用于稳定蛋白质和Fc结构域融合的融合蛋白的组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于稳定生理活性的蛋白质和Fe结构域的融合蛋白的组合物， 更具体地说，涉及一种使用含有铵盐或铵盐和琥珀酸盐组合的组合物，稳定蛋白质和Fe结 构域的融合蛋白的方法。
【背景技术】
[0002] 用于治疗疾病目的的抗体药物是应用了先进的生物过程技术，包括细胞系开发技 术、细胞培养技术和纯化技术的生物药。随着这些抗体药物被证明比现有药物具有优异的 疗效和安全性，对此的需求日益增多。例如，已将通过将人P75的人肿瘤坏死因子受体融 合到人IgGl的Fe结构域的胞外配体结合部分而制备的融合蛋白（TNFR:Fe ;依那西普）用 作治疗类风湿性关节炎的药剂。此外，为了提高生理活性物质的体内的半衰期，试图使用 GLP-IR 激动剂和 Fe 结构域的融合蛋白（US2004-0558627 ;Chung, H. S. et al.，Regulatory p印tide，170, 2011)开发糖尿病治疗剂。另外，试图将诸如hGH或EPO的生理活性物质融 合到Fe结构域以增加生理活性物质的体内半衰期（KR10-2008-7018012)。近年来，VEGF受 体和Fe结构域的融合蛋白（afIibercept)已被批准并用作治疗湿性年龄相关性黄斑变性 (WAMD)的药剂。
[0003] 然而，如上所述的融合蛋白的问题在于，它们具有大且复杂的结构并且物理上不 稳定，因此导致聚集。各种导致这样的聚集的因素都存在于生产和存储蛋白质的过程。
[0004] 例如，聚集可以由以下一种或多种因素引起。在纯化期间，并非最佳的PH、盐的种 类、盐浓度、温度、与空气接触、搅拌速度等都会引起聚集，而在配制过程中，蛋白质的浓度 条件会引起聚集。在缓冲液交换期间，通过过滤膜、搅拌等会引起聚集，而在存储过程中，温 度变化、PH变化、与空气接触、搅拌等会引起聚集。另外，当含有蛋白质的制剂暴露于光时， 也会发生聚集，并且材料封装也会引起聚集（Hamada，H.et al.，Current Pharmaceutical Biotechnology, 10:400, 2009) 〇
[0005] 当抗体蛋白的疏水区由于其结构变化而被暴露时，在缓冲液中发生融合蛋白 的最大聚集。换句话说，蛋白质分子的疏水区被集合在一起形成聚集，并且这种聚集由 于抗体蛋白质之间的共价键也可能以不可逆的方式发生（Hamada，H.et al. ,Current Pharmaceutical Biotechnology, 10:348, 2009)〇
[0006] 因上述原因而聚集的融合蛋白或抗体蛋白随着时间的流逝而具有降低的活性或 失去活性。此外，当这些蛋白质聚集时，它们具有不会出现在非聚集状态下的抗原性，因 此当被注入人体时，会导致抗毒抗体（ADA)的产生。因此，目前迫切需要一种用于减少融 合蛋白的聚集的方法和稳定的制剂，其包含展现出降低的聚集水平的融合蛋白（Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Biotechnology:Phar maceutical Aspects Volume XI，2010,pp 271-291)。
[0007] 为了这个目的，尝试了加入防止聚集或控制pH的赋形剂或者加入缓冲液组合物 的方法。在抗体蛋白的疏水基团暴露于蛋白质分子的表面并相互结合而引起聚集的情况 下，使用能够稳定暴露的疏水基团的赋形剂来防止聚集。例如，报道了使用氨基酸如精氨 酸、赖氨酸、脯氨酸、组氨酸和甘氨酸（US 4362661A和US 7648702)，聚山梨醇酯系表面活 性剂，两亲性聚合物如聚乙二醇（PEG)或聚乙烯吡咯烷酮（PVP)，多糖如葡聚糖，或单糖或 二糖如蔗糖、麦芽糖或海藻糖（US 5945098A)。
[0008] 然而，蛋白质和Fc结构域的融合蛋白比通常生产的抗体蛋白质的稳定性要差，并 且因此相比其它蛋白质或抗体显示出更强的形成聚集的趋势。有这样一个实例，其中向蛋 白质-Fc结构域融合蛋白中加入表面活性剂如聚山梨醇酯来制备制剂，以防止融合蛋白的 聚集（Steven J. Shire et al.，Biotechnology:Pharmaceutical Aspects, Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, XI:115,2010)〇
