免疫调节性小细胞及使用方法

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免疫调节性小细胞及使用方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据35U.S.C. § 119(e)要求2012年10月2日递交的美国临时申请第 61/709102号的优先权,其通过引用整体明确地并入本文中。
[0003] 序列表引用
[0004] 本申请连同电子形式的序列表一起递交。序列表提供为2013年10月2日生成、 大小20Kb、标题SEQLISTING. TXT的文件。电子形式序列表的信息通过引用整体并入本文 中。
[0005] 发明背景
技术领域
[0006] 本申请涉及用于治疗疾病如膀胱癌和其他恶性肿瘤的免疫调节性真细菌小细胞 的组合物及制备、纯化、配制和使用方法。
[0007] 相关领域的描沐
[0008] 提供了本发明背景的以下描述以帮助理解本发明,但并非承认其描述或构成了本 发明的现有技术。本申请中提及或叙述的文章、专利和专利申请及所有其他文件和可电子 获取的信息的内容,均通过引用整体并入本文中,其程度就像明确和单独地指出通过引用 并入每个单独的出版物。申请人保留从任何这样的文章、专利、专利申请或其他文件实际并 入任何和所有材料和信息至本申请的权利。
[0009] 已熟知免疫系统在预防癌症中起重要作用。越来越清楚免疫调节可能是癌 症治疗的具吸引力的治疗方式。使用最久的市售抗癌免疫调节治疗剂为牛分枝杆菌 (Mycobacterial bovis)、卡介苗(BCG)的活的减毒菌株,其被用作非肌肉侵入性膀胱癌治 疗的术后辅助治疗。其他非市售实验性抗癌免疫调节方法包括使用细菌的其他活的减毒物 种,如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、双歧杆菌(Bifidobasterial)、单核细 胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、酿胺链球菌(Streptococcus pyrogenes)、 粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、诺维氏梭菌(Clostridium novyi)、猪霍乱沙门氏 菌(Salmonella choleraesius)和霍乱弧菌(Vibrio cholera)。虽然在某种程度上有效, 使用的每种菌株受到感染风险、害怕活的减毒菌株遗传回复至致病性以及败血症的限制。 所有这些方法均出现了在最有效剂量或接近最有效剂量时发生的具毒性活细菌感染的极 大毒性回复。这造成了每种菌株类型的较窄的治疗指数。
[0010] 为了解决活细菌作为免疫调节治疗的毒性问题,其他人已尝试使用不同的细菌组 分(与完整的活生物体相反)来产生相同的免疫效应。这种类型的实验性治疗剂包括:纯 化的细菌毒素、纯化的促炎性脂多糖(LPS)、纯化的磷壁酸(TCA)和其他细菌细胞壁制剂, 以及其他细菌亚细胞级分。这些方法改善了毒性特性,但在一些情况下伴随功效的损失。另 外,许多仅刺激极化免疫反应(Thl或Th2),大多数刺激Th2 (产生抗体的)反应。有文献 合理而充分记载的是,Thl (细胞免疫反应)反应看起来对具有抗肿瘤免疫调节效应是优先 的。最后,这些制剂可能很难以支持市场需求的规模和质量制备,并且最终仅可生成不能产 生抗肿瘤效应的免疫反应子集。在用于治疗大多数癌症的蛋白毒素的情况下,蛋白毒素的 功效由于对正常组织具有毒性而明显受限。另外,有助于系统性暴露水平的药物代谢动力 学(PK)参数,通常不被且不能被完全优化以同时最大化抗肿瘤活性和最小化副作用,特别 是当相同的细胞靶标或机制负责抗肿瘤活性和正常组织毒性时。再次地,这引起对大多数 蛋白毒素共有的非常窄的治疗指数。
