一种具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于临床医学、生物医学与再生医学领域，具体涉及一种具有抗凝血性能 的去细胞化肝脏生物支架及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 肝脏是人体十分重要的器官，被誉为人体的"解毒工厂、代谢化工厂"，但当其受到 病毒、酒精、药物等多种因素严重侵害时，会造成肝细胞大量坏死，导致肝脏功能衰竭。迄今 为止，受到供体器官短缺、手术过程繁复等特征制约的肝脏移植是临床上唯一有效的根治 肝脏功能衰竭的方法。组织工程肝脏作为肝脏移植的潜在替代治疗手段，正在逐渐受到重 视。其中，肝脏支架材料的质量是制备组织工程肝脏的核心要素之一。
[0003] 去细胞化肝脏生物支架，具有与原肝脏相同的基质成分（如胶原、纤连蛋白、弹力 蛋白等）和三维立体微结构，同时含有丰富的细胞因子和生长因子，是一种优秀的天然生 物支架材料，与人工合成材料相比具有明显优势，是构建具有临床应用前景的理想肝脏支 架材料来源。目前制备去细胞化肝脏生物支架的文献，大多是灌注肝脏直接去细胞化即可， 以获得完整的细胞外支架网络。然而，单纯去细胞化的去细胞化肝脏生物支架血液相容性 较差，在临床治疗中容易形成血栓。
[0004] 通过对去细胞化肝脏支架进行灌注抗凝修饰，可以提高去细胞化肝脏生物支架的 血液相容性，但是由于去细胞化肝脏支架的三维结构和血管网络非常复杂，要制备得到的 抗凝能力强、支架各个部分抗凝效果均一、而且抗凝时间长的去细胞化支架材料非常难，已 有的修饰方法复杂、制备成本高，而且抗凝血效果还不理想。
[0005] 如，公开号为101850136的专利申请公开了层层自组装修饰猪肝去细胞化支架材 料，以提高抗凝性能的方法，但是其需要用两种溶液和一种洗涤液分别交替灌注八次，在交 替灌注过程中容易在灌注液中混入气泡，特别是对于大器官（如猪肝，猪肾）在高流速灌注 时，溶液交替过程中很容易混入气泡，导致灌注修饰过程失败；同时，修饰后肝素含量最多 只能达到12 μ g/mg组织干重，抗凝效果不佳，且修饰后肝素与材料是依靠静电力结合，结 合不够牢固，释放速度快，24小时释放量达到50%以上，无法长期抗凝。
[0006] 另外，Chen-Chi Tsai etal. "Effects of heparin immobilization on the surface characteristics of a biological tissue^fixed with a naturally occurring crosslinkingagent (genipin) : an in vitro study''，Biomaterials 22 (2001) 523-533、孙 赳等，"肝素末端结合修饰猪肝去细胞化支架材料的抗凝性能研宄"生物医学工程与临床 2014年5月第18卷第3期、吴琼等"肝素层层自组装修饰猪肝去细胞化支架材料的抗凝血 性能研宄"，北京：中国科技论文在线，2014-3-19等许多文献均提供了对肝脏切片进行肝素 化修饰的方法，具体是将肝脏切片浸泡在肝素溶液中进行修饰，但是由于去细胞化肝脏支 架的三维结构和血管网络非常复杂，简单浸泡根本无法达到目的。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种制备过程简单、成本低廉的具有抗凝血性能的去细胞 化肝脏生物支架及其制备方法。
[0008] 本发明提供了一种具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的制备方法，它包括 如下步骤：
[0009] (a)取去细胞化肝脏生物支架，用含有肝素和/或肝素盐的溶液灌注，灌注的速度 是80-150mL/min，灌注的时间是5-12小时；
[0010] (b)灭菌，即可。
[0011] 去细胞化肝脏生物支架，是通过去细胞化技术建立的完整保留肝脏三维结构和脉 管系统的肝脏生物支架。
[0012] 优选地，步骤a)中，所述去细胞化肝脏生物支架是用1% TritonX-IOO溶液和1% SDS溶液去细胞化处理得到的去细胞化肝脏生物支架。进一步优选地，所述去细胞化肝脏生 物支架按照如下方法制备：取离体肝脏，用1%的Triton X-100溶液以200mL/min流速灌 注3h，再用1 % SDS溶液以200mL/min流速灌注6h，最后用1 % Triton X-100溶液和去离 子水灌洗去除残留SDS，获得去细胞化猪肝脏生物支架。
