一种siRNA抑制至少一种基因在受试 者眼睛脉络膜中的表达。在某些实施例中，至少一种目标眼部mRNA列于表A3,如任一 SEQ ID N0:l-2、3、5、6-7、8-10、12、13、24-25、26-27、30-35、45-53 所述。在某些优选实施例中， siRNA靶向CTSD、RTP801和BNIP3。在某些优选实施例中，所述眼部障碍是DR，siRNA靶向 SEQ ID NO:48-53 所述的 mRNA。
[0046] 在一个进一步的实施例中，所述眼部障碍是视网膜色素变性（RP)。因此，本发明 提供了一种减弱目标眼部mRNA在患有RP的受试者眼睛中表达的方法。所述方法包括局 部（无创伤性）地向受试者眼睛表面施用受试者眼睛目标基因的治疗有效量的至少一种 siRNA。在某些优选实施例中，siRNA是化学修饰的。在某些实施例中，至少一种目标基因 (目标眼部mRNA)的减弱表达是有效治疗RP的方法。在某些实施例中，至少一种目标眼部 mRNA的减弱表达对减轻RP症状有效。在某些实施例中，至少一种目标眼部mRNA是选自表 A4所列基因的基因产物，其被转录为任一 SEQ ID N0:3、14、26-35、54-57所述的mRNA。在 一些实施例中，目标眼部 mRNA 是选自由 CASPl、CASP3、CASP12、RTP801、RTP801L、CAPNSl、 PARP1、AIF、N0S1、N0S2、XIAP和SHCl-SHC组成的组的基因产物。在某些优选实施例中， siRNA 靶向 SEQ ID NO: 56-57 所述的 mRNA。
[0047] 在不同实施例中，至少一种siRNA是化学修饰的。在不同实施例中，至少一种 siRNA包括足够数量的具有与目标mRNA中的核苷酸序列具有充分同源性的连续核苷酸序 列，以与mRNA杂交，并减弱mRNA在受试者眼睛中的表达。
[0048] 在不同实施例中，至少一种siRNA包括包括足够数量的具有与基因中的核苷酸序 列具有充分同源性的连续核苷酸序列，以与该基因杂交，并降低或抑制基因在受试者眼睛 中的表达。
[0049] 附图简要说明
[0050] 图1A-1B :表示施用滴眼剂后注入小鼠视网膜的Cy3标记DDIT4siRNA的典型图 像。图IC :在E. D.给药后4小时的视网膜的共聚焦显微镜图像，给药（上X40,下X60)。在 左（Cy3)和右（合并）小图中RGC的Cy3染色是显著的。
[0051] 图2A-2C :表示施用滴眼剂后注入小鼠泪腺导管及腺泡细胞的Cy3标记DDIT4 siRNA的典型图像。图2D :代表的Cy3标记的siRNA DDIT4纳入小鼠泪腺导管及腺泡细胞 的图像。E.D.后4小时，泪腺的共聚焦显微镜图像（X60)。
[0052] 图3A-3C :表示施用滴眼剂1-4小时后小鼠脉络膜的Cy3_siRNA累积随时间的变 化。
[0053] 图4 :表示向眼睛施用滴眼剂1小时后传输到小梁网和睫状体的Cy3_siRNA。
[0054] 图5A-5B :表示施用p53基因靶向QM5 - siRNA的滴眼剂1小时后的视网膜共聚焦 显微镜图像（倍数X60)。视网膜的siRNA(视网膜色素上皮细胞，视网膜神经节细胞）通过 Cy3荧光显示。
[0055] 图6A-6B:表示注入小鼠视网膜的Cy3标记DDIT4 siRNA的典型图像。图6B表示 施用滴眼剂1小时后DDIT4_1 Cy3-siRNA的累积。感光细胞的脉络膜、外核层、RPE和外节 层显示了 Cy3染色。
[0056] 图7显示了施用滴眼剂1小时后RGC细胞通过使用Dy_649/C6染色的DDIT4_1 Dy-649/C6-siRNA 累积。
[0057] 图 8A-8C 表示对照 siRNA FITC-CNL_1RD/CNL_1FD 和不规则的 3' cy3-CNL_l RGC 通过不同染色方法传输到视网膜组织。
[0058] 图9A-9B表示Casp2的不同结构传输到小鼠视网膜组织。
[0059] 图 10A-10B 表示 TGASEII-FAM 和 HN0EL-FAM 的传输。
[0060] 图11表示PBS中作为阳性对照组的p53靶向siRNA的视网膜传输。
[0061] 图12A-12B表示正常动物或施用不含有siRNA的ED后视网膜中无荧光信号。
[0062] 图13A-13D提供了显示视网膜中p53抑制的实验结果。图13A-13B显示了测量 P53蛋白水平的标准曲线。图13C-13D显示了通过滴眼剂实现的视网膜p53抑制。
[0063] 发明详述
[0064] 本发明提供了局部寡核苷酸组合物及其用于治疗各种眼部疾病及障碍的无创伤 性方法。特别地，本发明提供了与患有该疾病或障碍的受试者眼睛基因表达相关的不同眼 部疾病及障碍的治疗方法。