[0011] 除了作为免疫调节"通用物"的活的细菌载体和细菌组分外,其他研宄者已尝试开 发不同的、特异性的Thl免疫调节性细胞因子和趋化因子作为抗癌治疗剂。实例包括但不 限于:干扰素 γ (IFN-Y)、干扰素 α (IFN-α)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)、月中 瘤坏死因子a (TNF- α )、白介素-2 (IL-2)、白介素-12 (IL-12)和白介素-18 (IL-18)。这些 方法中的每种受限于预期不到的和严重的毒性,以及在单独给药时具有很少或没有免疫治 疗益处。在某种程度上已清楚,单种细胞因子或趋化因子试剂并不引起具有抗癌效应所需 的完整Thl免疫反应谱,并且这些因子可能以随时间变化的不同水平一起发挥作用。用多 重产物制剂(formulation)来重演(recapitulate)和协调(orchestrate),这是近乎不可 能的免疫信号转导事件级联。大多数单种试剂细胞因子在临床上失败了,除了用于治疗慢 性肝炎C病毒感染的聚乙二醇化干扰素外。
[0012] 基于观察到的这些开发免疫调节性抗癌治疗剂的方法的限制,人们需要免疫调节 性治疗,其能够模拟活细菌感染而不引入感染和感染相关毒性的风险,同时仍然引起足以 赋予抗癌活性的有效和不同的免疫反应。
[0013] 发明概述
[0014] 一些实施方案公开了细菌小细胞,其包含胆固醇依赖性细胞溶素蛋白,其中所述 小细胞不显示抗体或包含抗体的Fc区的其他分子。
[0015] 在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素蛋白选自:李斯特菌溶素0、李斯特 菌溶素0 L461T、李斯特菌溶素0 E247M、李斯特菌溶素0 D320K、李斯特菌溶素0 E247M、 李斯特菌溶素0 D320K、李斯特菌溶素0 L461T、链球菌溶素0、链球菌溶素0 c、链球菌 溶素〇 e、球菌溶素(sphaericolysin)、炭疽杆菌溶素0(anthrolysin 0)、赌状芽孢杆 菌溶素(cereolysin)、苏云金芽孢杆菌溶素0(thuringiensilysin 0)、韦氏芽孢杆菌 溶素(weihenstephanensiIysin)、蜂房类芽胞杆菌溶素(alveolysin)、短芽孢杆菌溶 素(brevilysin)、丁酸芽孢梭菌溶素(butyriculysin)、破伤风溶素0、诺维氏芽孢梭 菌溶素(novyilysin)、凝集素溶素(lectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶素 (mitilysin)、假肺炎球菌溶素、猪链球菌溶素、中间链球菌溶素(intermedilysin)、伊氏李 斯特菌溶素(ivanolysin)、斯氏李斯特菌溶素0(seeligeriolysin 0)、阴道加德纳菌溶素 (vaginolysin)和化脓隐秘杆菌溶素(pyolysin)。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞 溶素蛋白为产气荚膜梭菌溶素〇(perfringolysin 0)。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细 胞溶素蛋白包含SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0016] 在一些实施方案中,小细胞还包含侵袭素。在一些实施方案中,小细胞不包含侵袭 素。
[0017] 在一些实施方案中,小细胞还包含Thl细胞因子。在一些实施方案中,Thl细胞因 子选自:IL-2、GMCSF、IL-12p40、IL-12p70、IL-18、TNF-a 和 IFN-γ。