[0009] 因此，本发明人发现，含有铵盐或铵盐和琥珀酸盐组合的组合物可以通过抑制融 合蛋白的聚集来增加蛋白质和Fc结构域的融合蛋白的稳定性，使其能够很容易地保存很 长的一段时间，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0010] 本发明的一个目的是提供一种用于稳定化的组合物和使用该组合物稳定蛋白 质-Fc结构域融合蛋白的方法，所述组合物可以通过抑制生理活性的蛋白质和Fc结构域的 融合蛋白的聚集，增加该融合蛋白的稳定性。
[0011] 本发明的另一个目的是提供一种用于预防和治疗疾病的组合物，该组合物包含所 述用于稳定化的组合物。
[0012] 为了达到上述目的，在一个方面，本发明提供了一种用于稳定蛋白质-Fc结构域 融合蛋白的组合物，其含有铵盐或铵盐和琥珀酸盐的组合，以及一种用于预防和治疗疾病 的组合物，其包括所述用于稳定所述融合蛋白的组合物。
[0013] 在另一个方面，本发明提供了一种用于稳定蛋白质-Fc结构域融合蛋白的方法， 其将铵盐或铵盐和琥珀酸盐的组合添加到含有所述融合蛋白的组合物中。
【附图说明】
[0014] 图1示出测量在50°C将依那西普（TNF受体的水溶性部分和Fc结构域的融合蛋 白）在含有各种赋形剂（精氨酸（Arg)、EDTA、甘氨酸（Gly)、组氨酸（His)、羟丙基环糊精 (HP环糊精）、氯化铵、聚乙二醇（PEG)、脯氨酸（Pro)、蔗糖、海藻糖和聚山梨醇酯20)的制 剂溶液中存储1周后，依那西普的聚集度的结果。
[0015] 图2示出测量在50°C将依那西普在含有各种赋形剂（精氨酸（Arg)、脯氨酸 (Pro)、50mM氯化铵、IOOmM氯化铵、200mM氯化铵、蔗糖、聚山梨醇酯20和羟丙基环糊精 (HPcD))的制剂溶液中存储1周后，依那西普的聚集度的结果。
[0016] 图3示出测量在37°C将依那西普在含氯化铵的制剂溶液中存储4周后，依那西普 的聚集度的结果。
[0017] Arg :精氨酸；AmCl :氯化按；AmSul :硫酸按；
[0018] Am+Lys :氯化铵 + 赖氨酸；Am+EDTA :氯化铵 +EDTA ;
[0019] Am+Polysorabate 20 :氯化按 + 聚山梨醇醋 20 ;
[0020] Am+Suc :氯化按+鹿糖。
[0021] 图4和图5示出测量在45°C将依那西普在含有精氨酸、氯化铵、硫酸铵、氯化铵+ 赖氨酸、氯化铵+EDTA、氯化铵+聚山梨醇酯20、和氯化铵+蔗糖的制剂溶液中存储14天后， 依那西普的聚集度的结果。
[0022] Arg :精氨酸；AmCl# :氯化按 ;
[0023] AmSul :硫酸按；Am#+Lys :氯化按#% +赖氨酸；
[0024] Am#+Suc :氯化按 #% + 鹿糖。
[0025] 图6示出测量在45°C将依那西普在含有氯化铵的各种缓冲液（磷酸钠、琥珀酸钠、 柠檬酸钠和组氨酸）中存储5天后，依那西普的聚集度的结果。
[0026] 图7示出测量在45°C将依那西普在不同pH的含有氯化铵的琥珀酸钠缓冲液组合 物中存储5天后，依那西普的聚集度的结果。
[0027] 图8示出测量在45°C将依那西普在含有氯化铵和赖氨酸的琥珀酸钠缓冲液组合 物中存储14天后，依那西普的聚集度的结果。Enbrel :市售的依那西普（Enbrel)制剂；
[0028] AmCl :氯化铵；AmCl+Lys :氯化铵+赖氨酸。
【具体实施方式】
[0029] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普 通技术人员的通常理解相同的含义。通常，本文中使用的命名法和将在下面描述的实验方 法是本领域公知且通常采用的。
[0030] 如本文所使用，"蛋白质和Fc结构域的融合蛋白"、"蛋白质-Fc结构域融合蛋白" 是指这样的融合蛋白，其包含融合至作为抗体恒定区的Fc结构域的蛋白，其中蛋白质意指 由数个氨基酸组成的通过肽键形成的氨基酸聚合物。另外，多肽与具有低分子量的寡肽和 具有高分子量的蛋白质具有相同的含义。因此，如本文所使用，"蛋白质和Fc结构域的融合 蛋白"与"多肽和Fc结构域的融合蛋白"具有相同