中,这两 个疫苗候选物都显示出诱导特异性免疫应答的能力,并且在迄今进行的I和II期临床研宄 中经证明具有很低的反应原性(Alvarez-Lajonchere L, Duefias-CarreraS.,Int Rev Immunol, 2012, 31 (3) : 223-42)。然而,它们还没有达到显著地影响患者的病毒载量,或者仅 暂时地影响。鉴于还没有证明它们能够改善患者的肝组织学参数,这些疫苗候选物的临床 影响还有待证实。在HCV的病毒多蛋白中的数种对于CD4+和CD8+T细胞的表位(其在病毒 澄清中可能是重要的)的鉴定支持了使用合成肽作为针对该病原体的疫苗候选物的策略。 包含核心、NS4和NS5的表位的各种不同的肽(单独的或脂质化的)已在小鼠中诱导了强 烈的细胞毒性T细胞类型的应答(Shirai等人,J Infect Dis, 1996, 173, 24-31 ;Hiranuma 等人,J Gen Virol, 1999, 80, 187-193 ;Oseroff 等人,Vaccine, 1998, 16, 823-833)。关于 肽疫苗分析研宄的主要障碍在于,没有辅助功能的那些肽可能是差的免疫原;此外,疫苗的 效力经常基于针对各种不同抗原的广谱的多价应答的诱导。由于包括在疫苗制备物中的肽 的数目增加,因而从所有观点来看,制剂的复杂性更高了。这些限制代表了该策略的弱点。
[0011] 另一方面,已经在针对HCV的疫苗的开发中评价了各种不同的重组病毒载 体。缺陷型重组腺病毒是具有吸引力的候选物,这归因于其趋肝性、其诱导体液免疫以 及细胞免疫的潜力以及通过肠胃外和口服途径进行施用的可能性。包含编码HCV的结 构蛋白的基因的重组腺病毒诱导针对这些蛋白质中的每一种的抗体应答(Makimura等 人,Vaccine, 1996, 14, 28-36)。此外,在用对于核心和El而言重组的腺病毒对小鼠进行 免疫接种后,检测到针对这些抗原的特异性的细胞毒性T细胞类型的应答(Bruna-Romero 等人,!fepatology,1997, 25, 470-477)。虽然这些结果是令人鼓舞的,但是一些关于在基 因疗法中使用重组腺病毒的问题使得对于其在人中的安全使用产生了疑问。目前,一种 基于重组腺病毒的疫苗候选物处于在人中的评价之中,该疫苗候选物逐渐表明是具有免 疫原性的,但没有经证实的临床影响(Barnes等人,Sci Transl Med, 2012, 4(115) : 115)。 包含HCV的各种不同基因的牛痘、金丝雀痘和禽痘类型的其他重组病毒的使用使得 能够在小鼠中诱导出强烈的细胞毒性和辅助性T细胞类型的应答(Shirai等人,J Virol, 1994, 68, 3334-3342 ;Large 等人,J Immunol, 1999, 162, 931-938)。特别地,已在人 中的临床研宄之中评价了对于HCV的非结构抗原NS3至NS5而言重组的经修饰的安卡拉痘 苗病毒变体(FourniIlier等人,Vaccine, 2007, 25(42) :7339-53)。在被HCV慢性感染的个 体中的I期临床研宄之中,该候选物经证明是具有免疫原性的,并且是被良好地耐受的。与 在基于肽的变化形式中同样地,仅在一部分已接种疫苗者中且暂时地观察到用该疫苗候选 物进行免疫接种对于病毒载量的影响。因此,同样地,临床影响有待证实。一般而言,基于 重组病毒的疫苗变化形式受到与其应用相关的安全性问题和规章制度的影响。
[0012] 为了可能开发出针对HCV的疫苗,已详尽地研宄了用DNA进行免疫接种。在 动物模型中的研宄已证明了该免疫接种策略诱导针对HCV的几乎所有抗原的特异性免 疫应答(体液的以及细胞的)的能力(Alvarez-Lajonchere L, Dliefias-Carrera S, Hu
当前第1页1 2 3 4 5 6 
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1