[0018] 在一些实施方案中,小细胞还包含Th2细胞因子。在一些实施方案中,Th2细胞因 子选自:IL_1 α、IL-I β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-IO 和 IL-13。
[0019] 在一些实施方案中,小细胞还包含磷脂酶。在一些实施方案中,磷脂酶为PC-PLC 或PI-PLC。
[0020] 在一些实施方案中,小细胞包含蛋白毒素,其选自:白喉毒素的片段A/B、 白喉毒素的片段A、炭疽毒素 LF和EF、腺苷酸环化酶毒素、白树毒素、肉毒杆菌溶素 B (botulinolysin B)、肉毒杆菌溶素 E3、肉毒杆菌溶素 C、肉毒杆菌毒素、霍乱毒素、梭菌毒 素 A、B和α、蓖麻毒素、志贺A毒素、志贺样A毒素、霍乱A毒素、百日咳Sl毒素、假单胞菌 外毒素 Α、大肠杆菌热不稳定毒素(LTB)、蜂毒素、活化的半胱天冬酶、前半胱天冬酶、细胞 因子、趋化因子、细胞穿膜肽,以及以上物质的组合。
[0021] 在一些实施方案中,小细胞不包含任何其他的治疗活性部分。在一些实施方案中, 小细胞不包含治疗性小分子、任何其他的治疗性蛋白或治疗性核酸。在一些实施方案中,小 细胞不显示蛋白G或蛋白A的Fc结合部分。在一些实施方案中,小细胞不包含任何治疗性 核酸如siRNA。
[0022] 本文中公开的一些实施方案提供了产小细胞的细菌,其包含:编码产小细胞的基 因产物的可表达的基因,所述基因产物调节隔膜形成、二分裂和染色体分离中的一种或多 种;和能够功能性表达胆固醇依赖性细胞溶素蛋白的重组表达盒,其中所述细菌不显示抗 体或包含抗体的Fc区的其他分子,并且不显示蛋白G或蛋白A的Fc结合部分。
[0023] 在一些实施方案中,产小细胞的细菌还包含:编码异源核酸内切酶的可表达的"遗 传自杀"基因,其中所述产小细胞的细菌的染色体包含所述核酸内切酶的一个或多个识别 位点;确定的营养缺陷型;以及lpxM/msbB基因中的缺失或突变。
[0024] 在一些实施方案中,核酸内切酶选自:I-CeuI、PI-SceI、I-ChuI、I-CpaI、 I-SceIII、I-Crel、I-Msol、I-SceII、I-SceIV、I-CsmI、I-Dmol、I-PorI、PI-TliI、PI-TliII 和PI-ScpI。在一些实施方案中,营养缺陷型是由于必要代谢基因中的缺失或失活突变。 在一些实施方案中,编码产小细胞的基因产物的可表达的基因选自:ftsZ、sulA、ccdB和 sfiCo
[0025] 在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素蛋白选自:李斯特菌溶素0、李斯特菌 溶素0 L461T、李斯特菌溶素0 E247M、李斯特菌溶素0 D320K、李斯特菌溶素0 E247M、李 斯特菌溶素0 D320K、李斯特菌溶素0 L461T、链球菌溶素0、链球菌溶素0 c、链球菌溶素0 e、球菌溶素、炭疽杆菌溶素0、蜡状芽孢杆菌溶素、苏云金芽孢杆菌溶素0、韦氏芽孢杆菌溶 素、蜂房类芽胞杆菌溶素、短芽孢杆菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破伤风溶素0、诺维氏芽孢 梭菌溶素、凝集素溶素(lectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶素、假肺炎球菌溶素、 猪链球菌溶素、中间链球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素0、阴道加德纳菌溶 素和化脓隐秘杆菌溶素。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素蛋白为产气荚膜梭菌 溶素0。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素蛋白包含SEQ ID NO: 1。