[0013] 优选地，步骤（a)中，所述含有肝素和/或肝素盐的溶液中，肝素或肝素钠的浓度 为1-3. 3g/L。进一步优选地，所述含有肝素和/或肝素盐的溶液中，肝素或肝素钠的浓度为 3. 3g/L〇
[0014] 优选地，所述含有肝素和/或肝素盐的溶液中还含有亚硝酸钠、NaBH3CN和NaCl， 它们的浓度依次为亚硝酸钠33mg/L、NaBH 3CN 10mg/L、NaCl 0.15mol/L。
[0015] NaBH3CN :氰基硼氢化钠。
[0016] 优选地，步骤（a)中，所述灌注为循环灌注。
[0017] 循环灌注：是从肝门静脉灌流进入的灌流液从肝上下腔流出后，又继续从肝门静 脉灌流进入，循环使用。
[0018] 优选地，步骤（a)中，所述灌注的速度为100mL/min，灌注的时间为5-8小时。进一 步优选地，所述灌注的速度为100mL/min，灌注的时间为6小时。
[0019] 优选地，步骤（a)中，灌注时，环境温度为室温。
[0020] 室温：指 15 ~25 °C。
[0021] 优选地，步骤（b)中，所述灭菌采用含有抗生素的PBS溶液灌注，所述抗生素为青 霉素/链霉素、氟康唑或甲硝唑。其中，所述灌注的速度为100-300mL/min，灌注的时间为 6-24小时。优选地，所述灌注的速度为200mL/min，灌注的时间为6小时。所述含有抗生素 的PBS溶液是含有青霉素/链霉素的PBS溶液，其中，青霉素的终效价为100U/mL，链霉素的 终浓度为100 μ g/mL。
[0022] 本发明还提供了前述任意一项方法制备的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物 支架。
[0023] 本发明方法制备简便、成本低廉，不仅可以用于猪肝脏，而且可以适用于各种与猪 肝脏规格相近的大型动物肝脏，如人、猴、狗的肝脏，具有应用的广泛性。
[0024] 本发明提供的制备具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架的方法，抗凝修饰过 程中只使用一种灌流液，修饰过程的操作简化，无交替灌流过程，避免了在气泡问题；修饰 后肝素含量高，最高能达到20 μ g/mg组织干重；修饰后去细胞化肝脏生物支架表面均匀肝 素化，支架各个部分的抗凝作用均一；并且末端修饰后，肝素与材料是形成共价结合，结合 牢固，释放速度缓慢，24小时释放量仅为20%左右，利于长期抗凝。
[0025] 本发明方法制备得到的具有抗凝血性能的去细胞化肝脏生物支架，保持了去细胞 化肝脏生物支架上特定的微结构，具有抗凝血性能强、免疫原性低等特点，对种植于其上的 细胞的生存、分化和增殖等起到了极为重要的支撑作用，能够用于体内组织重建，为构建具 有临床应用价值的异源性组织工程化生物抗凝支架提供了一种方便廉价的来源。
[0026] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0027] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0028] 图1未去细胞化猪肝（图1A)和去细胞化猪肝支架（图1B)的HE染色结果。
[0029] 图2未去细胞化猪肝（1、3、5、7、9和11泳道）和去细胞化猪肝支架（2、4、6、8、10 和12泳道）样品DNA经过聚合酶链式反应扩增出的猪特异性DNA片段电泳结果。
[0030] 图3未修饰的去细胞化猪肝支架（图3A)和经过肝素化全肝修饰的去细胞化支架 (图3C)的甲苯胺蓝染色结果和未修饰的去细胞化猪肝支架（图3B)和经过肝素化全肝修 饰的去细胞化支架（图3D)的扫描电镜结果。
[0031] 图4猪肝支架各部位的肝素定量实验结果。
[0032] 图5三种肝素化修饰材料中的肝素定量试验结果（图5A)和肝素释放量结果（图 5B和图5C)。
[0033] 图6肝素化修饰的三种凝血检测指标结果。
[0034] 图7三种肝素化修饰方法在猪体内进行血液灌注实验照片（图7A、图7B和图7C) 和HE染色结果（图7D)。
[0035] 图8大鼠原代肝细胞（图8A和图8B)和人脐带血静脉细胞（图8C和图8D)种植 在肝素化修饰材料表面的HE染色结果和免疫组化PCNA染色结果。
【具体实施方式】
[0036] 下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。
[0037] 本发明所用的实验试剂与仪器如下：
[0038] 实验用巴马香猪由四川大学华西医院实验动