[0065] 本发明部分是基于siRNA组合物靶向某些眼部组织和细胞类型的局部无创伤性 给药的意外发现，并当局部传输至眼睛表面时在那些组织和细胞中很活跃。考虑到已知 siRNA的传输障碍以及提供无创伤性方法作为玻璃体或全身传输的现实选择，这一发现是 令人惊讶的。
[0066] 对于有效沉默目标基因的mRNA的siRNA分子，所述siRNA需要三个层次的目标： 目标组织、目标细胞的类型和目标亚细胞室。现在本发明公开了治疗眼部疾病和障碍的无 创伤性方法。
[0067] 本发明通常涉及下调基因在眼部细胞中表达的化合物，特别涉及新的小干扰 RNA(SiRNA)，以及这些新的siRNAs在治疗受试者患有与眼部组织和细胞中基因表达相关 的疾病的用途。
[0068] 对减弱眼部目标mRNA表达的方法及治疗眼部障碍的方法在此进行了详细谈论， 任何所述分子和/或组合物可有益地用于治疗患有所述疾病的受试者。
[0069] 本发明的siRNA具有可能增加活性、增加稳定性或减少毒性的结构和修饰；对本 发明siRNAs的新修饰可以有益地应用到用于防止或减弱目标基因表达的双链RNA序列中， 特别是此处讨论的目标基因。
[0070] 每一个指示目标基因的非限制性实例，已详列于表A1-A4,见下文。
[0071] 表Al :治疗青光眼的目标基因
[0072]
【主权项】
1. 一种抑制受试者视网膜神经节细胞缺失的方法，包括无创伤性地向受试者眼睛表面 施用眼科组合物，所述眼科组合包含治疗有效量的至少一种siRNA，所述SiRNA下调与视网 膜神经节细胞缺失相关的目标基因表达，从而抑制所述受试者视网膜神经节细胞的缺失。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述目标基因如SEQ ID N0:l-58任一所述。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述受试者是人类。
4. 根据权利要求1至3任一所述的方法，其中所述受试者是患有眼部疾病、眼部障碍或 眼部损伤、或存在发展眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤的风险。
5. 根据权利要求1至4任一所述的方法，其中所述视网膜神经节细胞的缺失与受试者 的眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤有关。
6. 根据权利要求4或5所述的方法，其中所述眼部疾病、眼部障碍或眼部损伤包括神经 变性。
7. 根据权利要求1至6任一所述的方法，其中所述眼科组合物被配制为霜、泡沫、膏、软 膏、乳剂、液体溶液、滴眼剂、凝胶、喷雾、悬浮液、微乳液、微球、微囊剂、纳米球、纳米粒子、 脂质囊泡、脂质体、聚合物囊泡、眼罩或隐形眼镜。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述眼科组合物被配制为滴眼剂。
9. 根据权利要求4至8任一所述的方法，其中所述疾病、障碍或损伤是选自由青光眼、 干眼症、糖尿病视网膜病变（DR)、糖尿病性黄斑水肿（DME)、老年性黄斑变性（AMD)、视神经 炎、视网膜中央静脉阻塞、视网膜分枝静脉阻塞、缺血性视神经病变、视神经损伤、早产儿视 网膜病变（ROP)或色素性视网膜炎（RP)、视网膜神经节细胞变性、黄斑变性、遗传性视神经 病变、代谢性视神经病变，以及由于毒剂或药物不良反应或维生素缺乏症引起的神经病变 组成的组。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述疾病、障碍或损伤是青光眼，所述目标基因 如 SEQ ID NO: 1-35 任一所述。
【专利摘要】本发明涉及一种抑制受试者视网膜神经节细胞缺失的组合物和方法，包括向受试者眼睛表面局部无创伤性地向受试者眼睛表面施用眼科组合物，所述眼科组合包含治疗有效量的至少一种siRNA；所述siRNA下调与视网膜神经节细胞缺失相关的目标基因表达，从而抑制受试者视网膜神经节细胞的缺失。本发明的方法还涉及一种具有结构基序的化学修饰siRNA化合物的用途，所述结构基序下调在哺乳动物眼睛视网膜组织表达的人类基因的表达。
【IPC分类】A61K48-00, A61P9-10, A61P27-02, A61P27-06, A61P25-00
【公开号】CN104857526
【申请号】CN201510090523
【发明人】E·法因施泰因, E·艾伯特, I·梅特, A·巴-伊兰, I·斯皮瓦克, H·卡林斯基, N·斯拉格尔
【申请人】夸克制药公司
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2009年10月22日