[0026] 在一些实施方案中,小细胞还包含能够功能性表达侵袭素的重组表达盒。
[0027] 一些实施方案提供了治疗癌症的方法,包括向有需要的患者给予包含胆固醇依赖 性细胞溶素蛋白的细菌小细胞,其中所述给药诱导非免疫原性的抗肿瘤免疫调节效应。
[0028] 在一些实施方案中,小细胞不显示抗体或包含抗体的Fc区的其他分子。
[0029] 在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素蛋白选自:李斯特菌溶素0、李斯特菌 溶素 O L461T、李斯特菌溶素 O E247M、李斯特菌溶素 O D320K、李斯特菌溶素 O E247M、李 斯特菌溶素 O D320K、李斯特菌溶素 O L461T、链球菌溶素0、链球菌溶素 O c、链球菌溶素 O e、球菌溶素、炭疽杆菌溶素0、蜡状芽孢杆菌溶素、苏云金芽孢杆菌溶素0、韦氏芽孢杆菌溶 素、蜂房类芽胞杆菌溶素、短芽孢杆菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破伤风溶素0、诺维氏芽孢 梭菌溶素、凝集素溶素(lectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶素、假肺炎球菌溶素、 猪链球菌溶素、中间链球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素0、阴道加德纳菌溶 素和化脓隐秘杆菌溶素。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素蛋白为产气荚膜梭菌 溶素0。在一些实施方案中,胆固醇依赖性细胞溶素蛋白包含SEQ ID NO: 1。
[0030] 在一些实施方案中,小细胞还包含侵袭素。在一些实施方案中,小细胞不包含侵袭 素。
[0031] 在一些实施方案中,小细胞还包含Thl细胞因子。在一些实施方案中,Thl细胞因 子选自:IL-2、GMCSF、IL-12p40、IL-12p70、IL-18、TNF-a 和 IFN-γ。
[0032] 在一些实施方案中,小细胞还包含Th2细胞因子。在一些实施方案中,Th2细胞因 子选自:IL_1 a、IL-I β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10 和 IL-13。
[0033] 在一些实施方案中,小细胞还包含磷脂酶。在一些实施方案中,磷脂酶为PC-PLC 或PI-PLC。
[0034] 在一些实施方案中,所述方法还包括蛋白毒素,其选自:白喉毒素的片段Α/Β、白 喉毒素的片段Α、炭疽毒素 LF和EF、腺苷酸环化酶毒素、白树毒素、肉毒杆菌溶素 Β、肉毒杆 菌溶素 Ε3、肉毒杆菌溶素 C、肉毒杆菌毒素、霍乱毒素、梭菌毒素 Α、Β和a、蓖麻毒素、志贺A 毒素、志贺样A毒素、霍乱A毒素、百日咳Sl毒素、假单胞菌外毒素 A、大肠杆菌热不稳定毒 素(LTB)、蜂毒素、活化的半胱天冬酶、前半胱天冬酶、细胞因子、趋化因子、细胞穿膜肽,以 及以上物质的组合。
[0035] 在一些实施方案中,小细胞不包含任何其他的治疗活性部分。在一些实施方案中, 小细胞不包含治疗性小分子、任何其他的治疗性蛋白或治疗性核酸。在一些实施方案中,小 细胞不显示蛋白G或蛋白A的Fc结合部分。
[0036] 在一些实施方案中,癌症包括实体瘤、转移瘤或液体瘤。在一些实施方案中,癌症 为上皮、成纤维细胞、肌肉或骨起源的。在一些实施方案中,癌症选自:乳腺癌、肺癌、胰腺 癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、胃癌、肠癌、口腔癌、舌癌、咽癌、肝癌、肛门癌、直肠癌、结肠 癌、食管癌、胆囊癌、皮肤癌、子宫癌、阴道癌、阴莖癌和肾癌。在一些实施方案中,癌症为膀 胱癌。在一些实施方案中,癌症选自:腺癌、肉瘤、纤维肉瘤和眼癌、脑癌和骨癌。在一些实 施方案中,癌症选自:非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、 慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病和慢性髓性白血病。
[0037] 在一些实施方案中,给药产生Thl优势免疫反应。在一些实施方案中,给药产生 Th2优势免疫反应。
【附图说明】
[0038] 图1的柱状图显示,乳酸脱氢酶(LDH)释放测定的结果指示了 PFO介导的哺乳动 物细胞膜渗透。
[0039] 图2的图显示了相对于小细胞递送的等量产气荚膜梭菌溶素 O(PFO),纯化的重组 产气荚膜梭菌溶素 O(BTX-IOO)的体外细胞毒性。
[0040] 图3的图显示,靶向部分侵袭素的去除对包含PFO的小细胞的抗肿瘤活性没有影 响。
[0041] 图4描述的相片和图表显示了在肺和卵巢转移中VAX-Iro小细胞的相似的抗肿瘤 效应。
[0042] 图5的柱状图显示,静脉内给药后在小鼠的肺而非卵巢中可检测到vAx-iro小细 胞。
[0043] 图6的柱状图显示,VAX-Iro小细胞在严重免疫缺陷的NIH-III小鼠中具有很少 的抗肿瘤效应。
[0044] 图7的图显示,VAX-IP小细胞在建立的非肌肉侵入性膀胱癌MB49鼠模型中高度 有效。
[0045] 图8是构建产VAX-IP小细胞的菌株及来源于其的VAX-IP小细胞的总体方案示意 图。
[0046] 图9是pVX-336的质粒图。
[0047] 图10是pVX-128的质粒图。
[0048] 图11显示了可诱导的小细胞形成的扫描电子显微照片。
[0049] 图12示出了显示VAX-IP小细胞中侵袭素和产气荚膜梭菌溶素 O的表达的照片和 图表。
[0050] 发明详述
[0051] 定义
[0052] 如本文所用,术语"Thl免疫调节性小细胞"是指能够刺激Thl免疫反应的小细胞。
[0053] 如本文所用,术语"Th2免疫调节性小细胞"是指能够刺激Th2免疫反应的小细胞。
[0054] 如本文所用,术语"Thl/Th2免疫调节性小细胞"是指能够刺激Thl和Th2免疫反 应的小细胞。
[0055] 如本文所用,术语"重组侵入性免疫调节性小细胞"是指经遗传改造而表达和显示 能够刺激内化至真核细胞的异源小细胞表面蛋白的小细胞。
[0056] 如本文所用,术语"天然侵入性的免疫调节性小细胞"是指这样的小细胞,其从正 常侵入性的细菌制备而来,使得所述小细胞表达和显示天然存在的能够刺激内化至真核细 胞的小细胞表面蛋白。
[0057] 如本文所用,术语"免疫原性的"是指通过适应性免疫机制介导的抗原特异性的体 液或细胞免疫反应。免疫原性的小细胞指导免疫反应响应特定和具体的抗原,并且可用于 例如使用免疫原性的小细胞作为病原体特异性疫苗的环境中。
[0058] 如本文所用,术语"免疫调节"是指以所需的形式(包括但不限于产生Thl和Th2 免疫反应)总体调节(即,非免疫原性本身)免疫反应。
[0059] 如本文所用,术语"免疫治疗"是指使用免疫调节化合物如免疫调节性小细胞,产 生针对消除或减缓疾病特别是癌症的进展具有有益效果的总体(即,非免疫原性本身)免 疫反应。
[0060] 如本文所用,术语"粘附小细胞"是指能够结合和粘附至非组成性吞噬真核细胞表 面而不显著刺激所述小细胞的内吞的小细胞。
[0061] 如本文所用,术语"粘膜-粘附小细胞"是指能够结合和粘附至粘膜表面的小细 胞。
[0062] 如本文所用,术语"VAX-P小细胞"是指表达和包含产气荚膜梭菌溶素 O (PFO)的小 细胞。
[0063] 如本文所用,术语"VAX-IP小细胞"是指表达和显示来自假结核耶尔森菌 (Yersinia pseudotuberculosis)的泛β?-整合素革E向细胞表面分子侵袭素及其任何功 能等同物的小细胞,其中所述小细胞还包含产气荚膜梭菌溶素 O(PFO)。
[0064] 如本文所用,术语"VAX-IPT小细胞"是指表达和显示来自假结核耶尔森菌的泛 β 1-整合素靶向细胞表面分子侵袭素及其任何功能等同物的小细胞,其中所述小细胞还包 含产气荚膜梭菌溶素 O(PFO)和蛋白毒素。
[0065] 如本文所用,术语"VAX-IPP小细胞"是指表达和显示来自假结核耶尔森菌的泛 β 1-整合素靶向细胞表面分子侵袭素及其任何功能等同物的小细胞,其中所述小细胞包含 产气荚膜梭菌溶素 O(PFO)和除蛋白毒素外的外源性多肽。
[0066] 如本文所用,术语"VAX-iro小细胞"是指表达和显示来自假结核耶尔森菌的泛 β 1-整合素靶向细胞表面分子侵袭素及其任何功能等同物的小细胞,其中所述小细胞包含 产气荚膜梭菌溶素 O(PFO)和白喉毒素的催化片段。
[0067] 如本文所用,术语"VAX-IPG小细胞"是指表达和显示来自假结核耶尔森菌的泛 β 1-整合素靶向细胞表面分子侵袭素及其任何功能等同物的小细胞,其中所述小细胞包含 产气荚膜梭菌溶素 O(PFO)和白树毒素。
[0068] 如本文所用,术语"VAX-IPPA小细胞"是指表达和显示来自假结核耶尔森菌的泛 β 1-整合素靶向细胞表面分子侵袭素及其任何功能等同物的小细胞,其中所述小细胞包含 产气荚膜梭菌溶素 O(PFO)和假单胞菌外毒素 Α。
[0069] 如本文所用,术语"VAX-IPR小细胞"是指表达和显示来自假结核耶尔森菌的泛 β 1-整合素靶向细胞表面分子侵袭素及其任何功能等同物的小细胞,其中所述小细胞包含 产气荚膜梭菌溶素 O(PFO)和蓖麻毒素 Α。
[0070] 如本文所用,术语"成孔细胞溶素蛋白"和术语"胆固醇依赖性细胞溶素蛋白"可 互换使用,并且是指这样的蛋白,其能够攻击包含胆固醇的细胞膜而在膜上形成孔。对于一 些胆固醇依赖性细胞溶素蛋白,细胞膜中胆固醇的存在并非胆固醇依赖性细胞溶素蛋白结 合细胞膜所需要。例如,胆固醇依赖性细胞溶素蛋白可以为革兰氏阳性细菌分泌的β-桶 成孔外毒素的家族成员。胆固醇依赖性细胞溶素蛋白的非限制性实例包括:李斯特菌溶素 0、李斯特菌溶素0 L461T、李斯特菌溶素0 Ε247Μ、李斯特菌溶素0 D320K、李斯特菌溶素0 Ε247Μ、李斯特菌溶素0 D320K、李斯特菌溶素0 L461T、链球菌溶素0、链球菌溶素0 c、链球 菌溶素〇 e、球菌溶素、炭疽杆菌溶素0、蜡状芽孢杆菌溶素、苏云金芽孢杆菌溶素0、韦氏芽 孢杆菌溶素、蜂房类芽胞杆菌溶素、短芽孢杆菌溶素、丁酸芽孢梭菌溶素、破伤风溶素0、诺 维氏芽孢梭菌溶素、凝集素溶素(Iectinolysin)、肺炎球菌溶素、缓症链球菌溶素、假肺炎 球菌溶素、猪链球菌溶素、中间链球菌溶素、伊氏李斯特菌溶素、斯氏李斯特菌溶素0、阴道 加德纳菌溶素、化脓隐秘杆菌溶素和产气荚膜梭菌溶素0。在一些实施方案中,胆固醇依赖 性细胞溶素蛋白包含ECTGLAWEffffR(SEQ ID NO: 1)所示的氨基酸序列。在一些实施方案中, 胆固醇依赖性细胞溶素蛋白包含WEWWRT(SEQ ID N0:2)所示的氨基酸序列。
[0071] 如本文所用,术语"治疗性核酸"是指当被引入真核生物体(例如,哺乳动物如人) 时具有治疗效应的核酸分子。治疗性核酸可为例如ssDNA、dsDNA、SSRNA(包括ShRNA)、 dsRNA (包括siRNA)、tRNA(包括稀有密码子使用tRNA)、mRNA、微小RNA(miRNA)、核糖体 RNA(rRNA)、肽核酸(PNA)、DNA = RNA杂
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